Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli Шумков Михаил Сергеевич

Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli
<
Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Шумков Михаил Сергеевич. Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli : диссертация... кандидата биологических наук : 03.00.07 Пермь, 2007 146 с. РГБ ОД, 61:07-3/945

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 8

1.1. Адаптация клеток Escherichia coli к стационарной фазе роста, а' - субъединица РНК-полимеразы 8

1.1.1. Общие механизмы адаптации микроорганизмов к стрессу 8

1.1.2. & -субъединица РНК-полимеразы 10

1.1.3. Транскрипционная регуляция а' 12

1.1.4. Трансляционная регуляция rpoS 13

1.1.5. Регуляция стабильности RpoS-белка 14

1.1.6. Регуляция активности а 16

1.2. Механизмы адаптации Escherichia coli к кислотному стрессу 19

1.2.1. Условия развитию кислотного стресса in situ 19

1.2.2. Системы кислотоустойчивое Е. coli 20

1.3. Механизмы множественной устойчивости Escherichia coli к антибиотикам, основанные на ограничении их поступления в клетку и активном выбросе 23

1.3.1. Ограничение поступления ксенобиотков в клетку 23

Структурные особенности поринов 23

Регуляция пориноеого состава мембраны 24

1.3.2. Активный выброс из клетки. Многоцелевые системы выброса и их регуляция 25

1.4. Роль полиаминов в обеспечении процессов жизнедеятельности микроорганизмов 27

1.4.1. Виды биогенных полиаминов. Пути регуляции их внутриклеточной концентрации 27

1.4.2. Биосинтез и деградация полиаминов 28

1.4.3. Физиологическая роль полиаминов 30

Взаимодействие полиаминов с ДНК 31

Влияние полиаминов на биосинтез нуклеиновых кислот 32

Влияние полиаминов на белковый обмен 33

Взаимодействие с мембранами и регуляция синтеза фосфолипидов ЗА

Роль полиаминов в регуляции транспортных процессов 35

Роль полиаминов в адаптации к стрессу 35

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 39

2.1. Объекты исследования 39

2.2. Культивирование микроорганизмов 41

2.3. Определение активности р-галактозидазы 42

2.4. Определение содержания полиаминов в клетке и среде 43

2.5. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 45

2.6. Трансформация Е. coli плазмидной ДНК 45

2.7. Транспортная активность пориновых каналов 46

2.8. Минимальная ингибиторная концентрация антибиотиков 49

2.9. Определение концентрации ацетата 49

2.10. Статистическая обработка 50

ГЛАВА 3. Полиамины как фактор регуляции экспрессии rpoS при переходе культуры Escherichia coli в стационарную фазу 51

3.1. Роль экзогенных полиаминов в регуляции транскрипции rpoS в зависимости от фазы роста периодической культуры Е. coli и глюкозного голодания 52

3.2. Полиамииы как фактор поеттранскрипциоппой регуляции rpoS 56

3.3. Роль полиаминов в регуляции экспрессии rpoSn клетках полиаминдефицитных мутантові?, coli 61

ГЛАВА 4. Роль полиамииов в адаптации Е. coli к кислотному стрессу 64

4.1. Влияние продуктов обмена Escherichia coli на экспрессию rpoS. 65

4.2. Зависимость экспрессии rpoS от органических кислот как продуктов обмена Е. coli 68

4.3. Полиамины как элемент системы адаптации клетки к кислотному стрессу, вызванному действием органических кислот 72

4.4. Зависимость внутриклеточного содержания полиаминов от экспрессии rpoS 75

ГЛАВА 5. Полиамииы как фактор устойчивости Е. coli к антибиотикам 77

5.1. Роль полиаминов в формировании антибиотикорезистентности Е. coli в условиях стрессовых воздействий 77

5.2. Зависимость внутриклеточного содержания полиаминов от действия антибиотиков 82

5.3. Эффект антибиотиков на уровень экспрессии rpoS 86

5.4. RpoS как фактор адаптации Е. coli к разным группа антибиотиков.„89 5.4. Ограничение проницаемости внешней мембраны Е. coli как механизм защиты от антибиотиков 90

ГЛАВА 6. Обсуждение результатов 94

6.1. Роль полиаминов в регуляции экспрессии rpoS при переходе культуры Escherichia coli в стационарную фазу 94

6.2. Путресцин как фактор адаптации Escherichia coli к кислотному стрессу 102

6.3. Полиамины как фактор развития множественной антибиотикоустойчивости Escherichia coli 110

