Введение к работе
Актуальность темы исследования
Одной из актуальных проблем современной микробиологии является этиологическая расшифровка острых кишечных инфекций с учетом возрастающей роли «нетрадиционных» возбудителей, ранее считавшихся безопасными. Среди них всё большее значение в последние годы приобретают криптоспоридии - простейшие, поражающие эпителий желудочно-кишечного тракта и желчных протоков человека с развитием диареи. Попадая в организм человека, ооцисты криптоспоридий нарушают микроэкологическое равновесие кишечника и вызывают дисбаланс микробной флоры, которая является важным показателем резистентности организма к возникновению различных инфекционных заболеваний (Воеводин Д.А., 2001; Бондаренко В.М., 2007; Волжанин В.М., 2008). Разнообразные нарушения микробиоценоза кишечника при диарейных состояниях у больных, выделяющих криптоспоридии, могут служить пусковым механизмом возникновения и в дальнейшем поддержания патологических процессов (Романова Т.В., 1992; Грачёва Н.М., 2004). В связи с этим, определение состояния микрофлоры кишечника является актуальным для больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий.
Ранее считалось, что криптоспоридии являются причиной диарей при различных иммунодефицитных состояниях, в основном при СПИДе. Однако в настоящее время установлено, что криптоспоридии поражают человека и без выраженных иммунологических расстройств, особенно детей младшего возраста (Лысенко А.Я., 1996; Покровский В.И., 2006). Учитывая ухудшающуюся экологическую ситуацию, качественную недостаточность питания, водоснабжения, применение антибиотиков, иммунодепрессантов, рост вторичных иммунодефицитов среди населения, необходимо углубленное изучение состояния микрофлоры кишечника и распространённости криптоспоридиоза при развитии диарейных состояний.
Клиническая диагностика криптоспоридиоза сложна из-за неспецифического характера симптомов заболевания. Решающее значение для подтверждения диагноза этой инвазии имеет лабораторная диагностика, позволяющая обнаружить возбудителя в клиническом материале от больных (фекалии, рвотные массы, желчь, мокрота и др.). Диагностика криптоспоридиоза у больных диареями неустановленной этиологии в основном базируется на обнаружении ооцист криптоспоридий в фекалиях при микроскопических исследованиях (Бейер Т.В., 1987; Чистенко Г.Н., 1993; Грачёва Н.М., 2004) и нуждается в модернизации.
При лечении больных криптоспоридиозом применение противопротозойных препаратов малоэффективно. Данные литературы по лечению, особенно средне-тяжелых и тяжелых форм криптоспоридиоза, различными антибактериальными средствами также говорят об отсутствии выраженной эффективности (Якубовский М.В., 1994; Tilbert D.N.,2000). В последние годы согласно рекомендациям ВОЗ назначалось лечение мономицином (паромомицином). Однако, эти препараты обладают высокой токсичностью и не применяются в педиатрии. В то же время имеются экспериментальные исследования, свидетельствующие об антагонистической активности лактобацилл в отношении криптоспоридий, что позволяет включать в комплекс лечения пробиотические препараты, содержащие лактобактерии (Alak J.I.B., 1997; Грачёва Н.М., 2004; Cama V.A., 2007).
Все вышесказанное обуславливает актуальность научных исследований, направленных на определение особенностей состояния микробиоценоза кишечника у больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий и усовершенствование лабораторного обследования больных с диареями неустановленной этиологии.
Степень её разработанности
По данным ВОЗ в зарубежных странах в этиологической структуре ОКИ криптоспоридиоз является широко распространённой инфекцией и занимает 3-5 место, уступая лишь таким заболеваниям, как шигеллёз, сальмонеллёз, кампилобактериоз и ротавирусная инфекция (Покровский В.И. и др., 2003; Alves M., 2006; Cama V.A. 2007).
В России сведения о криптоспоридиозе пока немногочисленны и противоречивы. Учет и регистрация заболеваемости не проводится. Распространение криптоспоридий среди больных диареями неустановленной этиологии изучено мало (Романова Т.В., 1992; Дехнич А.В., 2001; Лысенко А.Я. и др., 2002; Волжанин В.М., 2008).
Целью исследования является определение особенностей микробиоценоза кишечника у больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, усовершенствование методов лабораторной диагностики, микробиологический контроль лечения лактосодержащими пробиотическими препаратами.
