Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Нормальная микрофлора кишечника и её значение для здоровья ребёнка 8
1.2. Бифидобактерий и их значение для здоровья человека 24
1.3. Молекулярно-генетические исследования микрофлоры 27
Глава 2. Материалы и методы 33
2.1. Пациенты, методика забора и транспортировки материала. Бактериологическое исследование микрофлоры кишечника 33
2.2. Выделение штаммов бифидобактерий из клинического материала 37
2.3. Выделение тотальной ДНК из штаммов бифидобактерий и идентификация изолятов 38
2.4. Методы статистической обработки 42
Глава 3. Результаты собственных исследований 43
3.1. Микробиологический мониторинг интестинальной микрофлоры у детей 43
3.2. Исследование интестинальной микрофлоры матерей 50
3.3. Сравнительный анализ видового состава бифидобактерий у людей различного возраста 51
3.4. Сравнительный анализ штаммов бифидобактерий кишечной микрофлоры матерей и детей при помощи молекулярно-генетических методов 53
Глава 4. Обсуждение результатов 63
Выводы 76
Практические рекомендации 77
Список литературы - 78
- Нормальная микрофлора кишечника и её значение для здоровья ребёнка
- Пациенты, методика забора и транспортировки материала. Бактериологическое исследование микрофлоры кишечника
- Выделение тотальной ДНК из штаммов бифидобактерий и идентификация изолятов
- Микробиологический мониторинг интестинальной микрофлоры у детей
Введение к работе
Поверхность слизистых оболочек является местом наиболее тесного
взаимодействия организма хозяина с колонизирующими его микроорганизмами,
причем слизистая кишечника представляет собой наиболее значительную
область такого контакта. Являясь местом обитания многочисленного
бактериального сообщества, отделенного от внутренней среды организма
только монослоем эпителиальных клеток, кишечник адаптирован для
двусторонних обменных процессов хозяин-микрофлора. Количество
резидентных бактерий, обитающих в кишечнике, десятикратно превосходит число человеческих соматических клеток, а совокупный микробный геном намного превышает геном человека (171). Структура и состав кишечной микрофлоры отражает процессы естественного отбора, протекающие как внутри самого микробного сообщества, так и на уровне его взаимодействия с организмом хозяина.
Роль нормальной индигенной микрофлоры все еще недостаточно изучена, но одна из наиболее важных ее функций, вероятно, заключается в поддержании колонизационной резистентности против внешней паразитарной экспансии, а также в контроле за чрезмерным ростом потенциальных патогенов, уже присутствующих в кишечнике (8). Антагонистическая активность индигенной микрофлоры обусловлена различными механизмами, прежде всего биохимическими: способностью продуцировать органические кислоты, бактериоцины и другие антимикробные субстанции (24; 197).
Формирование нормальной микрофлоры кишечника человека начинается еще на самых ранних этапах жизни. Считается, что первичным источником бактерий колонизирующих пищеварительный тракт ребенка являются родовые пути матери, во время прохождения которых новорожденный заглатывает их содержимое вместе с бактериями вагинальной микрофлоры. После рождения колонизация кишечника ребенка продолжается не только штаммами бактерий
3«
поступающих от матери, но и микроорганизмами от других источников находящихся во внешней среде (103). Однако, указанные предположения, касающиеся участия материнских штаммов бактерий в первичной колонизации гастроинтестинального тракта ребенка, до последнего времени остаются не достаточно подтвержденными научными данными. Это, в свою очередь связано с малой информативностью используемых для решения этой задачи микробиологических методов, основанных, прежде всего, на изучении морфологических, физиолого-биохимических и культуральных свойств бактериальных штаммов изолируемых из материнских и детских источников.
Активное внедрение молекулярно-генетических технологий в практику микробиологических исследований позволило получить новую информацию о составе и свойствах интестинальной микрофлоры у людей разного возраста (66, 68). В последние годы был разработан целый арсенал методов, основанных на полимеразной цепной реакции, позволяющих не только быстро и достоверно определить видовую принадлежность выделяемых микроорганизмов, но и проводить их количественную оценку непосредственно в исследуемом материале без этапа культивирования.
