Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Классификация и таксономия бактероидов . 11
ГЛАВА 2. Культивирование бактероидов 20
2.1. Способы создания анаэробных условий 20
2.2. Методы культивирования бактероидов 23
2.3. Газовая атмосфера и питательные среды . 27
ГЛАВА 3. Бактероиды в нормальной микрофлоре кишечника человека и животных 31
3.1. Количественный и видовой состав бактероидов кишечной микрофлоры человека и животных . 31
3.2. Взаимовлияние макроорганизма и бактероидов кишечной микрофлоры 37
ГЛАВА 4. Бактероидная инфекция 40
4.1. Бактероиды как этиологические агенты пригнойно-воспалительной патологии человека 40
4.2. Отдельные заболевания,вызываемые бактероидами 43
4.3. Чувствительность бактероидов к антибактериальным препаратам . 46
4.4. Методы определения чувствительности бактероидов к антибактериальным препаратам 51
4.5. Моделирование бактероид ной инфекции на животных 53
ГЛАВА 5. Материалы исследования 60
ГЛАВА 6. Методы исследования 63
6.1. Культивирование и идентификация бактероидов . 63
6.I.I. Установка для культивирования анаэробных микроорганизмов 64
6.1.2. Питательные среды 75
6.1.3. Состав питательных сред и реактивов 79
6.1.4. Идентификация анаэробных грамотрицательных. не спорообразующих палочек , 83
6.2. Определение чувствительности бактероидов к. антибактериальным препаратам 89
6.3. Количественное исследование кишечной микрофлоры 92
6.4. Исследование клинического материала 94
6.5. Сравнительное изучение вирулентности двух видов бактероидов 96
ГЛАВА 7. Количественная и видовая характеристика бактероидов нормальной микрофлоры толстого кишечника человека и некоторых видов лабораторных животных 103
7.1. Общая количественная характеристика микрофлоры толстого кишечника человека и некоторых видов лабораторных животных ЮЗ
7.2. Видовой состав и биохимические свойства бактероидов нормальной микрофлоры толстого кишечника человека.и.некоторых, видов.лабораторных животных 106
ГЛАВА 8. Бактероиды как условно-патогенные микроорганизмы. при гнойно-воспалительных заболеваниях человека 131
8.1. Частота выделения и видовой состав бактероидов при гнойно-воспалительных заболеваниях человека 131
8.2. Чувствительность клинических штаммов.бактероидов к антибактериальным препаратам 141
ГЛАВА 9. Изучение вирулентности Bacteroides fraqilis Й Bacteroides vulgatus в Эксперименте На мышэх 146
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 163
ВЫВОДЫ 179
ПРИЛОЖЕНИЕ . 182
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
- Классификация и таксономия бактероидов .
- Способы создания анаэробных условий
- Количественный и видовой состав бактероидов кишечной микрофлоры человека и животных
- Бактероиды как этиологические агенты пригнойно-воспалительной патологии человека
- Материалы исследования
Классификация и таксономия бактероидов
Первое описание бактероидов принадлежит Veiiion и Zuber которые в 1898 г. выделили Bacteroides fragilis, как они назвали данный микроорганизм, из гноя при аппендиците (E.p.Cato, J.L. Johnson, 1976). фузобактерии впервые были описаны Miller в 1883 г., который наблюдал их в мазках из патологического материала от больного с язвенным стоматитом (s,H.Pinegold,i9771)«
Вслед за первыми сообщениями появились работы, в которых также описывались анаэробные грамотрицательные палочки, микро-скопируемые и выделяемые при различных воспалительных процессах, а также из кишечной микрофлоры здоровых людей (М.Юнгано, А.Дис-тазо,1912; S.M.Finegoid/W?.,). По мере накопления сведений об анаэробных неспорообразующих микроорганизмах возникла необходимость в их классификации.
Родовое название Bacteroides было введено в 1919 г, Caseiiani и Chalmers для анаэробных палочек, не образующих эндоспор и растущих на средах без образования пигмента. Первоначально в этот род были включены как грамположительные, так и грамотрицательные палочки (B.Aalbacfcv 1973).
Родовое название Fusiformis было предложено Holling в 1910 г. для палочковидных микроорганизмов с заостренными концами" (B.Aalback, 1973).
