Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1. Элементы систем регуляции биосинтеза антибиотиков
1.1. Принцип организации генов биосинтеза антибиотиков 6-7
1.2. Роль А-фактора в регуляции биосинтеза антибиотических структур 7-12
1.3. Распространение регуляторов, подобных А-фактору, среди стрептомицетов и других микроорганизмов 12-14
1.4. Роль гена устойчивости в регуляции антибиотической продукции 14-16
1.5. Механизмы инициации и системы генетического контроля биосинтеза антибиотиков у Streptomyces. 16-23
2. Методы клеточной и генной инженерии для получения новых антибиотиков и повышения продуктивности штаммов Streptomyces
2.1. Методы клеточной инженерии. 23-24
2.2. Методы генной инженерии
а) использование ДНК-зондов для обнаружения потенциальных продуцентов 24-25
б) использование клонированных генов вторичного метаболизма для повышения продуктивности штаммов 25-26
в) гибридные антибиотики 26-28
3. Антибиотики макротетролиды
3.1. Строение и физико-химические свойства. 28-31
3.2. Биосинтез 31-33
3.3. Строение и физико-химические свойства 28-31
3.4. Биосинтез 31-33
3.5. Антибиотическое действие и применение 33-35
4. Продигнозины
4.1. Строение и физико-химические свойства 36-37
4.2. Биосинтез 37-39
4.3. Антибиотическое действие и применение 39-40
5. Заключение и задачи исследований 40-41
ГЛАВА 2. Материалы и методы
2.1. Объекты исследования 42
2.2. Среды и условия культивирования 42-43
2.3. Определение уровня и типов устойчивости к антибиотикам стрептомицетных штаммов 43-44
2.4. Трансформация 44
2.5. Выделение экстрохромосомной ДНК 44-45
2.6. Выделение антибиотических веществ 45
2.7. Реактивы и приборы 46
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1. Выбор объекта исследования 48-51
3.2. Определение типов устойчивости к актиномицину исходного типового штамма 51-52
3.3 Трансформация протопластов S. werraensis 1365 плазмидой pIJ702 (act^ и анализ трансформантов:
а) электрофоретический анализ экстрохромосомной ДНК трансформанта 52-56
б) изучение антибиотической активности и антибиотического
исходного типового штамма 60-62
3.5. Выделение полученных антибиотических веществ из штамма- -трансформанта 62-64
3.6. Идентификация компонента X. 64-69
3.7. Идентификация компонента А. 70-73
3.8. Идентификация компонента В 73-76
3.9. Изучение некоторых физико-химических характеристик компонента С .76-77
3.10. Поиск эндогенных регуляторов типа А-фактора среди исследуемых
стрептомицетных штаммов 77-79
Заключение 80-82
Выводы 83
Литература
- Принцип организации генов биосинтеза антибиотиков
- использование ДНК-зондов для обнаружения потенциальных продуцентов
- Строение и физико-химические свойства
- Определение уровня и типов устойчивости к антибиотикам стрептомицетных штаммов
Введение к работе
Актиномицеты являются одними из важнейших продуцентов антибиотиков, ферментов и ингибиторов ферментов. По данным А. Л. Демеин (США), актиномицеты образуют около 70% известных антибиотических веществ. Мировой рынок включает 160 данных препаратов на сумму 23 миллиарда $. За последние несколько лет охарактеризовано более 1000 новых вторичных метаболитов актиномицетов. Представители данной группы микроорганизмов являются так же основными промышленными продуцентами аминокислот и нуклеотидов (глутамат, лизин, треанин, изолейцин, фенилаланин, триптофан, 5'-гуаниловая кислота) (Дудник, 1998; Robinson, 1999).