Среди большого разнообразия бактериальных видов, колонизирующих толстый кишечник, особого внимания заслуживают бактерии рода Bifidobacterium. В толстой кишке у детей бифидобактерии являются основной группой и составляют до 95% от общей популяции микроорганизмов (7, 187, 157,171,189,78).
Благодаря исключительно позитивному воздействию бифидобактерии на локальный статус пищеварительного тракта, а также их системному иммуномодулирующему эффекту, бифидобактерии стали объектом многочисленных научных исследований, и широко используются в качестве пробиотических препаратов (9, 3).
Вместе с тем, до последнего времени данные о видовых и штаммовых
3/
изменениях, происходящих в составе би фи до флоры у людей по мере взросления, остаются ограниченными.
В этой связи, очевидна актуальность проведения сравнительного мониторинга нормальной микрофлоры толстого кишечника у клинически здоровых детей в динамике с привлечением методов молекулярно-генетической идентификации и типирования штаммов бифидобактерий.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ
С использованием бактериологических и молекулярно-генетических методов провести мониторинг становления видового состава бифидобактерий у детей, а также путем сравнительного генетического анализа штаммов бифидобактерий, выделенных в парах мать-ребенок, выявить особенности транслокации материнских штаммов бифидобактерий кишечного происхождения к ребенку.
ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Изучить в динамике качественный и количественный состав микрофлоры
толстого кишечника у клинически здоровых детей разного возраста.
Создать коллекцию штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника детей разных возрастных групп и провести их видовую идентификацию при помощи молекулярно-генетических методов.
Создать коллекцию штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника детей раннего возраста и их матерей, и провести сравнительный анализ при помощи метода REP-ПЦР и RAPD-ПЦР для установления их генетической идентичности.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ Идентификация бифидобактерий проведена с использованием ПЦР с видоспецифичными бифидобактериальными праймерами. Проведено частичное секвенирование 16S рДНК бифидобактерий, выделенных из кишечника детей разного возраста и взрослых женщин, что позволило провести оценку динамики /
возрастных изменений бифидофлоры.
Впервые с использованием метода REP-ПЦР проведен сравнительный анализ штаммов бифидобактерий в парах мать-ребенок для установления их генетической идентичности. Полученные результаты свидетельствуют в пользу существующей гипотезы о ранней колонизации детей материнскими штаммами бифидобактерий.
Впервые исследовано субвидовое штаммовое разнообразие кишечных бифидобактерий у детей раннего возраста методом RAPD-ПЦР и получены данные о транслокации материнских штаммов от матери к ребёнку.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ Создана коллекция штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей и взрослых людей, включающая практически все виды микроорганизмов данного рода, обитающие в интестинальном микробиоценозе. Видовая принадлежность полученных штаммов определена при помощи высокочувствительных молекулярных методов, что повышает ценность этой коллекции. Часть штаммов бифидобактерий была подвергнута генетической паспортизации методами REP-ПЦР и RAPD-ПЦР фингерпринтинга.
Полученные данные о качественном и количественном составе бифидофлоры у детей различного возраста и взрослых людей могут быть использованы как критерии нормы при оценке различных нарушений микрофлоры кишечного тракта, а также для подбора оптимального видового (штаммового) состава бифидобактерий, включаемых в пробиотические препараты и используемых с целью купирования нарушений кишечной микрофлоры.
В настоящее время штаммы из созданной коллекции используются сотрудниками кафедры микробиологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава для изучения разнообразных биологических свойств бифидобактерий.
В настоящее время штаммы из созданной коллекции используются сотрудниками кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава для изучения разнообразных биологических свойств бифидобактерий (акт от 17 февраля 2010 г.)