Заключение 117

Выводы 120

Литература 121

Введение к работе

Актуальность проблемы. Изучение процессов адаптации к
неблагоприятным факторам среды в настоящее время является одним из
наиболее интенсивно развивающихся направлений физиологии
микроорганизмов. Настоящая диссертационная работа посвящена
исследованию приспособительных механизмов, задействованых при
переходе культуры Е. coli к стационарной фазе роста и голоданию по
глюкозе как физологическим состояниям, с которыми бактерии часто
сталкиваются в природных местообитаниях (Nystrom, 2004а; Shleeva et al,
2004). В адаптации к различным видам стресса бактерии нередко используют
общие механизмы защиты (Ilengge-Aronis, 2002). В частности, это
справедливо для кислотного стресса (Foster, 2004). Способность Е. coli
преодолевать низкие значения рН желудка и выживать в окружении слабых
органических кислот в кишечнике определяет возможность её устойчивости
к действию кислот, используемых в качестве консервантов в пищевой
промышленности. В связи с этим, исследование механизмов приспособления
микроорганизмов к неблагоприятному влиянию закислення среды
приобретает практическое значение с точки зрения борьбы с кишечными
инфекциями. Поскольку в поддержании гомеостаза внутриклеточного рН
нередко принимают участие клеточные структуры, ответственные за
антибиотикоустойчивость (Lcwinson et al, 2004; Krulwich et al, 2005), это
создаёт возможность длительной персистеиции аптибиотикорезистеитпых
микроорганизмов в природных условиях даже в случае ограничения
использования антибиотиков с целью ослабления их селективного давления.
Изучение механизмов, участвующих в формировании

антибиотикорезистеитности, в том числе, в условиях стрессорных воздействий, делает данную работу ещё более актуальной.

Исследования в области микробиологии и молекулярной биологии обеспечили значительный прогресс в изучении генов и закодированных в них белков, участвующих в адаптации микроорганизмов к различным видам стресса. Вместе с тем, вопрос о механизмах, лежащих в основе регуляции

5 стрессорных реакций, во многом остается малоизученным. В частности, недостаточно полно исследована роль нормальных продуктов обмена веществ в тонкой настройке адаптивного ответа клетки. Среди факторов метаболической природы в последние годы особенно возрос интерес к биогенным полиаминам. Имеются данные об их влиянии на клеточные процессы про- и эукариот. Известно, что полиамины не только участвуют в регуляции нормального клеточного цикла (Yoshida et ai, 2004; Igarashi, 2006), но и выполняют важные функции в канцерогенезе (Tatib et al., 1998; Sandgren, Belting, 2003). На основании широкого спектра генов, регулируемых полиаминами, в последнее время выделена отдельная структурная единица, объединяющая их в единую регуляторную систему -полиаминовый модулон (Yoshida et al, 2004). Особенности молекулярной структуры полиаминов определяют их способность взаимодействовать с отрицательно заряженными компонентами клетки (Kashiwagi et al., 1986). Имеются данные о специфическом влиянии полиаминов па транскрипцию некоторых генов (Lindemose et al, 2005) и их участии в регуляции вторичной структуры тРНК, рРНК и мРНК (Igarashi, Kashiwagi, 2000). Эти свойства полиаминов, а также влияние, которое они оказывают на адаптацию клеток Escherichia coli к осмотическому, тепловому и другим видам стрессовых воздействий (Ткаченко и др., 1997, 1998; Ткаченко, Федотова, 2007), обосновывают необходимость изучения их роли при переходе бактериальной культуры к стационарной фазе роста и углеводному голоданию, в адаптации к кислотному стрессу и действию антибиотиков.

Цель настоящей работы - изучение роли иолиаминов в формировании множественной стрессорной устойчивости клеток Е. coli.

Основные задачи исследования:

  1. Исследовать влияние полиаминов на экспрессию rpoS в условиях перехода культуры Е. coli к стационарной фазе роста и голоданию по глюкозе.

  2. Оценить роль полиаминов в повышении устойчивости Е. coli к действию органических кислот.

  1. Изучить влияние различных стрессовых воздействий на уровень антибиотикорезистентности клеток Е. coli.

  2. Исследовать изменения экспрессии rpoS и внутриклеточного содержания полиаминов в условиях воздействия на клетки Е. coli различных антибиотиков.

  3. Оценить возможность участия полиаминов в регуляции пориновой проницаемости клеточной стенки Е. coli в условиях добавки антибиотиков.