Основой получения новых групп природных антибиотиков, в последующие 50 лет после открытия пенициллина, был эмпирический поиск. Однако, к началу 60-х годов открытие природных антибиотиков резко замедлилось, поскольку работы по скринингу требовали колоссальных затрат и много времени. Установление молекулярно-биологических механизмов действия антибиотиков позволило эмпирический подход заменить рациональным. Для скрининга новых продуцентов и новых антибиотических веществ все большее значение уделялось развитию нетрадиционных методов, ориентированных на поиск потенциальных продуцентов среди известных культур стрептомицетов с применением последних достижений генной и клеточной инженерии.
Актиномицеты рода Streptomyces - почвенные грамположительные бактерии. Характерной особенностью, отличающей стрептомицеты от большинства прокариотических микроорганизмов, является наличие в их жизненном цикле нескольких стадий дифференциации, включающем стадии полигеномного мицелия и гаплоидных спор. Данная особенность обусловлена более сложной структурой и функциональной организацией генома стрептомицетов (Fisher et. al., 1997; Huang et. al., 1998; Volff, Altenbuchner, 1998). Прослежена тесная взаимосвязь между прохождением актиномицетами определенных стадий дифференциации и образованием большого разнообразия продуктов первичного и вторичного метаболизма (Chater, 1998). Осуществление программ жизненного цикла у стрептомицетов предполагает активирование генов, детерминирующих процесс перехода от первичного к вторичному метаболизму. Исследование механизмов, обеспечивающих дифференциальную экспрессию генов первичного и вторичного метаболизма, а также компонентов системы регуляции, принимающих участие в их переключении имеет общенаучное и прикладное значение (Chater, 1993; Chater, 1998; Robinson, 1999).
Известно, что многие стрептомицетные штаммы способны к одновременному биосинтезу различных по химической структуре биологически активных веществ, например, поликетидных макротетролидов и полипептидных антибиотиков (Филипова, 1973; Нефелова и др., 1985; Nichimura et. al., 1964; Malpartida et. al., 1987). Наличие общих предшественников биосинтеза данных антибиотических веществ, наряду, с предполагаемым подобием контролирующих этот процесс генетических структур, позволяет выдвинуть предположение о существовании у Streptomyces общих механизмов, регулирующих биосинтез пептидных и поликетидных антибиотиков. В этой связи интересны предположения ряда авторов о том, что продукт гена устойчивости может выполнять две биохимически различные функции. Помимо защиты микроорганизма от образуемого им антибиотика, он является компонентом системы, принимающей участие в активации генов биосинтеза антибиотических веществ на стадии образования предшественников (Hopwood, 1988; Geislich et. al., 1992; Guilfoile, Hutchinson, 1992). В работах последних лет имеются эксперементальные данные о влиянии генов устойчивости к антибиотикам на антибиотический профиль стрептомицетного штамма продуцента (Shima et. al., 1996; Zhao et. al., 1998). Полученные результаты подтверждают теорию о том, что ген устойчивости может выполнять функцию контролирующего механизма инициации антибиотикообразования (Guilfoile, Hutchinson, 1992). Однако, на сегодняшний день, сведения, подтверждающие данное предположение незначительны и нет четкого представления о механизме этого процесса. Работы, проводимые в этом направлении актуальны, так как расширяют границы поиска потенциальных продуцентов антибиотиков среди известных культур Streptomyces.
Принцип организации генов биосинтеза антибиотиков
Установлено, что комплексы структурных генов и оперонов биосинтеза антибиотических веществ представляют собой кластеры (Chater К., 1984; Chater К., 1990). Классический объект генетических исследований Streptomyces - S. coelicolor А(3)2 - образует, по крайней мере, четыре вещества, обладающих антибиотической активностью: актинородин, ундецилпродигиозин, метиленомицин и мало изученный пептидный "кальций-зависимый антибиотик". Для последнего установлен нерибосомальный тип биосинтеза (Champness W. et. al., 1992; Chonget. al., 1998). Таким образом, штамм S.coelicolor А(3)2 способен к одновременному образованию различных по химическому строению антибиотических веществ, включая пептидную ("кальций-зависимый антибиотик") и поликетидную структуры (актинородин). Для первых трех было проведено детальное клонирование и рестрикционно-генетическое картирование сцепленных генетических детерминантов (Malpartida et. al., 1992; Hopwood et. al., 1994; Martin et. al., 1997). Кластерная организация генов биосинтеза антибиотиков может быть связана, с одной стороны, с их латеральным межвидовым распространением, например, с помощью трансмиссивных плазмид, умеренных фагов и транспозирующих элементов (Kinashi et. al., 1992). С другой стороны, кластерная организация способствует координированной экспрессии, регуляции и эволюции этих генов в составе генома организма-продуцента, как и в случае описанных у бактерий систем оперонного типа.