Задачи исследования:
1. Выявить распространение ооцист криптоспоридий у взрослых и детей больных диареями неустановленной этиологии.
2. Определить качественный и количественный состав микробиоценоза кишечника у наблюдавшихся больных, выделяющих ооцисты криптоспоридий.
3. Провести микробиологический контроль за состоянием микробиоценоза кишечника у больных диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, до и после проведения лечения пробиотическими препаратами.
4. Дать сравнительную оценку двух методов выявления криптоспоридий: микроскопического и иммунохроматографического.
Научная новизна
Впервые дана оценка изменений микробиоценоза кишечника у больных диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, указывающая на глубокие нарушения микрофлоры кишечника при криптоспоридиозе.
Получены новые данные о распространении криптоспоридий среди взрослых и детей, больных диареями неустановленной этиологии, свидетельствующие об их возрастающей роли в этиологии острых кишечных инфекций.
Впервые проведён микробиологический контроль за состоянием микробиоценоза кишечника и частотой выделения ооцист криптоспоридий у больных до и после назначения пробиотических лактосодержащих препаратов, показавших улучшение состояния микрофлоры кишечника и санацию организма от ооцист криптоспоридий.
Для повышения эффективности выявления ооцист криптоспоридий, помимо классического микроскопического метода мазков из фекалий установлена целесообразность использования иммунохроматографического теста.
Теоретическая и практическая значимость работы
Доказана значимость нарушений состояния микробиоценоза кишечника при криптоспоридиозе и научно обоснована тактика лабораторного обследования и лечения больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий.
Полученные результаты о высокой распространенности криптоспоридий у больных с диареями неустановленной этиологии свидетельствуют о необходимости обследования этой группы больных на криптоспоридиоз.
Выявленная положительная тенденция к нормализации показателей микробиоценоза кишечника и санация от криптоспоридий у больных с диареями неустановленной этиологии на фоне применения лактосодержащих пробиотических препаратов обосновывает целесообразность включения их в комплекс лечебных мероприятий.
Микроскопическое исследование колонобиоптатов на обнаружение криптоспоридий при назначении по медицинским показаниям ректороманоскопии будет способствовать уточнению диагноза и расшифровке патогенеза заболевания.
Применение иммунохроматографического теста для выявления криптоспоридий позволит осуществлять экспресс-диагностику криптоспоридиоза у больных с диареями неустановленной этиологии и проводить исследование при отсутствии специализированной лаборатории.
По материалам работы издано пособие для врачей «Диагностика, клиника, лечение и особенности распространения криптоспоридиоза», Москва, 2004 г. (Утверждено председателем секции Учёного совета МЗ РФ по эпидемиологии, инфекционным заболеваниям, вирусологии В.И. Покровским протокол № 5 от 02.12.2004года).
Результаты проведенных исследований нашли применение в лекционном цикле и практических занятиях на курсах повышения квалификации для врачей-бактериологов «Актуальные вопросы современной медицинской микробиологии», проводимых на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора (2005; 2006; 2009; 2010 гг.), а также в научно-практической работе лаборатории микробиологии и профилактики кишечных инфекций ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора и инфекционной клинической больницы №1
г. Москвы.
Методология и методы исследования
Результаты диссертационной работы основаны на клинико-лабораторном обследовании 405 больных диареями неустановленной этиологии в период 2002- 2012 гг. Среди обследованных больных - взрослые, госпитализированные в инфекционное отделение ИКБ №1, - 219 человек; дети, находящиеся в отделении детских инфекционных болезней, – 106 человек; дети, амбулаторно наблюдавшиеся в КДЦ ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, – 80 человек (таблица 1).
В работе использовали комплексные бактериологические, микробиологические, биохимические и иммунохроматографические методы исследования.
Комплексное обследование взрослых больных проводили совместно с врачами-инфекционистами клинического отдела МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора (руководитель - Заслуженный деятель науки РФ, д.м.н., профессор Н.М.Грачева); детей - с врачами-инфекционистами детского инфекционного отделения МОНИКИ им. Владимирского (руководитель - д.м.н., профессор Л.В.Феклисова); при участии к.м.н., в.н.с. Т.В.Продеус (институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Марциновского Первого МГМУ им. И.М.Сеченова Минздрава РФ).
Таблица 1. Характеристика обследованных больных и объём проведённых исследований.