Результаты исследования включены в материалы лекционного курса для студентов, врачей-интернов и клинических ординаторов, проходящих обучение на кафедре микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Апробация диссертационной работы состоялась на научной конференции кафедры микробиологии и вирусологии ГОУ ВПО РГМУ протокол № 3 от 07 октября 2008 года. Основные положения работы были доложены на заседаниях секции гнотобиологии Московского отделения Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И.И. Мечникова в 2005 и 2008 гг., на практической конференции «Тимаковские чтения», проводимой секцией гнотобиологии 24.12.2002 г. в ГОУ ВПО РГМУ.
ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 3 статьи - в изданиях, рекомендуемых ВАК РФ, в сборниках научных трудов - 6, в других журналах -1, в материалах конференций - 5.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ
Диссертационная работа изложена на русском языке на 95 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиография включает 213 источников, в том числе 33 работы отечественных авторов и 180 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 4 рисунками.
Нормальная микрофлора кишечника и её значение для здоровья ребёнка
Микрофлора кишечника выполняет множество чрезвычайно важных для организма хозяина функций. Одна из важнейших - колонизационная резистентность - обеспечивается способностью некоторых представителей нормальной микрофлоры прикрепляться к рецепторам эпителиальных клеток слизистой оболочки кишечника, препятствуя, таким образом, адгезии патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, возбудителей инфекционных заболеваний (76, 96). Колонизационная резистентность обеспечивается также тем, что индигенные микроорганизмы синтезируют вещества, подавляющие рост и размножение патогенных бактерий, конкурируют с ними за источники питания, препятствуют их проникновению в верхние отделы желудочно-кишечного тракта, а также запрещают их транслокацию из просвета кишечника во внутренние органы (24, 95, 189, 192, 193,210).
Представители нормальной микрофлоры участвуют в неспецифической стимуляции гуморального и клеточного иммунитета (50, 56, 58, 78).
Микрофлора кишечника оказывает морфокинетическое действие на слизистую кишечника в процессе пищеварения, вырабатывая некоторые ферменты, расщепляющие белки и углеводы, а также синтезируя витамины группы В и К (43, 57). При брожении моносахаридов анаэробные микроорганизмы образуют короткоцепочечные жирные кислоты, которые в значительной мере восполняют энергетические потребности эпителиоцитов толстой кишки и других клеток организма (57, 58). Некоторые представители микрофлоры кишечника могут влиять на экспрессию генов, регулирующих всасывание питательных веществ, ангиогенез, постнатальное созревание кишечника, метаболизм ксенобиотиков, поддержание барьерной функции слизистой кишечника (29, 36, 37). Кроме того, показано, что индигенные представители нормальной микрофлоры способны нейтрализовать вещества, индуцирующие канцерогенез, и тем самым значительно снижать вероятность развития онкологических заболеваний (107, 127, 169). Нормальная микрофлора участвует в детоксикации эндогенных и экзогенных токсинов и ксенобиотиков (79,87,117).
Процесс формирования микрофлоры желудочно-кишечного тракта является сложным и многоэтапным. Плод при целой плодной оболочке до момента рождения остается стерильным.
Нормальная микрофлора кишечника формируется на самых первых этапах жизни. Уже во время родов у ребенка, проходящего через родовые пути и заглатывающего их содержимое, происходит колонизация пищеварительного тракта вагинальной микрофлорой матери (10, 44). Однако в меконии новорожденных микроорганизмы отсутствуют. Сразу после родов новорожденный продолжает колонизироваться микробами от матери, персонала и из окружающей его внешней среды. Первыми микроорганизмами, заселяющими организм новорожденного, являются аэробные и факультативно анаэробные бактерии. К 3-4 дню жизни в микрофлоре толстой кишки у новорожденных присутствуют лактобактерии (108 КОЕ/г испражнений), кишечные палочки (10 КОЕ/г). В ротовой полости новорожденных обычно выявляются бактерии рода Lactobacillus и Streptococcus salivarius. Оральные анаэробные микроорганизмы заселяются при прорезывании зубов. (14).
Стафилококки также обнаруживаются у детей с первого дня жизни, а к 3-му дню жизни ребенка частота выявления золотистого стафилококка из фекалий составляет 16% и количество их на первой неделе жизни достигает 107 КОЕ/г (ПО).