Большинство из изученных кластеров генов биосинтеза антибиотиков содержат структурные гены, которые кодируют ферменты биосинтеза соответствующих антибиотиков, и гены устойчивости. Кроме того, подобные кластеры содержат и специфические регуляторные гены, контролирующие работу структурных генов и генов устойчивости. В стандартном реципиентном штамме S. lividans 66 обнаружено несколько генов, обеспечивающих устойчивость к собственному антибиотику с помощью ряда различных механизмов (Caballero et. al., 1991). Гены в составе кластеров, как правило, бывают организованы в подсистемы оперонного типа.
Имеются данные, что транскрипция различных оперонов внутри кластера подчиняется определенной временной закономерности и, очевидно, может по-разному регулироваться (Holt et. al., 1992; Hopwood et. al., 1994). При использовании методов сиквенирования и компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК кластеров генов биосинтеза антибиотиков у Streptomyces была показана высокая степень подобия отдельных генов и их взаимного расположения (организации транскрипционных единиц) в кластерах, определяющих синтез аналогичных, родственных или сходных по структуре антибиотиков (Нага et. al., 1991; Distler et. al., 1992; August et.al, 1998; Chen et.al., 1999). Более того, значительные совпадения были обнаружены не только между кластерами генов биосинтеза родственных антибиотиков у разных видов Streptomyces, но и между соответственными генетическими структурами синтеза аналогичных или родственных антибиотиков стрептомицетов и эволюционно от них удаленных организмов, например низших грибов (Lancini, Lozensetti, 1993; Smith et. al., 1990). Обнаруженные сходства могут отражать единство источника происхождения кластеров биосинтеза родственных антибиотиков и их латеральное распространение между видами. Эти сходства так же могут являться результатом конвергентной эволюции генов. В этом случае кластерная система организации обеспечивает наиболее эффективное функционирование соответствующих генетических детерминантов биосинтеза антибиотиков. Различия в макро- и микроструктурах кластеров генов биосинтеза родственных и аналогичных антибиотиков может свидетельствовать в пользу конвергентного пути их эволюции у разных видов микроорганизмов (Distler et. al., 1992; Lancini and Lozensetti, 1993; Chen et. al., 1999).
В настоящее время происходит накопление экспериментальных данных относительно механизмов глобальной регуляции антибиотикообразования как одного из проявлений вторичного метаболизма у Streptomyces.
Значительные успехи на этом пути достигнуты при изучении механизма инициации кластера генов биосинтеза стрептомицина в штамме S. griseus в лаборатории Беппу (Япония) (Horinouchi, Beppu, 1992). Основой для этих исследований послужили работы группы Хохлова, открывшей и описавшей низкомолекулярное вещество семейства бутиролактонов - А-фактор (Хохлов и др., 1967; Khokhlov, 1982). Было обнаружено, что многие мутанты S. griseus 1439, утратившие способность образовывать воздушный мицелий, споры и синтезировать стрептомицин, способны восстанавливать эти признаки при совместном культивировании со спорулирующими культурами S. griseus, выделяющими в среду А-фактор в концентрациях 10"9М.
Был выявлен мутантный штамм S. griseus 2247, который не требует А-фактора для продукции стрептомицина и споруляции, и в котором не обнаружен А-факторный белок (Horinouchi, Beppu, 1992).
