Введение к работе
Актуальность темы. Существование бактерий в природных экосистемах сопряжено с запрограммированными и ^запрограммированными в цикле их развития стрессами, обусловленными воздействием целого ряда физических, химических и биологических факторов (Баснакьян, 2003). Эти ситуации предопределили возникновение у бактерий разнообразных «активных» и «пассивных» механизмов стрессоустойчивости, обеспечивающих сохранение жизнеспособности клеток в неблагоприятных условиях среды обитания (Ткаченко, 2012).
Важную роль в устойчивости бактерий к стрессорным факторам играют индуцибельные защитные системы, относительно специфично «запускающиеся» в ответ на определенные воздействия и приводящие к активации транскрипции адекватных природе и интенсивности воздействующего фактора групп генов -регулонов, с образованием соответствующих защитных продуктов (Schumann, 2006). В частности, значимой системой, противодействующей воздействию температурного фактора, являются белки теплового шока (БТШ), представленные молекулярными шаперонами и шаперонинами, удерживающими белки от денатурации, а также способствующими восстановлению их структуры в процессе рефолдинга (Smith, 2013). Аналогичным образом устроены система сохранения бактериального генома (^С^-система), активируемая при повреждении ДНК и включающая широкий спектр ферментов ее репарации (Janion, 2008), а также поликомпонентная система защиты бактерий от воздействия активных форм кислорода (Chiang, Schellhorn, 2012).
Другой аспект устойчивости бактерий к стрессам связан с реализацией
биологической активности видонеспецифичных низкомолекулярных
ауторегуляторов, в отечественной литературе традиционно обозначаемых как алкилоксибензолы (АОБ) (Эль-Регистан и др., 2006), а в англоязычной - как резорцинольные липиды или алкилрезорцины (Stasiuk, Kozubek, 2010). Совокупность ранее проведенных исследований позволила оценить алкилоксибензолы как важные бактериальные адаптогены, биосинтез которых активизируется стрессорными воздействиями (El-Registan et al., 2005). В свою очередь спектр биологической активности АОБ включает стабилизацию широкого круга биополимеров, включающего белки (Коротина, Крупянский, 2008) и нуклеиновые кислоты (Давыдова и др., 2005), а также реализацию присущей им антиоксидантной активности (Николаев, 2011).Одновременно накапливающиеся данные свидетельствуют о потенциальном участии АОБ в регуляции экспрессии стрессовых регулонов, что может рассматриваться в качестве дополнительного механизма популяционного контроля развития стрессового ответа (Miche et al., 2003; Голод и др., 2009).
Однако, до настоящего времени целостная картина взаимоотношений между названными активными и пассивными механизмами антистрессовой защиты бактериальной клетки с участием алкилоксибензолов отсутствует. При этом важным условием для решения этой задачи представляется использование высокочувствительных репортерных бактериальных тест-систем, в частности на основе развития бактериального свечения (биолюминесценции), позволяющих в режиме реального времени оценивать экспрессию стрессовых генов.
Цель работы - изучить влияния алкилоксибензолов (химических аналогов ауторегуляторных факторов микроорганизмов) на стрессовый ответ бактериальных клеток при различных экстремальных воздействиях, оцененный с использованием специфически индуцируемых люминесцирующих тест-систем.
Задачи исследования:
-
Определить влияние алкилоксибензолов на процессы термоденатурации и шаперон-независимого рефолдинга ферментных белков, а также индуцируемый воздействием температурного фактора синтез белков теплового шока.
-
Изучить воздействие алкилоксибензолов на чувствительность ДНК к УФ-облучению, а также индуцируемый повреждением ДНК ^О^-ответ бактериальных клеток при подобном воздействии.
-
Оценить соответствие между прямой антирадикальной активностью алкилоксибензолов и их влиянием на индукцию soxS регулона в условиях окислительного стресса.
Научная новизна
Впервые проведено сравнение двух механизмов биологической активности алкилоксибензолов (АОБ), определяемых непосредственным участием в стабилизации биополимеров при воздействии физических (температура, УФ-излучение) и химических (окисление) факторов, а также их опосредованным влиянием на уровень экспрессии соответствующих стрессовых регулонов.
Установлены эффекты АОБ на чувствительность белков к денатурирующему температурному воздействию, выраженность и направленность которых определяются длиной алкильного радикала в их молекулах. Показана протекторная активность короткоцепочечных (Сі-Сз) АОБ, заключающаяся в защите ферментных белков от термоденатурации, частичном повышении эффективности шаперон-независимого рефолдинга, а также сохранении жизнеспособности бактерий при относительно низких уровнях индукции БТШ. С другой стороны, эффект длинноцепочечных (С5-С12) АОБ зависел от их действующих концентраций: в диапазоне 10" -10" М они проявляли термопротекторную активность на фоне умеренно выраженной индукции БТШ, в то время как в диапазоне 10" -10" М вели к значительному повышению термочувствительности ферментных белков и бактерий с одновременной репрессией синтеза БТШ.