Факультативно-анаэробные микроорганизмы, колонизируя кишечник, снижают окислительно-восстановительного потенциал в просвете кишечника, что является предпосылкой для последующего заселения облигатно-анаэробными микроорганизмами: бифидобактериями и бактероидами, которые на первой неделе жизни ребёнка выявляются непостоянно. Лактобактерии начинают выявляться на 5-7 день, менее чем в половине случаев. Клостридии выделяются с четвертого дня жизни приблизительно у одной трети обследованных детей (70, 177).
Начальная контаминация новорожденного ребёнка различными штаммами бактерий в значительной степени зависит от типа родоразрешения. На колонизацию кишечника детей, родившихся через естественные родовые пути, существенное влияние оказывает состав вагинальной микрофлоры матери, в то время как у новорожденных, родившихся путем операции кесарева сечения, на этот процесс влияют микроорганизмы окружающей среды. Состав микрофлоры конъюнктивы и желудочного аспирата детей, родившихся через естественные родовые пути, в первые сутки жизни идентичен микроорганизмам, населяющим генитальный тракт матери (49, 160), в то время как дети, извлеченные путем кесарева сечения, медленнее колонизируются кишечными палочками, при этом у них обнаруживается склонность приобретать штаммы медперсонала. Кроме того, у таких детей отмечается задержка колонизации желудочно-кишечного тракта анаэробными микроорганизмами. Количество бифидобактерий не достигает нормального уровня в течение 4-8 недель (41). Состав молочнокислой флоры кишечника начинает соответствовать микрофлоре нормально родившихся детей только после 40-го дня жизни.
Степень микробиологической чистоты предметов, окружающих ребенка в родильном доме, также влияет на процесс первичной колонизации кишечника новорожденного. Состав кишечной микрофлоры может несколько отличаться у детей, родившихся в различных родильных домах и даже находящихся в разных палатах одного и того же учреждения (45, 114, 202).
Одним из основных факторов, определяющих состав микрофлоры кишечника новорожденного, является тип вскармливания ребенка (114, 132). У детей, находящихся на грудном вскармливании с первых часов жизни, создаются оптимальные условия для формирования нормального микробиоценоза кишечника (16, 22, 200, 211).
Пациенты, методика забора и транспортировки материала. Бактериологическое исследование микрофлоры кишечника
С целью решения поставленных задач нами была проведена оценка состояния кишечной микрофлоры у 62 клинически здоровых людей обоего пола, из которых пятеро дети в возрасте от 1 до 3 дней, четверо в возрасте от 14 до 16 дней, 12 в возрасте от 1 до 6 месяцев и 28 в возрасте от 8 до 16 месяцев. Все эти дети (первая группа) были рождены от здоровых матерей в срок. Семеро детей из группы 8-16 месяцев были повторно обследованы в возрасте 6-ти лет. Кроме того, одновременно с исследованием микрофлоры кишечника у 13 детей, возраст которых составлял от 2-х до 11 месяцев, было проведено изучение кишечной флоры и у их матерей.
Вторая группа обследуемых включала 16 недоношенных детей (гестационный возраст - 28-36 недель), родившихся от матерей с дородовым излитием околоплодных вод. Дети находились в палате интенсивной терапии и получали антибактериальную терапию и препараты пробиотики (ампициллин, гентамицин + линекс и бифидумбактерин). Исследование микрофлоры кишечника у детей этой группы было проведено первично в первые трое суток жизни, затем в возрасте 2-х недель, и в возрасте 1-2-х месяцев.
Недоношенные дети находились на искусственном или смешанном вскармливании. Здоровые дети находились на грудном или смешанном вскармливании, в период обследования не получали каких-либо биопрепаратов или антибиотиков.
Одновременно с исследованием микрофлоры детей проводилось изучение качественного и количественного состава микрофлоры толстого кишечника 26 матерей: 12 матерей с дородовым излитием околоплодных вод перед родами и после родов, 13 здоровых матерей 2-х кратно одновременно с детьми. Все семьи проживали в городе Москве.