В химическом отношении А-фактор представляет собой 2-(6 0-метилгептоноил)-311-гидроксиметил-4 бутиролактон (рис.1). Впервые структурная формула А-фактора была установлена Е.М. Клейнером с сотрудниками в 1976г. Год спустя этими же исследователями был осуществлён химический синтез рацемического А-фактора и его гомологов (Егоров, 1994).
использование ДНК-зондов для обнаружения потенциальных продуцентов
В настоящее время получает все большее развитие метод скрининга потенциальных продуцентов антибиотических веществ, основанный на последних достижениях генноинженерных разработок. Существует теория, согласно которой если ферменты в биосинтезе различных антибиотиков имеют общее эволюционное начало, то и клонированная ДНК, кодирующая один фермент, может быть использована в качестве гибридизационного зонда для изоляции других (Malpartida et. al., 1987). Были клонированы гены биосинтеза поликетидного антибиотика актинородина из S. coelicolor. С помощью анализа мутантов с нарушенным синтезом актинородина, определения их способности к косинтезу антибиотика и генетического картирования в хромосоме S. coelicolor А3(2)?была локализована группа (кластер) сцепленных генов act. В мутантах классов 1 и 3 были блокированы ранние шаги актинородинового биосинтеза. Пробы ДНК, содержащие клонированные участки actl и actlll были гибридизованы с обработанной рестриктазами ДНК из 25 стрептомицетных штаммов. Представляет интерес тот факт, что некоторые стрептомицетные штаммы в норме не продуцирующие актинородин, содержат последовательности ДНКггибридизующиеся с зондом. Положительный ответ гибридизации был получен для 14 из 18 известных продуцентов поликетидов (в частности и для продуцента нонактина S. griseus ЕТНА7796), и для продуцентов актиномицина: S. parviiliis АТСС12434 и S. antibioticus IMRU3720. Было показано, что S. parvulus, в норме являющимся продуцентом актиномицина, при блокировке биосинтеза этого антибиотика начинает синтезировать поликетид нонактин (Malpartida et. al., 1987).
С использованием зондов actl и actlll были изолированы гомологичные последовательности, кодирующие гранатицин поликетидсинтазные гены (pKS-гены) из S. violaceoniber, милбеомицин pKS-тепы из S. hygroscopicus, монензин pKS-гены vaS. cinnamonensis (Malpartida et. al., 1987). Эти же зонды были использованы для обнаружения подобных последовательностей у S. griseus (Iu et. al., 1994; Hopwood, 1994). С использованием actl и actlll зондов были изолированы гомологичные последовательности ДНК у продуцентов калафунгина S. tanashiensis (интермедиат актинородинового биосинтеза), и продуцента нанаомицина S. sp. ОМ-173 (Kakinuma et. al., 1991).
Зонды actl и actl 11 используются для идентификации бактериальных PKS-теноъ, которые имеются не только у актиномицетов, но и у грамотрицательных микроорганизмов Myxobacterium (продуцент макролидного антибиотика софарена) (Schupp et. al., 1995).
В принципе приведенная стратегия для поликетидов может быть использована и для других химических классов антибиотиков. Например, ген р-аминобензойной синтетазы (pabS), участвующий в биосинтезе кандицидина, был использован в качестве гибридизационного зонда для обнаружения новых продуцентов ароматических полиенов среди стрептомицетных штаммов (Gil et. al., 1990). Из продуцента стрептомицина S. griseus, были клонированы гены, принимающие участие в биосинтезе 6-деоксигексозы (6ДОН) дегидрострептозы. Эти зонды были использованы для обнаружения в геномах других стрептомицетов генов, кодирующих образование этого фермента, принимающего участие в образовании всех основных химических групп: пептидов, поликетидов, нуклеозидов и аминогликозидов (Stockman, Piepersberg, 1992).
б) Использование клонированных генов вторичного метаболизма для получения новых продуктов
Выделение генов путей биосинтеза антибиотиков позволило проверить гипотезу о возможности образования новых антибиотических структур при переносе генов биосинтеза из одного штамма в другие (Hopwood et. al., 1985а; McDaniel et. al., 1995; Fu et. al., 1996; Kuczek et. al., 1997).