Род Bacteroides и род Fusiformis были внесены в первое издание определителя Берджи (B.Aalback,1973). Род Bacteroides был помещен В семейство Bacteriaceae, а род Pusiformis в семейство Mycobacteriaceae. Часть анаэробных грамотрицатель-ных неспорообразующих- палочек, имеющих небольшие размеры, была отнесена к роду Dialister, который был помещен в семейство Bacteriaceae (І.М.Горовиц-Власова,І933).
В 1923 г. "Кпог отклонил род "Fusiform!в И предложил для всех анаэробных грамотрицательных палочек с заостренными концами род Pusobacterium (B.Aalback,1973; B.P.Langworth, 1977). Это изменение в таксономии было зафиксировано в 5-ом издании определителя Бердаи (D.H.Bergey et al.,; 1939-). Предложение об исключении грамположительных микроорганизмов из рода Bacteroides, внесенное в 1937 г. J.E.Weiss и L.F.Rettger, также нашло отражение в 5-6м издании определителя Берцжи (T.E.Roy, C.D.Kelly,4939). В этом издании род Pusobacterium был так же, как и род Bacteroides, помещен в семейство Bacteriaceae (D.H. Bergey et al., 19392), а род Dialister - в триб Hemophileae семейства larvobacteriaceae (D.H.Bergey et al., 19393), хотя в примечании к разделу, касающемуся рода Bacteroides, отмечена вероятность СВЯЗИ родов Bacteroides, Pusobacterium И Dialister (I.E.Roy, C.D.Kelly І 1939).
В 6-ом издании определителя Берджи род Bacteroides и род Pusobacterium уже были объединены в триб Bacteroideae, помещенный в семейство Barvobacteriaceae (R.S.Breed et al.,1 1948..). Род Dialister не изменил своего положения в систематике бактерий (R.S.Breed et al., 1948g).
В 7-ом издании определителя Берджи анаэробные грамотрвда-тельные неспорообразующие палочки были объединены в семейство Bacteroidaceae в составе родов Bacteroides, Pusobacterium, Dialister и Spherophorus (R.S.Breed et al.,4957). Род Bacteroides включал палочковидные микроорганизмы с закругленными концами, род Fusobacterium - палочки с заостренными концами, род Dialister - клетки с диаметром менее 0,3 мкм, род shpoero-phorus - полиморфные палочки с закругленными концами.
Кроме этих четырех родов в семейство Bacteroidaceae был включен род streptobaciiius представленный одним видом факультативно-анаэробных грамотрицательных неспорообразувдих полиморфных палочек - Streptobacilltis monilliformis.
Способы создания анаэробных условий
Бактероиды являются облигатными анаэробами и поэтому растут лишь в условиях отсутствия молекулярного кислорода. В отличие от клостридий, споры которых резистентны к действию многих внешних факторов и в том числе к действию кислорода, бактероиды быстро отмирают при доступе кислорода воздуха. В связи с этим культивирование бактероидов требует использования методов, которые не только обеспечивали бы достаточно хорошие анаэробные условия, но также создавали бы эти условия в минимально короткие сроки. Однако даже условия вакуума не являются оптимальными для роста этих анаэробов. Хороший рост большинства видов бактероидов наблюдается в условиях бескислородной газовой атмосферы, содержащей углекислый газ (B.A.Dehorty, 1971, и др.).
Бактероиды имеют сложные пищевые потребности, поэтому их культивируют на питательных средах, обогащенных дрожжевым экстрактом, гемином, витамином К и другими факторами роста.
При работе с бактероидами используют в основном те же методы, что и при работе с другими анаэробами, однако эти методы модифицируют с учетом особенностей данных организмов.
Анаэробиоз при выращивании облигатно-анаэробных микроорганизмов достигается физическими, химическими и биологическими способами или их сочетанием.
Наиболее простым способом удаления молекулярного кислорода из питательной среды является ее кипячение. Впервые этот способ применил Пастер, который заливал прорегенериро ванные кипячением питательные среды вазелиновым маслом для предотвращения дальнейшего проникновения в них кислорода (М.Юнгано, А.Дистазо,1912).