Научная новизна. Установлено, что полиамины принимают участие в формировании адаптивного ответа Е. coli при переходе к стационарной фазе роста и углеводному голоданию, в условиях воздействия органических кислот и антибиотиков. Впервые показано участие полиаминов в ингибировании протеолиза и выявлена их положительная модулирующая активность в отношении экспрессии rpoS на уровнях транскрипции, трансляции и стабильности белка. С помощью сконструированного полиаминзависимого мутанта Е. coli, несущего rpoS::lacZ слияние, установлено усиление стимулирующего эффекта полиаминов на уровень экспрессии rpoS в ряду кадаверин—>путресции—>спермидин. На основании различий регуляторных эффектов полиамипов продемонстрирована их функциональная специализация в реализации адаптивных функций в условиях стресса. Показано, что путресцин и спсрмидин играют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, в то время как кадаверин выполняет функции ингибитора поринового транспорта.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Материалы диссертации используются в лекционном курсе «Адаптация микроорганизмов к стрессу» на кафедре микробиологии и иммунологии Пермского государственного университета. На их основе возможна разработка рекомендаций по профилактике развития сопряжённой с антибиотикотераиией множественной лекарственной устойчивости микроорганизмов.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Полиамины выполняют функции положительных модуляторов экспрессии rpoS, обеспечивая адаптацию клеток Е. coli к действию органических кислот, в условиях перехода к стационарной фазе роста и голодания по глюкозе.

  2. Резистентность клеток Е. coli к действию фторхинолоновых антибиотиков возрастает в условиях кислотного, осмотического и теплового стрессов.

  3. Полиамины повышают устойчивость Е. coli к действию Р-лактамных и фторхинолоновых антибиотиков, транспортируемых в цитоплазму через пориновые каналы, но не задействованы в адаптации к амииогликозидам, проникающим в клетку путём диффузии через липидиый бислой.

  4. В клетках Е. coli, подвергнутых действию (3-лактамных и фторхинолоновых антибиотиков путресцин и сперм идин выполняют роль положительных модуляторов экспрессии rpoS, тогда как у кадаверина преобладают функции ингибитора транспортной активности пориновых каналов.

Системы кислотоустойчивое Е. coli

Успех колонизации кишечника макрооргапизма энтеропатогенными и комменсальными штаммами Е. coli зависит от их способности преодолевать кислотный барьер желудка, то есть некоторое время существовать в условиях экстремально низких значений рН. Во время приема пищи рН желудка здорового человека составляет в среднем около 2,0 (Castanie-Cornet et al., 1999). Основной проблемой микроорганизма в этих условиях становится закисление цитоплазмы. В условиях, когда рЫ среды падает до 2,5, значение внутриклеточного рН снижается с 7,5 до 4,5 (Richard, Foster, 2004).

В кишечнике значение рН среды близко к нейтральному. Несмотря на это, населяющим его бактериям также приходится противостоять действию кислотного стресса. Его причиной в этом случае являются короткоцепочечные жирные кислоты. Они образуются в кишечнике как конечные продукты брожения в результате расщепления питательных субстратов коммепсальной микрофлорой в довольно большом количестве: от 70 до 130 мМ (Arnold etal, 2001, Wolfe, 2005).

Накопление короткоцепочечных жирных кислот, наряду с другими конечными продуктами метаболизма, наблюдается также во время роста культуры Е. coli на минеральной среде с глюкозой (Cummings, 1987). При этом в наибольших концентрациях образуются ацетат (Brown, 1977; Chang, 1999), формиат, D-лактат и сукцинат (el-Manci, 1989).

Эти слабые органические кислоты способны в протонированной форме проникать через цитоплазматическую мембрану и диссоциировать в цитоплазме, приводя к снижению внутриклеточного рН (Tramonti et ai, 2002) и накоплению в клетке соответствующих анионов (Salmond, 1984) даже при нейтральном рН среды (Cherrington, 1991). Такая аккумуляция анионов может, обеспечивая увеличение в клетке тургорного давления, привести к развитию осмотического стресса (Roe, 1998).

Поскольку для функционирования большинства ферментов оптимальными являются нейтральные или слабощелочные условия, закисление цитоплазмы приводит к их инактивации. При низких значениях рН цитоплазмы практически останавливается синтез белка, и протекают лишь немногие метаболические реакции (Richard, Foster, 2004). Другим отрицательным последствием накопления протонов внутри клетки является снижение электрохимического мембранного потенциала, что может привести к гибели бактерии от недостатка энергии.

