Введение к работе
Актуальность проблемы. Мелиоидоз - заболевание, вызываемое Burkholderia pseudomallei, относится к группе особо опасных инфекций и характеризуется высокой летальностью. Возбудитель мелиоидоза распространен в странах Юго-Восточной Азии и Австралии, хотя немногочисленные случаи мелиоидозной инфекции зарегистрированы на Филиппинах, Папуа Новой Гвинее, в Африке, Америке, Азии и Европе (Currie B.J. et al., 2000; Cheng A.C., Currie B.J., 2005). В современных условиях проблема мелиоидоза актуальна и для России в связи с ростом туризма, расширением культурных и экономических связей нашей страны с эндемичными по мелиоидозу регионами. Кроме того, возбудитель мелиоидоза, по данным международных экспертов, входит в список возможных агентов биотерроризма (Соепуе Т., Li-Puma J.J., 2003).
Несмотря на многолетние исследования по созданию химической мелиоидозной вакцины, эффективный профилактический препарат на сегодняшний день отсутствует, что связано как с низкой протективностыо различных мелиоидозных антигенов, так и с недостаточной изученностью механизмов иммунитета при мелиоидозе. Работами последнего десятилетия показана определяющая роль поверхностных антигенных комплексов возбудителя мелиоидоза в формировании резистентности к инфекции (Викторов Д.В., 1997; Пивень Н.Н., Илюхин В.И., 1981), однако их протективные свойства были недостаточными в защите от вирулентных мелиоидозных штаммов. В свете этих данных особую актуальность приобретает поиск новых иммуностимулирующих препаратов, а также разработка современных подходов к проблеме иммунорегуляции при мелиоидозе, в частности, изучение воздействия цитокинов на иммуногенные и протективные свойства антигенов В.pseudomallei.
В зарубежной литературе имеются работы, посвященные роли отдельных цитокинов в развитии инфекционного процесса при мелиоидозе. В частности, показано, что определение в крови уровней ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-6, ИЛ-10 имеет прогностическое значение для исхода мелиоидозной инфекции (Lauw F.N. et al., 1999; Simpson A.J. et al., 2000). Изучены количественные показатели различных цитокинов при остром и хроническом экспериментальном мелиоидозе у мышей, показана взаимосвязь высоты бактериемии с пиком продукции цитокинов клетками селезенки (Barnes J.L. et al., 2004). Многие исследователи указывают на важную роль ТЫ- цитокинов, отвечающих за формирование клеточного иммунитета, в патогенезе мелиоидоза (Barnes J.L. et al., 2004; Ketheesan N. et al., 2002), а также ранних провоспали-тельных цитокинов (Ulett G.C. et al., 2000).
Следует отметить, что все имеющиеся работы по изучению цитокинов при мелиоидозе посвящены их значению в инфекционном процессе, в то время как публикации о влиянии цитокинов на иммуногенные и протективные свойства мелиоидозных антигенов в процессе иммунопрофилактики мелиоидоза в доступной литературе отсутствует. Кроме того, достаточно важ- \
' J
ным, с научной и практической точки зрения, является изучение корреляционных связей между способностью мелиоидозных антигенов индуцировать продукцию определенных цитокинов и их протективными свойствами. Данное направление в изучении свойств антигенов В. pseudomallei при их скрининге на предмет отбора потенциальных компонентов химической вакцины, остается пока не исследованным.
Цель работы - повышение иммуногенньгх и протективных свойств антигенов B.pseudomallei цитокинами.
Задачи исследования:
Разработать модельную систему in vitro оценки токсичности антигенов B.pseudomallei с целью их использования для индукции цитокинов
Изучить биологическую активность цитокинов лимфоцитов и макрофагов, индуцированных антигенами буркхольдерии in vitro
Изучить взаимосвязь биологической активности монокинов и лим-фокинов с иммуногенными и протективными свойствами антигенов-индукторов
Исследовать влияние монокинов и лимфокинов на иммунный ответ экспериментальных животных к антигенам возбудителя мелиоидоза
Изучить возможность потенцирования специфического иммунитета к мелиоидозу препаратами рекомбинантных цитокинов
Разработать схему применения рекомбинантных цитокинов для стимуляции первичного и вторичного иммунного ответа к антигенам B.pseudomallei.
Научная новизна
Впервые определена взаимосвязь между цитокинивдуцирующей активностью антигенов буркхольдерии и их защитными свойствами, которая позволяет проводить скрининг протективных антигенов в клеточной системе in vitro по биологической активности лимфокинов и монокинов, индуцированных антигенами. На основе выявленных закономерностей разработан новый способ оценки уровня протективности мелиоидозных антигенов на культуре клеток L-929 по степени цитотоксической активности ФНО-ot монокинов, индуцированных антигенами in vitro.
Разработан новый чувствительный метод оценки токсичности мелиоидозных антигенов на инфузориях Paramecium caudatum по угнетению их выделительной функции, который характеризуется высокой чувствительностью, простотой, быстротой исполнения и возможностью регистрации токсического эффекта на физиологическом уровне. Данный метод позволяет быстро определять оптимальные дозы антигенов для индукции цитокинов in vitro.
Впервые показана возможность усиления иммуногенньгх и протективных свойств мелиоидозных антигенов с помощью лимфокинов и монокинов. Определена целесообразность применения монокинов для стимуляции первичного иммунного ответа, а лимфокинов - вторичного, что обеспечивает адекватную стимуляцию механизмов неспецифической резистентности и специфического Т-клеточного иммунитета.