Из аппаратов для культивирования анаэробов воздух откачивают различными насосами. Одними из первых вакуумные насосы при работе с анаэробами стали использовать Roux, Schotteiius, Barman,1 Renfoid, Hoiker, Н.Худяков (Н.Худяков, 1896; I.C.Hall, 1929).
Анаэробные условия в аппаратах и в питательных средах могут быть созданы путем вытеснения воздуха каким-либо безвредным для микроорганизма, не содержащим кислорода газом. Для этих целей уже в конце XIX - начале XX века были предложены углекислый газ, водород, светильный газ, азот (М.Юнгано,А.Дистазо,1912; I.C.Hall/ 1929). В настоящее время наряду с этими газами используются также гелий и аргон (A.E.Bridges et al., 1952; C.ELler et al., 1971).
С помощью химических способов кислород удаляют как из питательных сред, так и из аппаратов для выращивания анаэробов. Для поглощения кислорода из питательных сред к ним добавляют различные редуцирующие вещества: глюкозу, цистеин, железоамми-ачные квасцы, двойную сернокислую соль цинка и аммония, губчатую платину, гидросульфит натрия, сероводород, сернистый натрий (М.Юнгано,А.Дистазо,1912; I.C.Hall, 1929; A.T.Willis,1 1977).
Для создания анаэробиоза в аппаратах были использованы такие поглотители кислорода, как щелочной раствор пирогаллола, фосфор, хлористый двухвалентный хром, ацетат хрома, хромовые квасцы в сочетании с цинком, закись железа, раскаленная до 200-400С медь (М.Юнгано, А.Дистазо,1912; I.C.Hall,1929; H.W.Sto-пе,Ч93б; R.E.Htragate,4950; B.S.Drasar,i967).
Количественный и видовой состав бактероидов кишечной микрофлоры человека и животных
Первые работы по изучению анаэробной микрофлоры кишечника относятся к концу XIX - началу XX века. В ранних исследованиях уже указывается на регулярное обнаружение анаэробов в микрофлоре кишечника детей и взрослых (П.Циклинская, 1918; H.Tissier, 1900). В последующих работах были получены количественные данные о преобладании неспоровых анаэробов: бактероидов и бифидо-бактерий в фекальной микрофлоре человека (A.H.Eggerth, в.н. Gagnon,1933; J.E.Weiss/ b.!T.Rettger,i937).
Совершенствование анаэробных методов культивирования способствовало развитию исследований в этой области. Были описаны, изучены и классифицированы многие группы анаэробных микроорганизмов, стали изучаться вопросы взаимовлияния анаэробов кишечника и макроорганизма.
По современным представлениям анаэробные микроорганизмы составляют 95-99$ от всей микрофлоры кишечника (M.E.bevison," D.Kaye,i969; W.E.C.Moore et al.,1969). Бактероиды являются одними из наиболее многочисленных представителей кишечной микрофлоры. В толстом кишечнике человека данные анаэробы составляют 30-40$ от всей культивируемой микрофлоры (її.Неггташ,і957; M.E.ievlson/ D#Kaye,i969, и др.), при этом количество их достигает 1Ср-Ю11/т (В.Г.Геймберг и др., 1964; А.А.Ленцер, М.Э.Ми-кельсаар, 1966; А.А.Петраков и др. ,1983; W.E.C.Moore, L.V.Hol-deman,1974; b.V.Holdeman et al.,1976j І).J.Hentges,1977).
В микрофлоре толстого кишечника многих животных количество бактероидов находится приблизительно на том же уровне (H.W. Smith,i965; !P.Mitsuoka,1974, И др.).
Работы по изучению кишечной микрофлоры лабораторных животных показали, что у мышей в толстом кишечнике бактероиды обнаруживаются в количестве 10 -1Сг/г (Б.В.Пинегин и др., 1977; H.W.Smith,1 W.B.Ciabb,1961; M.A.Harris et al.,Ч97б;1977), а в кишечнике крыс, по данным одних авторов, бактероиды достигают Ю -1Сг/г (C.D.Graber,i965),- по данным же других авторов -Ю8-Ю10/г (H.W.Smith,1965; K..Chung et al.,1977; J.Morishi i&i K.Miyaki,l979). В толстом кишечнике морских свинок бактероиды содержатся в количестве 10 -10 Vr (А.К.Балтрашевич,1976; H.W.Smith,1965; T.Mitauoka,i974),4 примерно в таком же количестве их обнаруживают в кишечной микрофлоре кроликов (М.С.Поляк и др.,1983; H.W.Smith,; W.E.Crabb,l96l; T.Mitsuoka, 1974). Некоторые исследователи отмечают, что в мягком кале кроликов содержится больше бактероидов, чем в твердом (В.Г.Геймберг и др., 1958). В фекальных образцах взрослых миниатюрных свиней, являщихся сравнительно новым видом лабораторных животных, баК-тероиды были обнаружены в количестве IQr/v (j.w.Kalacz et al., 1970; 1971).