Материалом для исследования являлись фекалии. Транспортировка исследуемого материала осуществлялась во флаконах с плотно притертыми резиновыми пробками, заполненными газом или транспортной тиогликолевой средой (2мл) для защиты облигатно-анаэробных бактерий от действия кислорода. От момента забора материала до момента посева проходило не более 2 часов. В бактериологической лаборатории к навеске фекалий добавляли десятикратный объём физиологического раствора и гомогенизировали в фарфоровой ступке. Из полученного гомогената готовили десятикратные серийные разведения от 10"3 до 10"8. Флаконы с тиогликолевой средой взвешивали до и после взятия материала, далее готовили десятикратные разведения. Далее по 0,1 мл из соответствующих разведений исследуемого материала засевали на элективные питательные среды.
Для выделения бифидобактерии использовали среду Бактофок для бифидобактерии (Гидробиос, Россия) с добавлением 1,5% агара (Serva, США). Посев производился из 10"7 и 10"8 разведений. Чашки Петри с посевами инкубировались при 37С в течение 48 часов в анаэробных условиях. Для их создания использовались микроанаэростаты (OXOID, Англия). После закрытия анаэростата из него откачивали воздух при помощи вакуумного насоса, затем анаэростат заполняли газовой смесью (85% N2, 10% СОг, 5% Н2) и помещали в термостат. Для удаления оставшегося кислорода в анаэростат помещали палладиевые катализаторы, предварительно регенерированные в сухожаровом шкафу при температуре 175-180С в течение 1 часа.
После 48- и 72-часовой инкубации чашки с выросшими колониями изучали макро- и микроскопически. На поверхности плотной питательной среды бифидобактерии образуют гладкие, ровные, выпуклые колонии, белого или кремового цвета, диаметром 1-1,5 мм. Из всех типов колоний делали мазки и окрашивали по Граму. В мазке бифидобактерии имеют вид прямых или слегка изогнутых палочек, иногда с утолщениями или бифуркациями на концах, небольшие скопления напоминают иероглифы. Для окончательного установления принадлежности к роду Bifidobacterium проводили молекулярно-генетическую идентификацию.
Для выделения лактобактерий использовали среду MRS (HiMedia, Индия) с добавлением 1,5% агара. Посев производился из 10" и 10" разведений. Чашки Петри с посевами инкубировались в анаэростатах (BBL, США), продутых газовой смесью (85% N2, 10% СОг, 5% Н2), без палладиевых катализаторов в течение 48 часов при температуре 37С. На этой среде лактобактерий обычно образуют крупные колонии, гладкие или шероховатые, белого цвета. При учете чашек с посевами делались мазки из всех типов колоний и окрашивались по Граму. Подтверждением принадлежности колонии к роду лактобацилл являлась их морфология, отсутствие спор, каталазной и оксидазной активности.
Для выделения представителей неспорообразующей облигатно-анаэробной флоры (бактероидов, эубактерий, пептострептококков) использовали среду Columbia agar Base (BBL, США) с добавлением канамицина (100 мг/л), витамина Ki (1,5 мг/л) и крови (5%). Чашки инкубировали в анаэростатах, также как и при выделении бифидобактерий, 48 часов при 37С.
При исследовании колоний, выросших на этой среде, изучали их морфологию, наличие пигмента, зоны гемолиза вокруг колоний. Подсчитывали количество колоний каждого типа, выросших на чашках. Материал из колоний окрашивали по Граму, изучали морфологию бактерий, наличие спор. При учете результатов посевов материал из отдельных колоний каждого типа высевался петлей параллельно на две отдельные чашки с той же средой, но без антибиотика: одну чашку помещали в аэробные условия, а вторую - в анаэробные.