Микробиологические методы исследования
Изучение микрофлоры кишечника проводили культуральным, биохимическим и микроскопическим методами согласно методическим рекомендациям «Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника» (Москва, 1986 г.) и оценивали по отраслевому стандарту ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (2004г.)
Исследуемый материал в соответствующих разведениях высевали на диагностические среды для выявления и идентификации аэробных и анаэробных бактерий и грибов. Для выделения патогенных и условно-патогенных энтеробактерий использовали плотные питательные среды Плоскирева, Левина, Эндо (НПО «Микроген»), желточно-солевой агар для стафилококков («Диакон»); жидкие среды обогащения Мюллера, селенитовую, магниевую («НИЦФ») с последующим высевом на плотные среды. Основой для кровяного агара служил питательный агар для культивирования микроорганизмов (ГРМ) с добавлением 5 % бараньей крови. Для выделения и культивирования бифидобактерий использовали полужидкую печеночную среду Блаурокк («ГНЦПМБ»), для лактобацилл - жидкую среду МРС («Диакон»). Биохимическую индикацию энтеробактерий проводили на питательных средах фирмы «Диакон». Дрожжеподобные грибы рода Candida выделяли на среде Сабуро («Himedia», Индия).
При исследовании микрофлоры кишечника определяли количество бифидо- и лактобактерий, кишечной палочки с нормальной и сниженной ферментативной активностью, энтерококков, стафилококков, гемолизирующей кишечной палочки, условно-патогенных лактозонегативных энтеробактерий (клебсиелла, протей, энтеробактер, цитробактер и др. ), грибов рода Candida.
Для обнаружения ооцист криптоспоридий в фекалиях больного использовали метод модифицированного окрашивания кислотоустойчивых организмов карболфуксином по Цилю-Нильсену. Окрашенные мазки фекалий исследовали с помощью масляной иммерсионной системы микроскопа с увеличением не менее 1000х (рисунок 1). Ооцисты криптоспоридий также выявляли в мазках из колонобиоптатов при их окраске по модифицированному методу Циля-Нильсена и просматривали в световом микроскопе при объективе 90 и окуляре 7 (рисунок 2). Исследования проводили согласно методическому пособию для врачей "Диагностика, клиника, лечение и особенности распространения криптоспоридиоза" (2004г.).
Иммунохроматографический метод исследования
Использовали стандартную тест-систему RIDAQUICK Cryptosporidium (Германия) для иммунохроматографического анализа, согласно инструкции производителя. RIDAQuick Cryptosporidium является одностадийным иммунохроматографическим тестом, основанным на латекс-агглютинации.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. На основании проведенных лабораторных исследований у больных диареями неустановленной этиологии выявлено широкое распространение ооцист криптоспоридий.
2. Выраженные изменения микробиоциноза кишечника, обнаруженные у всех обследованных больных с диареями неустановленной этиологии, выделяющих ооцисты криптоспоридий, обосновывают включение в схему лечения различных лактосодержащих пробиотических препаратов, что обеспечивает положительный эффект в плане восстановления микрофлоры кишечника и санации организма от ооцист криптоспоридий.
3. Помимо стандартного микроскопического метода обнаружения ооцист криптоспоридий в мазках из фекалий целесообразно использование иммунохроматографического метода.
Степень достоверности и апробация результатов
О достоверности полученных результатов свидетельствует значительное количество исследований, проведённых с помощью комплексных микробиологических, биохимических и иммунохроматографических методов с использованием поверенного, сертифицированного оборудования и адекватных методик статистической обработки результатов.
Диссертация апробирована на заседании секции «Эпидемиология, микробиология, клиника инфекционных заболеваний» Учёного совета ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, протокол №1 от 28.03.2013г.
Основные положения и полученные результаты исследования представлены и обсуждены на: Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы эпидемиологии на современном этапе» (13-14 октября 2011 г., Москва); Х Всероссийском научно-практическом обществе эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (12-13 апреля 2012 г., Москва); научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты инфекционной патологии» (21-22 сентября 2012 г., Иркутск).
По теме диссертационной работы опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 - в рецензируемых изданиях, 4 работы – в материалах конференций, 1- пособие для врачей, 1- раздел в руководстве по медицинской микробиологии.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, перспективы дальнейшей разработки темы, список литературы. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 27 рисунками. Список литературы включает 204 источника, в том числе 111- отечественных и 93 - зарубежных авторов.