У сельскохозяйственных животных бактероиды также являются весьма многочисленной группой кишечных микроорганизмов. В микрофлоре толстого кишечника лошадей эти анаэробы содержатся в количестве 10 -108/г, а в микрофлоре толстого кишечника коров -в количестве 107-109/г (T.Mitsuoka,1 1974). У жвачных животных бактероиды заселяют не только толстый кишечник, но также и преджелудки. Например, в рубце коров и овец количество бактероидов достигает 107-109/г (M.P.Bryant, b.A.Burkey,i9532; R»E. Hungate,; 1966). Довольно противоречивы сообщения о количест 33
венном содержании бактероидов в толстом кишечнике свиней. По данным одних авторов (J.P.Salanitro et al.,1977; E.G.Russell, 1979), количество этих микроорганизмов незначительно и не превышает 2,5-8$ от всей кишечной микрофлоры, в то время как по данным других авторов (H.W.Smith,; W.E.Crabb,196l; T.Mitsuoka, 1974)у их количество достигает 105/г и даже 1Сг0/г.
Бактероиды как этиологические агенты пригнойно-воспалительной патологии человека
Первые сведения об обнаружении анаэробных грамотрицателъ-ных неспорообразующих палочек при различных гнойно-септических и гнойно-некротических заболеваниях человека относятся к концу XIX - началу XX века. Работы Vincent, Veilion и Zuber, Hall, Perrone, Григорова, Rist, nmgano, Distaso и некоторых других исследователей показали, что анаэробные грамотрицательные неспорообразуодие палочки выделяются при некротической ангине, аппендиците, перитоните, абсцессах печени, воспалительных заболеваниях женского генитального тракта, послеродовых инфекциях (М.Юнгано, А.Дистазо, 1912).
В настоящий период времени значительный вклад в изучение анаэробной бактероидной инфекции внесли A R.PreVot (A.R.Brevet et al.,1967),- H.Werner (1974), S.L.Gorbach И J.G.Bartett (1974) , s,M.Pinegold (1977 и многие другие исследователи.
Бактероидная инфекция, как правило, эндогенная инфекция. Для развития ее требуются определенные предрасполагающие условия, такие, как травмы, операции, злокачественные опухоли, то есть то, что ослабляет общую и местную резистентность организма, приводит к нарушению кровотока в поврежденном участке и образованию некротизированной ткани. Такие нарушения способствуют снижению содержания в тканях кислорода, благодаря чему понижается и окислительно-восстановительный потенциал, что благоприятствует развитию бактероидов, которые, являясь доминирующей частью нормальной микрофлоры естественных полостей тела человека, легко контаминируют поврежденный участок (S.Kt.Finegoid, 1977.,).
Обращает на себя внимание тот факт, что бактероиды значительно чаще выделяются из клинического материала не в чистых культурах, а вместе с аэробными и факультативно-анаэробными микроорганизмами (В.И.Кочеровец, 1982; В.М.Мельникова и др., 1982; H.Thadepalli et al.,1973; S.L.Gorbach,: J.G.Bartlett,1974; L.Muth, T.Eden,i98i; R.Pieper et al.,1982). Кроме того, экспериментальное воспроизведение бактероидной инфекции редко удается в том случае, если используют чистые культуры бактероидов, тогда как введение их животным вместе с аэробными микроорганизмами обычно заканчивается развитием инфекционного процесса (S.S.Socransfcy R.J. Gibbons, 19б5; S.L.Gorbach, J.G.Bartlett,1 1974; M. J.Kelly/ 1978). Эти факты объясняют синергидным действием аэробной микрофлоры, которая, ослабляя защитные барьеры макроорганизма, поглощая кислород и выделяя ряд продуктов метаболизма, в которых нуждаются бактероиды, способствует развитию бактероидной инфекции (S.L.Gorbach, J.G.Bartlett,- 1974). Из патологического материала бактероиды наиболее часто выделяются в ассоциации с такими аэробными или факультативно-анаэробными микроорганизмами, как кишечная палочка, стрептококки, стафилококки, синегнойная палочка (А.В.Кочетков, В.И.Кочеровец, 1982; S.L.Gorbach J.G.Bartlett,1974; B.I.Duerden,i9801; J.Dankert et al.,1980).