К настоящему времени, клонировано большое количество регуляторных и структурных генов различных классов антибиотиков (Hopwood, 1997; Prado et. al., 1999). Довольно часто эти гены используются для решения задач в области увеличения антибиотической продуктивности стрептомицетных штаммов. Например, введение нескольких копий actll-orf4 регуляторного гена в продуцент актинородина S. coelicolor увеличивает антибиотическую продукцию в 30-40 раз (Hopwood, Kieser, 1986; Fernandez-Moreno et. al., 1992). Более чем 100-кратное увеличение продукции е-родомицинона (интермедиат доксорубицинового биосинтеза) и 10-кратное увеличение продукции даунорубицина происходит при введении в дикий штамм S. pettceticus АТСС 29050 dnrRl и dnrR2 регуляторных генов (Stutzman-Engwall et. al., 1992). Введение tcm KLM-кетоацил: АСР синтазного гена и гена, кодирующего АСР (ацилпереносящий белок) в тетраценомицин (Tcm)- продуцирующий штамм S.glcmcescens увеличивает в 2-30 раз продукцию антибиотика и его интермедиата (Decker, Hutchinson, 1993; Decker et. al., 1994). Был клонирован ген smrR из S. ambofaciens кодирующий белок активатор SmrR, который повышает эффективность транскрипции генов биосинтеза макролидов (Ramachandra et. al., 1996). Все эти работы с использованием клонированных генов резистентности и генов биосинтеза антибиотиков направлены на увеличение продуктивности стрептомицетных штаммов. Однако в ряде случаев при использовании этого метода наблюдается образование новых антибиотических веществ, не характерных для штамма-реципиента. Так, например, было обнаружено образование новых поликетидных структур при введении всех или части клонированных генов биосинтеза в штаммы, которые образуют в норме гранатицин и медермицин (Hopwood et. al., 1985а; Khosla et. al., 1993).
Строение и физико-химические свойства
Макротетролиды представляют собой 32-членные циклы, имеющие четыре сложноэфирные связи и четыре тетрогидрофурановых кольца с простыми эфирными связями. Молекула имеет четыре метальных заместителя и четыре радикала, которые в случае нонактина представлены метальными группами. Их последовательное замещение на этильные и изопропильные остатки приводит к высшим гомологам (рис.5).
Антибиотики-макротетролиды - оптически неактивные соединения, состоящие из четырех едениц Сю -гидроксикислот. Нонактину соответствует нонактиновая кислота (НАК). Высшие гомологи НАК, получаемые заменой метального радикала при С8 углеродном атоме на этильный и изопропильный, называются, соответственно, гомононактиновой и бисгомононактановой кислотами. Сложноэфирные связи достаточно лабильны, и в присутствии воды можно ожидать установления динамического равновесия между линейными оксикислотами и циклической молекулой макротетролидов. Нактиновые кислоты являются оптически активными соединениями. Молекула макротетролидов состоит из двух левовращающих и двух правовращающих нактиновых кислот (Gerlach et. al., 1967; Keller-Schierlein et. al., 1968).
Проведен полный химический синтез низшего гомолога нонактина путем последовательной конденсации НАК, приводящий сначала к линейным олигомерным соединениям из 2-х и 4-х остатков нонактиновои кислоты с последующей циклизацией в присутствии ионов Ag+ (Gerlach, Hutter, 1975). В настоящее время разработана схема синтетического пути образования нонактина с высоким процентным содержанием образуемых веществ (Lee, Kim, 1995а).
Макротетролиды дают интенсивное флуоресцентное свечение с концентрированной серной кислотой при нагревании. Они поглощают свет при X=212HM(Gerlach, Hutter, 1975). Инфракрасные спектры макротетролидов характеризуются интенсивным поглощением при v =1726 см 1 и в области 1050-1020 см 1, соответствующим связям простого и сложного эфира.