Впервые показана возможность повышения иммуногенных и протек-тивных свойств мелиоидозных антигенов при их совместном применении с рекомбинантными цитокинами. Отмечена необходимость применения для стимуляции первичного иммунного ответа цитокинов, стимулирующих неспецифические клеточные реакции макроорганизма, а для повышения вторичного ответа — цитокинов, преимущественно влияющих на специфический Т-клеточный иммунный ответ. Разработан новый способ повышения протективности мелиоидозных антигенов рекомбинантными цитокинами, основанный на применении ИФН-у при первичной иммунизации антигенами и ИЛ-2 - при вторичной.
Приоритетность выполненных исследований подтверждена:
патентом на изобретение № 2281507 от 10.08.2006 г. «Способ оценки токсичности бактериальных антигенов» (авторы: Жукова СИ., Аделыиин Ф.К., Храпова Н.П., Пивень Н.Н., Прошина О.Б., Засядкина А.В., Плеханова Н.Г.);
патентном на изобретение № 2354400 от 10.05.2009 г. «Способ оценки уровня протективности мелиоидозных антигенов» (авторы: Прошина О.Б., Жукова СИ., Храпова Н.П., Авророва И.В., Пивень Н.Н., Ломова Л.В.).
По материалам диссертации направлена в Роспатент заявка на изобретение «Способ повышения протективности мелиоидозных антигенов цитокинами» № 2008127677 от 7.07.2008 г. (авторы: Жукова СИ., Демьянова О.Б., Авророва И.В., Алексеев В.В., Храпова Н.П., Ломова Л.В.).
Практическая ценность
По материалам исследования составлены:
«Методические рекомендации по изучению цитокининдуцирующей активности мелиоидозных антигенов» (утверждены директором института 21.12.2005г.), в которых приведены методические приемы, позволяющие определять показатели цитокининдуцирующей активности антигенов, коррелирующие с их защитными свойствами: фагоцитарную активность макрофагов под действием лимфокинов, степень экспрессии Fc-рецепторов на поверхности нейтрофилов под действием монокинов и уровень цитотоксической активности ФНО-а монокинов на перевиваемой клеточной линии мышиных фибробластов L-929. Предложенные методы позволяют проводить скрининг мелиоидозных антигенов на протективность без значительных временных и материальных затрат, связанных с иммунизацией и заражением животных при определении протективности в стандартном тесте активной защиты на животных.
«Методические рекомендации по применению цитокинов для усиления иммунного ответа при мелиоидозе» (утверждены директором института 24.12.2008 г.), в которых изложены методические приемы по использованию препаратов рекомбинантных цитокинов ИФН-у и ИЛ-2 для стимуляции иммунного ответа на мелиоидозные антигены в экспериментах на мышах и крысах и приведены тесты оценки клеточного и гуморального иммунитета,
по которым можно определять степень воздействия препаратов на иммунную систему животных.
Полученные данные представляют интерес для сотрудников научно-исследовательских лабораторий, занимающихся вопросами иммунопрофилактики особо опасных инфекций, и могут быть использованы при разработке средств защиты от мелиоидоза.
Материалы диссертационной работы включены в цикл лекций по диагностике, лечению и профилактике особо опасных инфекций на курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Протективность мелиоидозных антигенов связана с их цитокининду-
цирующей активностью.в отношении макрофагов и лимфоцитов: выражен
ностью экспрессии Fc-рецешоров на поверхности нейтрофилов под влиянием
монокинов, степенью цитотоксичности ФНО-а монокинов для фибробластов
L-929 и фагоцитарной активностью макрофагов под действием лимфокинов.
2. Предложен метод оценки уровня протективности антигенов
B.pseudomallei на культуре клеток L-929 по степени цитоксического действия
ФНО-а монокинов, индуцированных антигенами in vitro, позволяющий про
водить предварительную оценку защитных свойств антигенов без сущест
венных временных и материальных затрат.
Для индукции цитокинов in vitro необходимо использовать адекватные дозы мелиоидозных антигенов, не оказывающие повреждающего действия на иммунокомпетентные клетки. Разработан высокочувствительный способ оценки токсичности антигенов на инфузориях Paramecium caudatum, позволяющий определять минимальную токсичность на физиологическом уровне по угнетению выделительной функции простейших.
С целью оптимальной стимуляции механизмов клеточного иммунитета первичную иммунизацию антигенами возбудителя мелиоидоза целесообразно сочетать с введением монокинов, а вторичную - лимфокинов.
Рекомбинантные цитокины могут быть использованы для повышения иммуногенных и протективных свойств антигенов B.pseudomallei. Оптимальной схемой стимуляции иммунного ответа на мелиоидозные антигены является использование при первичной иммунизации ИФНху, а при вторичной-ИЛ-2.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на конференции молодых ученых Волгоградского НИПЧИ (18.06.2004 г.), итоговой научной конференции Волгоградского НИПЧИ (27.05.2005 г.), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопас-
ности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (13-14.09.2005 г, г. Волгоград), VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ» (3-5.10.2006 г., г. Оболенск), IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ» (30.09 -2.10.2008 г., г. Волгоград).
Публикации: Основные положения диссертации отражены в 16 печатных работах, из них 5 - в ведущих рецензируемых научных изданиях.
Структура и объем работы: диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 рисунками и 18 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Список использованных источников литературы включает 200 работ (99 отечественных и 101 зарубежных).
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")