Выделение тотальной ДНК из штаммов бифидобактерий и идентификация изолятов
Исследование кишечной микрофлоры проводили у 62 клинически здоровых детей обоего пола, из которых пятеро дети в возрасте от 1 до 3 дней, четверо в возрасте от 14 до 16 дней, 12 в возрасте от 1 до 6 месяцев и 28 в возрасте от 8 до 16 месяцев. Все эти дети (первая группа) были рождены от здоровых матерей в срок. Семеро детей из группы 8-16 месяцев были повторно обследованы в возрасте 6-ти лет. Кроме того, одновременно с исследованием микрофлоры кишечника у 13 детей, возраст которых составлял от 2-х до 11 месяцев.
Исследование микрофлоры кишечника здоровых детей, проведённое на третьи сутки жизни, выявило отсутствие у них облигатно анаэробных бактерий (таблица №2). При этом у 60% детей были выявлены лактозопозитивные кишечные палочки, среднее количество которых составило 7,3±1,5 log КОЕ/г исследуемого материала. Кроме того, у 80%) обследуемых детей этого возраста присутствовали стафилококки (4,9±2,3 log КОЕ/г) и энтерококки (8,1±2,0 log КОЕ/г).
Исследование кишечного содержимого на 14-й - 16-й день выявило, что в 100% случаев бифидобактерии доминировали в толстой кишке и определялись в количестве 9,11±0,51 log КОЕ/г. Так же у 100% детей выявлены лактобактерии (8,21±0,88 log КОЕ/г), лактозопозитивные эшерихии - 7,33±1,33 log КОЕ/г и энтерококки - 7,63±0,47 log КОЕ/г. У 50% детей выявлены коагулазонегативные стафилококки (6,06±0,02 log КОЕ/г) и бактероиды (7,86±0,36 log КОЕ/г) . У 28% детей этой группы были обнаружены лактозонегативные эшерихии (6,46±1,32 log КОЕ/г).
В микробиоценозе кишечника детей в возрасте от 1 до 6 месяцев по прежнему преобладали бифидобактерии, определявшиеся со 100% частотой, в количестве, составлявшем 10,1±0,6 log КОЕ/г. Лактобактерии выделялись у 75% детей (8,3±0,8 log КОЕ/г), бактероиды - в 50% случаев (9,8±0,9 log lg КОЕ/г). У всех детей были обнаружены типичные лактозопозитивные эшерихий и энтерококки в среднем количестве, составившем 8,5±0,9 log КОЕ/г и 8,1±1,0 log КОЕ/г исследуемого материала соответственно. Кроме того, в кишечной микрофлоре детей этой возрастной группы было выявлено разнообразие факультативно анаэробных микроорганизмов. Так, у 58% детей выделены S. aureus, количество которых достигало 5,3±1,6 log КОЕ/г, в 42% случаев были обнаружены цитробактеры (6,3±0,3 log КОЕ/г), у 58% были выделены клебсиеллы (8,3±0,9 log КОЕ/г) и у 17% детей определялись Enterobacter cloacae (6,4±2,8 log КОЕ/г). Грибы рода Candida были обнаружены у 42% детей в среднем количестве, составившем 3,7±1,8 log КОЕ/г.
Исследование микрофлоры детей в возрасте от 8 до 16 месяцев показало, что у 100% детей сохранялся высокий уровень бифидобактерии, среднее количество которых достигало 10,2±0,7 log КОЕ/г. Частота выделения лактобактерии сохранялась на уровне 79%, в среднем составляя 7,2±1,2 log КОЕ/г, а бактероидов, напротив, повысилась до 86%, при этом их уровень достигал значения 10,4±0,5 log КОЕ/г. В 93% случаев уровень типичных эшерихий составлял 7,9±1,1 log КОЕ/г, а энтерококков - 7,8±0,8 log КОЕ/г. У 86% детей были выявлены лецитиназонегативные клостридии при среднем показателе количественного уровня 7,8±1,1 log КОЕ/г, лецитиназопозитивные клостридии были обнаружены у 52% детей при среднем показателе 5,1±0,8 log КОЕ/г. Частота выделения, клебсиелл увеличилась до 76%, коагулазопозитивных стафилококков - до 83%, грибов рода Candida - 66%.