Противостоять закисленню цитоплазмы и тем неблагоприятным последствиям, которые оно за собой влечет, бактерии могут, благодаря хорошо развитым системам кислотоустойчивое. Для Е. coli достоверно установлено наличие, по меньшей мере, четырех таких систем (Foster, 2004): 1) окислительная, 2) система декарбоксилирования глутамата, 3) аргининдекарбоксилазная и 4) лизиндекарбоксилазпая.

Первая система, называемая также глюкозорепрессируемой, индуцируется в условиях повышенной кислотности в стационарной фазе роста. Ее экспрессия управляется rpoS и цАМФ. Однако структурные компоненты и механизм действия этой системы до сих пор не известны (Castanie-Cornet et ai, 1999). Две последующие системы защиты изучены более полно, механизм их адаптивного действия основан на связывании протона в цитоплазме во время реакции декарбоксилирования аминокислот и выведении протонированных продуктов из клетки (Lin, 1995; Richard, Foster, 2004). В состав глутаматдекарбоксилазной системы кислотоустойчивости Е. coli входят две биохимически идентичные изоформы глутаматдекарбоксилазы (GadAB) и белок-переносчик (GadC), осуществляющий антипорт глутамата и у-аминобутирата (продукта реакции декарбоксилирования глутамата). Гены глутаматдекарбоксилазной системы объединены в 2 оперона: gadA и gadBC (Biase el al., 1999). Глутаматдекарбоксилазная система - предмет комплексной регуляции. В контроле ее экспрессии задействованы по меньшей мере 9 регуляторов: RpoS, RpoD, сенсор-регуляторпая пара EvgAS, ключевой регулятор LuxR-семейства GadE, два AraC-подобных регулятора GadX и GadW, а также H-NS ицАМФ(Ма д/., 2003а). Есть два основных пути регуляции экспрессии генов gadABC. Один из них включает GadE - активатор, который может связываться с участком, располагающимся выше обоих ж/-оперонов (Ma et al., 2003b). Экспрессия gadE регулируется двухкомпоисптіїой регуляторіюй системой EvgAS посредством прямого связывания с его промотором (Ma et al., 2003а). Второй, более сложный и эффективный способ, базируется на регуляторном влиянии транскрипционного активатора GadX, который способен индуцировать экспрессию gad-cwcvcuu, непосредственно связываясь с ДНК (Tramonti, 2002). GadW способен ингибировать экспрессию gadX (Ma et al., 2003a), но, связываясь с промоториой областью gadABC-генов, в некоторых условиях активирует их экспрессию (Ma et al., 2002). Роли этих регуляторов перекрываются, и предполагается, что GadX и GadW действуют совместно, объединяя различные сигналы, что ведет к активации генов Gad-системы (Tucker et al., 2003). Экспрессия gadX зависит от с субъединицы РНК-полимеразы, которая таким образом влияет на экспрессию gad-гепоп (Ma et al., 2002, Tramonti, 2002). H-NS и цАМФ вовлечены в регуляцию системы кислотоустойчивости посредством влияния на экспрессию гена rpoS (Ma et al., 2003a). Наряду с описанными, одним из факторов регуляции RpoS- и Gad-зависимых систем кислотоустойчивости является топоизомераза I, участвующая в релаксации суперспирализованной ДНК (Stewart, 2005). Система кислотоустойчивости основанная на декарбоксилировании аргинина до агматина, состоит из протонутилизирующей аргининдекарбоксилазы (AdiA) и транспортного белка, осуществляющего выброс продукта декарбоксилирования (агматина) из цитоплазмы и захват из окружающей среды аргинина (AdiC) (Iyer et al., 2003). Некоторые исследователи указывают на существование у Е. coli четвертой системы кислотоустойчивости, основанной на декарбоксилировании лизина (Iyer et al., 2003). Эта система представлена лизиндекарбоксилазой (CadA) и лизин-кадаверин антипортером (CadB). Снижение внешнего рН активирует регуляториый белок CadC, ответственный за индукцию ш і-оперона, за счет чего увеличивается содержание белков данной системы, обеспечивая синтез кадаверина и экскрецию его из клетки. Дскарбоксилироваиие лизина не оказывает выраженного влияния на уровень внутриклеточного рН, однако, способствует выживанию клеток в условиях повышенной кислотности. Это означает, что в основе защитного действия лизипдекарбоксилазной системы лежит другой механизм, отличный от декарбоксилирования глутамата или аргинина. Принимая во внимание, что полиамины могут ингибировать транспортную активность норинов, можно предположить, что в условиях закислення среды синтез кадаверина и экскреция его из клетки блокируют работу пориновых каналов, препятствуя проникновению протонов в цитоплазму и играя существенную роль в адаптации Е. coli к кислотному стрессу (Samartzidou et al., 2003). Однако роль полиаминов в кислотной адаптации Е. coli изучена крайне недостаточно.