Частота выделения бактероидов в чистых культурах составляет, по данным разных авторов, от 26-29$ до 56% (D.A.Leigh, 1974; B.I.Duerden,;1980 ; M.K.Lalita, G.Koshi,1980), ЧТО может свидетельствовать об определенном патогенном потенциале данных микроорганизмов.
Материалы исследования
При изучении нормальной микрофлоры толстого кишечника исследовали пробы свежих фекалий от здоровых лщей и лабораторных животных: морских свинок, крыс, мини-свиней. Всего было исследовано 90 проб фекалий, из них 20 проб от 20 человек - 10 женщин и 10 мужчин в возрасте от 22 до 47 лет, 25 проб от 25 нелинейных" морских свинок - 13 самок и 12 самцов в возрасте 6-7 месяцев, 25 проб от 25 нелинейных белых крыс - 15 самок и 10 самцов в возрасте 6-7 месяцев и 20 проб от 20 мини-свиней светлогорской популяции - Г7 самок и 3 самцов в возрасте от I года до 3 лет.
Морские свинки и крысы были получены из Центрального питомника лабораторных животных АМН СССР. Мини-свиньи содержались в отделении всеядных ВИЛ экспериментально-биологических моделей Ш СССР.
Питание лщей не контролировалось. Рацион морских свинок и крыс состоял из натуральных и брикетированных кормов согласно приказу МЗ СССР & 163 от 10 марта 1966 г. Рацион мини-свиней в расчете на I животное состоял из 1,0 кг комбикорма К-534; 0,05 кг сухого молока; 2,0 кг зелёной массы.
При изучении микробного состава при гнойно-воспалительных заболеваниях пробы клинического материала получали от больных из Московского городского НИИ скорой помощи им. Н.В.Склифосов-ского и ВНИ центра охраны здоровья матери и ребенка МЗ СССР. Всего было исследовано 153 пробы клинического материала от НО больных, из них 47 проб от 40 больных с перитонитом, 37 проб от 23 больных с травматическими ранами, 15 проб от 6 больных с осложненными ранами после операций на кишечнике и промежности, 12 проб от 8 больных с ранами после кесарева сечения, 21 проба от 15 больных с эндометритом, 14 проб от 13 больных с хроническим сальшшгоофоритом, 7 проб от 5 больных с плевритом.
Биологические свойства (культуральные и морфологические признаки, состав летучих жирных кислот (Cg-Cg) в бульонных культурах, чувствительность к 1000 мкг/мл канамицина, образование каталазы, индола, сероводорода, редукция нитратов, гидролиз желатина, характер роста на молоке, стимуляция роста гемином, влияние на рост желчи, гидролиз эскулина, ферментация арабинозы, ксилозы, глюкозы, маннозы, фруктозы, рамнози, сорбозы, лактозы, мальтозы, мелецитозы, сахарозы, трегалозы, целлобиозы, рафино-зн, инулина, крахмала, маннита, сорбита, дульцита, салицина, адонита, инозита) были исследованы у 225 штаммов анаэробных грамотрицательных неспорообразующих палочек, растущих на среде с кровью без образования черного пигмента, из них 50 штаммов были выделены из кишечной микрофлоры от 12 человек, 50 штаммов -из кишечной микрофлоры от 12 морских свинок, 39 штаммов - из кишечной микрофлоры от 10 крыс, 39 штаммов - из кишечной микрофлоры от II мини-свиней и 47 штаммов - из клинического материала от 31 больного. Кроме бактероидов биологические свойства были исследованы у 100 клинических штаммов анаэробных микроорганизмов.