Было показано, что ЯМР-спектр нонактина имеет пять групп хорошо выраженных сигналов при а =1,02-1,19; 1,3-1,21; 2,4; 3,8; 4,9 м.д. Для высших гомологов характер спектра меняется. В результате уменьшения количества метальных групп интенсивность сигнала при а =1,19 м.д. в ряду нонактин, монактин, динактин и тринактин уменьшается в соотношении 4:3:2:1 с одновременным появлением сигнала при а =0,91 м.д. с интенсивностью 1:2:3. Сигнал при с =3,8 м.д. из триплетного для нонактина становится квинтетным у высших гомологов, а вместо квадруплетного сигнала при о =4,9 м.д. для нонактина обнаруживается триплетный для тетранактина (Ando et. al., 1971; Nawata et. al., 1974).
Масс-спектры нонактина представлены четырьмя пиками. Это молекулярный ион при m/z 736 и сигналы с массовыми числами 553, 369 и 185. Молекулярные пики для монактина, динактина, тринактина и тетронактина появляются соответственно при m/z 750, 764, 778 и 772 (Nawata et. al., 1974). Масс-спектры, в отличие от УФ и ИК- спектров, позволяющие различить гомологи, могут быть использованы для более детального анализа этих антибиотиков.
Антибиотики-макротетролиды являются ионофорами, что обусловлено образованием этими соединениями гидрофобных комплексов с ионами одновалентных металлов. По стабильности образования К+-комплексов и K/Na-избирательности макротетролиды занимают промежуточное положение между валиномицином и энниатинами (Овчинников и др., 1974).
Хуторский с соавторами изучали механизм образования комплекса нонактина с калием (Хуторский и др., 1985) и показали наличие открытой конформации данного антибиотика как в кристаллическом состоянии, так и при растворении этого вещества в гидрофобном растворителе, а так же на границе раздела фаз. Было сделано предположение, что образование комплекса нонактин-метал происходит на границе раздела мембрана-вода - в результате всплывания свободного нонактина из внутренней зоны на поверхность мембраны. Это происходит вследствие нерастворимости антибиотика в воде и хорошей его растворимости в органических растворителях. Как было сказано выше, антибиотики-макротетролиды способны переносить сквозь искусственные и биологические мембраны различные одно- и двухвалентные катионы (Свердлова и др., 1995а). Однако этот транспорт осуществляется с различной эффективностью. Был установлен следующий ряд селективности макротетролидов к одновалентным катионам: NHL+ К+ Rb+ Cs+ Na+.
Макротетролиды являются единственными соединениями, обладающими высокой специфичностью к ионам аммония (Scholer, Simon, 1970).
Определение уровня и типов устойчивости к антибиотикам стрептомицетных штаммов
Уровень устойчивости штаммов к антибиотику определяли титрованием в разведениях споровой суспензии исследуемого штамма на среде ММ с различными дозами антибиотика по сравнении с титром спор на среде без антибиотика. Рост штаммов определяли на пятые сутки роста культуры при 28С.
Для определения индуцибельного типа устойчивости споровую суспензию штамма в разведениях наносили на поверхность чашки Петри со средой ММ, содержащей антибиотик, используемый в качестве индуктора. Через 24 часа на поверхность агара наносили слой полужидкой среды ММ, содержащей антибиотик в концентрациях необходимых для создания селективных условий. О наличии индукции судили по более высокому проценту выживаемости клеток споровой суспензии, инкубированной в присутствии антибиотика, по сравнению с контролем (чашки, со средой,не содержащей индуцирующей дозы антибиотика, заливались ингибирующей дозой антибиотика после инкубации культуры в течение 1 суток при 28С).