Таким образом, работа амииоацилдекарбоксилазпых систем кислотоустойчивости приводит к блокированию транспорта протонов в клетку, нейтрализации их в цитоплазме и выведению избытка образовавшихся соединений в окружающую среду. Эти процессы обеспечивают повышение рН цитоплазмы и восстановление электрохимического градиента протонов, обеспечивая, в конечном итоге, выживание бактериальной клетки в условиях кислотного стресса.

Определение содержания полиаминов в клетке и среде

Концентрацию полиаминов определяли двумя методами: с помощью тонкослойной хроматографии (Чудинов и др., 1984) и ВЭЖХ с использованием жидкостного хроматографа высокого давления, модель LC-lOAvp (Shimadzu, Япония).

При использовании ТСХ аликвоты культуры (500 мкл) центрифугировали в течение 1 мин при 16000g. Надосадочную жидкость использовали для определения содержания полиаминов в среде. Клетки экстрагировали 0,4н НС104. К 100 мкл хлорнокислого экстракта, доведенного до рН 9,0 раствором Na2C03 (2М), добавляли 100 мкл раствора 1- диметиламинонафталин-5-сульфонилхлорида (дансил-хлорид) («Sigma», США) в ацетоне (2,7мг/мл) и инкубировали в течение 2 ч при 37С в темноте. Смесь выпаривали па концентраторе Concentrator 5301 («Eppendorf», Германия) и экстрагировали бензолом. Бензольные экстракты количественно наносили на силикагелевые пластины для тонкослойной хроматографии («Sorbfil», Россия) размером 100x100 мм и последовательно разделяли в двух системах растворителей: I - бензол - триэтиламин (20:2); II - бензол - метанол (10: 0,45). Высушенные хроматограммы фотографировали на цифровую камеру Olimpus С-3040 (Япония) в ультрафиолетовом свете, возбуждающем сине - зеленое свечение пятен дансил-полиаминов, величина и яркость которых были пропорциональны их концентрации. По результатам компьютерного денситометрирования снимков с использованием стандартной программы Adobe Photoshop 5,0 рассчитывали концентрацию полиаминов. Это было возможно благодаря нанесению на каждую пластину стандартных растворов полиаминов, проведенных через все этапы обработки. В качестве стандартных препаратов использовали: спермин х 4IIC1, спермидин х ЗЫС1, кадаверин х 2НС1, путресцин х 2IIC1 («Sigma», США).

При использовании ВЭЖХ подготовка проб перед анализом также включала экстракцию с последующей дериватизацией полиаминов с помощью реакции дансилирования (Чудинов и др., 1984). Разделение полиаминов осуществляли на колонке Luna С 18(2), размером 250x4,6 мм и диаметром частиц 5 мкм ("Phenomenex", США), при температуре 25С. Вода и ацетонитрил подавались на колонку со скоростью 1 мл/мин в линейном градиенте концентрации ацетонитрила от 40 до 100% в течение 35 минут с последующим уравновешиванием в течение 10 минут 40%-иым ацетонитрил ом. Детекцию даисилированных производных полиаминов проводили на проточном флуориметрическом детекторе RF-10AXL (Shimadzu, Япония) с установленной длиной волны возбуждения 400 им и эмиссии 516 нм. Подсчет концентрации полиаминов проводили по заранее определенным калибровочным коэффициентам и соотносили её с уровнем биомассы микроорганизмов, из которой экстрагированы пробы.