Таким образом, микрофлора кишечника здоровых детей в возрасте от 8 до 16 месяцев характеризуется высоким содержанием облигатно анаэробных микроорганизмов. Наряду с бифидобактериями, у большинства детей выделяются бактероиды и лецитиназонегативные клостридии. Бифидобактерии играют существенную роль в поддержании колонизационной резистентности, на фоне избыточной колонизации кишечника условно-патогенными микроорганизмами они, возможно, препятствуют их транслокации в другие экологические ниши организма.
В шестилетнем возрасте у всех обследованных здоровых детей (100%) сохранялся высокий уровень бифидобактерии, средний показатель которых составил 9,5±0,9 log КОЕ/г. При той же частоте бактероиды выявлялись в количестве 10,1±0,4 log КОЕ/г, энтерококки - 6,1±0,6 log КОЕ/г. Однако частота выделения и количественный уровень лактобактерий снизились, причем снижение второго показателя носило достоверный характер (р 0.05). Частота выявления лецитиназопозитивных клостридии сохранялась в тех же пределах (57%), а их количественный уровень несколько снизился (5,8±0,8 КОЕ/г). При этом отмечено снижение как частоты выделения лецитиназонегативных клостридии (71%), так и количественного показателя их уровня (6,9±1,9 log КОЕ/г). На фоне высокой концентрации бифидофлоры выявлено разнообразие энтеробактерий: у 86% детей определялись типичные эшерихии (7,6±0,6 log КОЕ/г), у 43% - гемолитические эшерихии (6,6±0,5 log КОЕ/г), у 57% -лактозонегативные гемолитические эшерихии (6,8±0,6 log КОЕ/г). Стафилококки, средний показатель которых составил 4,0±0,5 log КОЕ/г, выявлены у 57% детей, у 29% из них обнаружены S. aureus (2,8±0,1 log КОЕ/г). В 43% случаев были выявлены грибы рода Candida (2,9±0,8 log КОЕ/г).
Полученные результаты демонстрируют, что для детей первого года жизни характерны высокие популяционные уровни и частота выявления не только таких групп бактерий, как бифидобактерии, энтерококки, непатогенные эшерихии, но и бактерий, которые принято относить к условно-патогенным группам. Такими группами бактерий являются лецитиназопозитивные клостридии, коагулазопозитивные стафилококки, дрожжеподобные грибы рода Кандида, цитрат ассимилирующие энтеробактерий и эшерихии с низкой биохимической активностью, а также со способностью к продукции гемолизинов. К концу первого года жизни происходит частичная или полная элиминация условно-патогенных бактерий.
Микробиологический мониторинг интестинальной микрофлоры у детей
Непостоянное выявление лактобактерий дает возможность предположить, что данные микроорганизмы не способны сформировать стабильную популяцию в кишечнике новорожденных.
В проводимых нами исследованиях были выявлены особенности видового состава энтеробактерий, колонизирующих кишечник здоровых детей на первом году жизни. Так у детей разного возраста с наибольшей частотой высевались бактерии вида Е. coli, но определялись также другие представители семейства: клебсиеллы, энтеробактеры, и цитробактеры.
При изучении состава факультативно-анаэробной флоры установлено, что чаще всего определялись энтеробактерий, энтерококки и стафилококки. Так же выделялись эшерихии со сниженными ферментативными свойствами и штаммы, способные продуцировать гемолизины. Кроме того, клебсиеллы и энтеробактеры определялись с частотой 22%. К концу первого года жизни по мере созревания иммунной системы ребёнка происходит частичная или полная элиминация условно-патогенных бактерий. У 93% детей в возрасте 1-2 лет встречались типичные кишечные палочки, частота выделения лактозонегативных и гемолизиннегативных эшерихии снижалась соответственно с 28% до 17%. Снижалась также частота выявления клебсиелл и других энтеробактерий.