Самоиндукцию устойчивости штаммов к антибиотикам определяли следующим образом: исследуемый штамм рассевали на чашках Петри со средами ММ и R2 в соответствующих разведениях. Одну часть чашек инкубировали в термостате при 28С в течение 24 часов, а затем заливали верхним слоем агаризованной среды с ингибирующими дозами антибиотика. Другую часть чашек Петри сразу заливали ингибирующими дозами антибиотика. О наличии самоиндукции судили по проценту выживаемости спор на средах ММ и R2, которые заливались сразу или через 1 сутки роста микроорганизма.
Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар с использованием бумажных дисков. Количество наносимого материала - 1-3 мкг.
Получение, регенерацию протопластов и трансформацию стрептомицетных протопластов плазмидной ДНК проводили по стандартной методике (Hopwood et. al., 19856). Для получения протопластов использовали 48-72 часовой мицелий, концентрация лизоцима 3-4 мг/мл, время инкубации стрептомицетных клеток в растворе лизоцима 15-20 минут. Полученные протопласты отделяли от мицелиальных форм путем многократного фильтрования смеси через ватный фильтр. При отборе трансформантов использовали метод репликации регенерировавших протопластов на селективные среды, содержащие антибиотик (тиострептон - 30 мг/мл, актиномицин -100 мг/мл). Эффективность регенерации протопластов рассчитывали как соотношение числа регенерировавших протопластов к числу образовавшихся протопластов. Количество образовавшихся протопластов подсчитывали в камере Горяева. Использовали график зависимости оптической плотности суспензии протопластов от количества протопластов.
Эффективность трансформации рассчитывали как отношение числа полученных трансформантов к числу регенерированных протопластов.
Выделение плазмиды pIJ702 (tsr mel+) из штамма S.lividans ТК-150, проводили по методам Бирнбоим и Долли (Birnboim, Dolly, 1979). Выделение плазмиды pIJ702(actr) (детерминант устойчивости к актиномицину) из S. sp 26-115 Н-1, проводили по методу Киессер (Hopwood, 19856). Электрофоретический анализ экстрахромосомальной ДНК проводили в 1% агарозном горизонтальном геле в трис-ацетатном буфере в течение трех часов (40 мМ трисоксиметил-аминометан, 20 мМ СНзСООН, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0) (Маниатис, 1984). О размере плазмиды судили на основании сравнения с фрагментами ДНК бактериофага X, обработанной рестриктазой Hindi 11.
Антибиотики макротетролиды из S. werraensis выделяли по описанной ранее методике (Suzuki et. al., 1971). Антибиотический комплекс выделяли из мицелия культуры экстракцией ацетоном. Затем, ацетон отгоняли в вакууме, а водный остаток растворяли в небольшом количестве метанола. Полученный комплекс анализировали методом ТСХ с последующим проявлением биоавтографией и химическим методом (проявление в растворе KM11O4) на пластинках Kieselgel 60 (Merck) в системе хлороформ:этилацетат (1:2). Содержание макротетролидов в нативном растворе определяли по методу Сузуки с модификациями (дихлорметан был заменен на хлороформ) (Suzuki et. al., 1971).
Антибиотический комплекс культуры S. werraensis 1365Т выделяли из влажного мицелия экстракцией метанолом (1:2 вес/объем, рН 7,0) в течение 18 часов при непрерывном перемешивании (качалка, 35С). Полученный экстракт высушивали в вакууме до образования маслянистого остатка красного цвета. Очистку и разделение компонентов проводили на колонке Kieselgel 60 (Merck). Вещества вносили в сухом виде в смеси с Kieselgel 60. Элюцию вели хлороформом, а затем продолжали смесью хлороформа с метанолом с постепенно увеличивающимся содержанием последнего (от 1 до 50%). Дополнительную очистку и разделение на компоненты проводили препаративно на пластинках Kieselgel 60 (Merck) в системе хлороформ:бензол:метанол (30:20:7). Полученные фракции анализировали методом ТСХ на Kieselgel 60 по описанной выше системе с последующей биоавтографией, а так же химическим (проявление пластины в растворе КМГ1О4) и физическим (свечение в УФ-свете) методами. Биоавтографию проводили по методике, предложенной в литературе (Haese, Keller, 1988).