Выделение плазмидной ДНК проводили традиционным методом щелочного гидролиза (Харди, 1989). После отбора проб клетки Е. coli осаждали центрифугированием при 16000 g в течение 1 минуты при 4С и ресуспензировали в растворе, содержащем 25 мМ трис-НС1, 50 мМ глюкозы, 2 мМ ЭДТА, 2 мг/мл лизоцима (рН=8,0). Для окончательного лизиса клеток и гидролиза хромосомной ДНК добавляли 20% SDS и 40% NaOH, выдерживая смесь при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем вносили З М раствор ацетата натрия, доведенный до рН=4,8 ледяной уксусной кислотой, после чего пробы оставляли на ледяной бане на 10-40 минут до образования творожистого осадка, который отделяли центрифугированием в течение 15 минут (16000 g) при комнатной температуре. После внесения полиэтиленгликоля 6000 до получения 40%) его раствора пробы на 30 минут помещали в ледяную баню. После центрифугирования при 16000 g в течение 10 минут (2С), осадок растворяли в воде при комнатной температуре. Для получения более чистого препарата плазмидной ДНК проводили переосаждение раствором, содержащим 7,5 М CH3COONH4 (рН=7,5). Полученный творожистый осадок отделяли центрифугированием при комнатной температуре 10 минут при 16000 g. Супернатант переносили в чистую пробирку и добавляли 80% изопропанол до появления четкой интерфазы. Препарат плазмидной ДНК хранили при минус 10С. Перед использованием нуклеиновую кислоту осаждали центрифугированием при 16000 g 15 минут при 2С, промывали 70%) этанолом и растворяли в воде.

Для получения модифицированных штаммов R091 pBR322 и М2073 pBR322 с целью определения транспортной активности порипов Е. coli R091 и М2073, соответственно, трансформировали (Маниатис и др., 1984) плазмидой множественной лекарственной устойчивости pBR322, любезно предоставленной сотрудниками лаборатории физиологической генетики ВНИИ СПГУ. Для подготовки компетентных клеток культуру Е. coli выращивали в 250 мл колбе с 50 мл среды LB при 37С и интенсивном перемешивании до СЮбоо=0,2. Клетки культуры охлаждали на ледяной бане и осаждали центрифугированием 3000 об/мин 10 мин при 4С. Осадок ресуспензировали на ледяной бане в буфере для трансформации (50 мМ СаС12, 10 мМ трис-HCl рН=8,0). В суспензию вносили раствор плазмидной ДНК и инкубировали смесь 2 минуты при 42С, после чего добавляли среду LB и продолжали инкубацию 1 час при 37С. После трансформации клетки высевали на чашки Петри с селективной средой (LB-arap с добавлением ампициллина и тетрациклина). Выросшие на селективной среде колонии представляли собой потомство трансформированных клеток, устойчивых к действию антибиотиков стрептомицина, тетрациклина и ампициллина. Типичные колонии использовали для приготовления музейных культур на скошенном агаре.

Роль экзогенных полиаминов в регуляции транскрипции rpoS в зависимости от фазы роста периодической культуры Е. coli и глюкозного голодания

Повышение концентрации гибридного белка без элемента оборота происходит в более ранний период роста, чем при наличии этого фрагмента в молекуле. Однако затем, ещё в ранней стационарной фазе, отмечается её снижение до уровня, близкого к предстрессовому. Поддержание высокого уровня os в клетке в этот период развития культуры осуществляется уже за счёт стабилизации RpoS (рис. 3).

В условиях голодания трансляция rpoS увеличивается в значительно меньшей степени (различия статистически значимы при р 0,05), чем в нелимитироваиных по глюкозе культурах (рис. 3).

Сравнение параметров активации rpoSr.lacZ в штаммах Е. coli RO90 и R091, дает основание полагать, что начало экспрессии rpoS в экспоненциальной фазе роста обусловлено в первую очередь регуляторными процессами, происходящими на уровне трансляции, тогда как основной вклад в поддержание высокого содержания as в стационарной фазе дает регуляция стабильности белка. Об этом же свидетельствует двукратное возрастание уровня индукции rpoS в присутствии элемента оборота (табл.2.). В то же время уровень индукции трансляционного слияния с элементом оборота в два и более раза превышал таковой для транскрипционного, а величина его экспрессии по своим абсолютным значениям была на порядок выше (рис. 1, рис. 2 и рис. 3). Поэтому, хотя вклад транскрипции в увеличение количества белка а при переходе в стационарную фазу неоспорим, решающие события в регуляции as в клетке в этих условиях происходят на посттранскрипционном уровне с преимущественным вкладом блокирования протеолиза. Эти результаты полностью укладываются в общепринятую концепцию (Hengge-Aronis, 2002).