Динамическое исследование микрофлоры детей в разные возрастные периоды показало наличие в микробиоценозе кишечника бактерий вида Staphylococcus aureus, однако золотистые стафилококки по частоте встречаемости и количеству преобладали над коагулазонегативными стафилококками только у детей в возрасте 1-2 лет. В этой связи необходимо подчеркнуть, что за последние двадцать лет Staphylococcus aureus обнаруживаются с возрастающей частотой в интестинальной флоре детей, так по данным Stark P.L. и Lee А. (177) у 7,7% детей в испражнениях были выявлены эти бактерии. Ещё более высокие концентрации данного вида стафилококков обнаружены и рядом других авторов (ПО, 114, 170). Предполагается, что источником колонизации детей являлась микрофлора кожи людей, окружавших ребёнка.
В нашей работе было также показано, что в фекальной микрофлоре детей 1-2 года жизни выявлялись дрожжеподобные грибы рода Candida, количество которых достигало уровня 104 КОЕ/г, что отличается от данных литературы (32, 159).
У всех детей в возрасте 6 лет определялись бактероиды в 100% случаев и клостридии - 71%), причем количество бактероидов превышало 1010 КОЕ/г, а 7 Я. клостридии - 10-10 КОЕ/г. В кишечнике ребенка с возрастом количество и частота выявления бактероидов возрастают и, наряду с бифидобактериями, занимают доминирующее положение. Частота выявления этих микроорганизмов возрастает у детей к концу первого года жизни. Это может быть связано с высокой чувствительностью данных микроорганизмов к токсическому действию кислорода воздуха и необходимостью предварительного снижения окислительно-восстановительного потенциала в кишечнике при начальной контаминации кишечника факультативно-анаэробными бактериями. Резкое увеличение содержания бактероидов и клостридии в составе кишечной микрофлоры наблюдалось при введении прикорма в рацион грудных детей (101, 102, 185).
Таким образом, наше исследование выявило, что для детей разного возраста характерны высокие популяционные уровни и частота выделения не только бифидобактерий, энтерококков, типичных эшерихий, но и бактерий, которые принято относить к условно-патогенным группам. Это лецитиназопозитивные клостридии, коагулазопозитивные стафилококки, дрожжеподобные грибы рода Candida, цитрат ассимилирующие энтеробактерии и эшерихии с низкой биохимической активностью, а также со способностью к продукции гемолизинов.
Такое состояние нормальной микрофлоры кишечника ребёнка, видимо, связано с функциональными особенностями защитных систем организма детей, которые на протяжении относительно долгого времени после рождения остаются функционально незрелыми. Созревание иммунной системы происходит при контакте новорожденного с бактериальными и пищевыми аллергенами, в том числе и при участии бактерий нормальной микрофлоры кишечника, обладающих иммуномодулирующими свойствами.
Однако есть все основания предполагать, что иммунная система не может супрессировать специфическую микробную активность и контролировать весь спектр микроорганизмов, представленных в интестинальном тракте (139). Это предположение подтверждается фактом дисбиотических изменений интестинальной микрофлоры.
Существенные изменения микробиоценоза кишечника детей в последние годы по сравнению с предыдущими исследованиями могут быть связаны с воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды. Можно предположить, что высокий уровень бифидофлоры играет существенную роль в поддержании колонизационной резистентности и на фоне избыточной колонизации кишечника условно-патогенными микроорганизмами препятствует транслокации этих бактерий в другие биотопы тела человека.
Отсутствие клинических признаков дисбактериоза у детей, обследованных нами, позволяет считать выявленное состояние микробиоценоза кишечника физиологичным.
Динамическое равновесие между различными представителями микробиоценоза кишечника нарушается при приёме лекарственных средств и, прежде всего, антимикробных препаратов. Чрезвычайно важное воздействие на процесс формирования микрофлоры оказывает назначение антимикробных препаратов в ранний неонатальный период у недоношенных новорожденных.
Кишечник недоношенного новорожденного вследствие функциональной и физиологической незрелости имеет низкий порог проницаемости. Эти особенности пищеварительного тракта недоношенного могут способствовать транслокации бактерий в органы и ткани. Сочетанное воздействие этих факторов и незрелости иммунной системы значительно повышает риск развития генерализованного инфекционного процесса, вызванного, прежде всего, условно-патогенными микроорганизмами (5, 33, 59).