Получены новые данные о прямых фотопротекторных эффектах АОБ при УФ-облучении, заключающихся в предупреждении одно- и двуцепочечных разрывов молекул ДНК. В условиях интенсивного (сублетального) УФ-облучения АОБ в большинстве случаев снижали относительную активность ^С^-ответа, тем не менее, повышая выживаемость бактерий при подобном воздействии с одновременным увеличением частоты диссоциативных S^R переходов.
Установлена прямая антирадикальная активность длинноцепочечных гомологов АОБ, функционирующих в качестве «перехватчиков» супероксид-аниона. В свою очередь в клеточной тест-системе эффекты АОБ заключались в умеренно выраженной индукции soxS регулона, увеличивающейся при использовании их предварительно окисленных продуктов. Следствием этих процессов является предадаптация к окислительному стрессу, проявляющаяся в
увеличении относительного количества выживших клеток при более низких уровнях индукции soxS регулона.
Совокупность полученных результатов впервые позволила оценить универсальность действия АОБ в условиях стрессоров различной природы, заключающуюся в концентрационно-зависимой индукции/ингибировании стрессовых регулонов. При этом низкие концентрации АОБ наиболее типично индуцируют стрессовый ответ бактериальных клеток, что характеризует их как «алармоны» (сигналы тревоги), предадаптирующие бактериальные клетки к последующему воздействию экстремальных физических и химических факторов. В свою очередь высокие концентрации АОБ преимущественно ведут к репрессии стрессового ответа, тем не менее, сохраняя жизнеспособность бактериальных клеток за счет непосредственной стабилизации входящих в них биополимеров.
Теоретическая и практическая значимость
Выявление молекулярных механизмов регуляции стрессового ответа бактериальных клеток, в том числе реализуемых с участием образуемых и воспринимаемых ими ауторегуляторов - алкилоксибензолов, представляет значительный интерес для микробиологии, биотехнологии и биомедицины.
Полученные результаты, свидетельствующие о влиянии АОБ на процессы позитивной и негативной регуляции стрессовых регулонов с последующим формированием устойчивости к экстремальным воздействиям, потенциально могут быть использованы в качестве основы для разработки новых подходов к длительному сохранению микроорганизмов в биотехнологических системах, а также в составе лечебно-профилактических препаратов.
Обнаруженные прямые термо-, фотопротекторные и антиоксидантные эффекты АОБ определяют перспективу их использования в качестве стабилизаторов функциональных биополимеров на этапах выделения и длительного хранения. В частности, выявленный в рамках настоящей работы выраженный фотопротекторный эффект Сб-АОБ положен в основу «Способа защиты ДНК от ультрафиолетового излучения при детекции результатов гель-электрофореза» (патент РФ на изобретение № 2465576 от 27.10.2012 г.), ориентированного на защиту структурной целостности и функциональной активности данного биополимера при УФ-детекции в агарозных гелях.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Алкилоксибензолы изменяют чувствительность бактериальных клеток к температурному воздействию через сочетанное влияние на термочувствительность входящих в их структуру белков, а также модуляцию уровня экспрессии белков теплового шока. Короткоцепочечные гомологи АОБ проявляют себя как термопротекторы, защищающие белки от денатурации, повышающие эффективность их рефолдинга, а также сохраняющие жизнеспособность бактериальных клеток при низких уровнях индукции белков теплового шока.
-
Алкилоксибензолы (преимущественно их длинноцепочечные гомологи) защищают бактериальные клетки от сублетального действия УФ-излучения, что при подавлении экспрессии ДО^-ответа реализуется через прямые фотопротекторные эффекты в отношении ДНК.
3. Алкилоксибензолы проявляют способность выступать в качестве перехватчиков супероксид аниона, что прогрессирует с увеличением длины алкильного радикала. В клеточной системе АОБ (особенно их предварительно окисленные продукты) индуцируют экспрессию soxS регулона. Результатом сочетанной активности АОБ является защита бактериальных клеток от окислительного стресса.
Связь автора с выполнением научных программ и собственный вклад автора
Исследования выполнены в рамках Федеральной целевой программы
«Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (ГК №П327
«Использование люминесцирующих клеточных тест-систем при оценке
механизмов активности бактерицидных и бактериорегуляторных молекул»);
Государственного задания на выполнение НИР №4.2312.2011 «Исследование
эффектов бактериальных ауторегуляторов (алкилоксибензолов и
гомосеринлактонов) в гомологичных и гетерологичных системах», а также при поддержке гранта Оренбургской области для аспирантов в сфере научной и научно-технической деятельности «Протекторные свойства акилоксибензолов природного и растительного происхождения в условиях окислительного и УФ-радиационного стресса».
Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.
Апробация работы
Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на V и VI Всероссийских конференциях молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов; 2010, 2012); VII Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва; 2011); I Всероссийской с международным участием, конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь; 2011).
Экспонат «Технология сохранения функциональных свойств биополимеров для проведения диагностических исследований» награжден дипломом V Российского форума «Российским инновациям - российский капитал» (Нижний Новгород, 2012).
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, глава в коллективной монографии; получен 1 патент РФ на изобретение.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, включая обзор литературы, описание материалов и методов, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 166 источника отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 17 рисунками.
![Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс]](/i/i/4289/212277.png "Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы [Электронный ресурс] Тучков Игорь Витальевич")