Известно, что основным объектом регуляции на посттранскрипционном уровне является вторичная структура мРНК rpoS, то есть участок спаренной двунитевой РНК, в который включен кодон инициации трансляции. При этом факторы, способствующие развертыванию вторичной структуры, делают кодон инициации доступным и таким образом стимулируют процесс трансляции (Hengge-Aronis, 2002). Указания на то, что полиамины могут выступать в качестве одного из таких факторов (Yoshida etal, 2001), послужили основанием для изучения их влияния на уровень экспрессии трансляционного rpoS слияния в периодических культурах Е. coli. Исследование воздействия путресцина на трансляционные слияния обоих типов показало его статистически значимый стимулирующий эффект на экспрессию rpoS, который был выше (независимо от содержания субстрата в среде) в присутствии элемента оборота (R091). В отсутствие данного фрагмента белка (RO90) эффект проявлялся только в отношении лимитированных по глюкозе культур (табл. 2). То есть, путресцин оказывает своё действие как на уровне трансляции, так и (в большей степени) - на уровне стабильности а .

Естественные колебания пула иолиаминов в клетках Е. coli в цикле развития периодической культуры (Ткаченко, Чудинов, 1989) послужили основанием для предположения, что величина отклика экспрессии rpoS на добавки экзогенного путресцина зависит от внутриклеточного содержания этого диамина в различных фазах роста. Результаты проверки этого предположения показали, что наибольшее воздействие на уровень белка о в клетке оказывало внесение путресцина в ранней экспоненциальной фазе при малых плотностях культуры (OD60o в пределах 0,1-0,2), когда содержание эндогенного путресцина было минимальным. По мере возрастания плотности культуры наблюдалось пропорциональное снижение эффекта экзогенного путресцина (рис. 4). Содержание иолиаминов в клетках при этом, напротив, возрастало от ранних к более поздним фазам роста. Следовательно, эффект экзогенно добавленного путресцина обратно пропорционален его содержанию в клетке.

Стимулирующий эффект путресцина имел концентрационную зависимость и достигал максимума при оптимальной концентрации 5-Ю мМ. Дальнейшее её повышение сопровождалось снижением эффекта (рис. 4). Сам по себе путресцин, по-видимому, не индуцирует экспрессию rpoS, однако его присутствие в клетке в достаточной концентрации к моменту начала активации является фактором, усиливающим на уровне трансляции и стабильности белка ответ адаптивных систем клетки к переходу в стационарную фазу.

Таким образом, полиамины участвуют в регуляции внутриклеточного содержания а -субъединицы РПК-нолимсразы Е. coll преимущественно на уровне стабильности белка. Эффект экзогенного путресцина зависит от его концентрации и наиболее выражен в ранних фазах роста периодической культуры, когда содержание эндогенных полиаминов в клетках минимально. По мере возрастания концентрации клеточного путресцина к более поздним фазам роста влияние его добавок на экспресиию rpoS снижается.

Количественное изучение регуляторного влияния полиаминов методом экзогенных добавок на генную экспрессию штаммов Е. coli дикого типа с ненарушенным синтезом этих соединений затруднено в связи с естественным колебанием их внутриклеточного содержания в цикле развития периодической культуры (рис. 4). С целью устранения этого недостатка на базе полиаминдефицитного мутанта Е. coli НТ306 (Tabor, 1980) нами сконструированы штаммы, несущие транскрипционное (Е coli SHT25/2) и трансляционное (Е. coli SHT03) rpoS::lacZ генные слияния, перенесённые в родительский штамм с помощью бактериофага X из клеток Е. coli RO200 и R091, соответственно.

Зависимость экспрессии rpoS от органических кислот как продуктов обмена Е. coli

Одним из откликов Е. coli на кислотный стресс является индукция экспрессии гена rpoS, кодирующего альтерЕіативную о -субъединицу РНК-полимеразы (Foster, 2004). В некоторых работах есть указания на то, что этот белок с помощью какого-то пока неизвестного механизма может участвовать в формировании множественной лекарственной устойчивости микроорганизмов (Greenway, 1999; Rami, 2005; Murakami, 2005).

Проведенные нами исследования (Главы 3 и 4 диссертации) показали, что в качестве положительных модуляторов экспрессии rpoS в условиях кислотного стресса выступают полиамины. Данные об их способности снижать проницаемость внешней мембраны Е. coli, блокируя активность пориновых каналов (Samartzidou, 2003), послужили нам основанием для предположения о том, что один из механизмов, формирующих множественную лекарственную устойчивость Е. coli и функционирующих, в том числе, во время кислотного стресса, может быть обусловлен модулируемой полиаминами индукцией синтеза а .

Для экспериментальной проверки этого предположения были выбраны антибиотики, относящиеся к разным классам и различающиеся как по механизму действия, так и по способу проникновения в клетку. Фторхинолоны левофлоксацип и пефлоксацин блокируют активность прокариотических ДНК-гиразы и топоизомеразы IV. Принадлежащие к цефалоспоринам (одна из групп р-лактамовых антибиотиков) цефотаксим и цефазолин действуют на синтез клеточной стенки бактерий. Как и фторхинолоны, они транспортируются в клетку преимущественно через пориновые каналы (Neves, 2005; Chorpa, Ball, 1982; Yamaguchi et al, 1985). Менее гидрофильный ампициллин, относящийся к Р-лактамовым антибиотикам группы пенициллина, способен поступать в клетку как через порины, так и путём прямой диффузии через мембрану (Yamaguchi et al., 1985). Транспорт нетромицина, представителя аминогликозидов, блокирующих синтез белка на рибосоме, осуществляется через липидный бислой внешней мембраны независимо от порииов (Chorpa, Ball, 1982; Tenson, Mankin, 2006).

Исследование чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводили на штаммах Е. coli М2073 и М2076. Оба они несут marRr.lacZ генное слияние, но в хромосоме М2076 отсутствует marRAB-onepon (Martin, 2002). Продукт одного из генов этого оперона, МагА, активирует синтез помп множественного лекарственного выброса АсгАВ и TolC (Martin, et al, 1996), одновременно способствуя снижению количества порина OmpF во внешней мембране Е. coli за счёт активации экспрессии micF, кодирующего антисмысловую РЫК для мРНК ompF (Delihas, Forst, 2001). Индукция синтеза АсгАВ, так же как и micF, может происходить и независимо от МагА (Ma, et al., 1995), однако в этом случае уровень её значительно ниже (Cohen, 1993). Таким образом, сравнительное исследование мутантного и немутантного по тагЯАВ-генж штаммов Е. coli даёт возможность дифференцировать роль помп множественного лекарственного выброса от других механизмов устойчивости к антибиотикам, в том числе находящихся под контролем RpoS. Для того, чтобы экспериментально проследить цепь предполагаемых причинно-следственных отношений полиамины — os — антибиотикорезистентность, использован сконструированный нами полиаминдефицитный штамм SIIT03, несущий трансляционное rpoS::lacZ генное слияние. Добавка путресцина в культуру этого штамма вызывала значительную, 80%-ную, стимуляцию экспрессии rpoS по сравнению с контролем (рис. 16). Сходный, хотя и менее выраженный, 40%-пый, эффект демонстрировал салицилат, способный, подобно ацетату, вызывать кислотный стресс (Rosner, Slonczewski, 1994). Одновременная добавка путресцина и салицилата приводила к суммации эффекта. Результаты определения минимальных ингибиторных концентраций (МИК) для левофлоксацина и пефлоксацина свидетельствуют о сильном положительном эффекте путресцина и салицилата на антбиотикоустойчивость и демонстрируют значительное сходство с воздействием этих соединений на уровень экспрессии rpoS (рис. 16). Это подтверждает высказанное выше предположение о том, что один из механизмов, формирующих множественную антибиотикоустойчивость, в том числе в условиях кислотного стресса, реализуется посредством влияния полиаминов па содержание в клетке о -субъединицы РНК-полимеразы. Поскольку индукция экспрессии rpoS описана для широкого спектра разнообразных стрессовых факторов (I Icnggc-Aronis, 2002), это послужило нам основанием для изучения антибиотикорезистентности Е. coli в условиях других стрессовых воздействий, которые сопровождаются возрастанием уровня ах-субъединицы РНК-полимеразы в клетке. Среди них осмотический и тепловой виды шока, а также кислотный стресс, вызванный сдвигом рН к более низким значениям с помощью добавления сильных кислот, таких как НС1. Осмотический стресс, который воспроизводили добавкой 0,25 М хлорида натрия, вызывал снижение чувствительности Е. coli к антибиотикам ряда фторхинолопов (лсвофлоксацин и нефлоксацин) и аминогликозидов (нетромицин), в то время как МИК цефалоспоринов (цефотаксим и цефазолин) не изменялась (рис. 17).

Похожие диссертации на Полиамины как фактор множественной стрессорной устойчивости Escherichia Coli