Введение к работе
Актуальность проблемы. К сложнонаследуемым заболеваниям относят такие важные и широко распространенные заболевания, как диабет, астма и большинство психических нарушений. Считается, что такие заболевания проявляюгея в результате патогенного сочетания часто встречающихся в популяции полиморфных вариантов кандидатиых генов в комплексе с воздействиями внешней среды. Функциональная значимость таких полиморфных вариантов может быть исследована на образцах тканей, функционально важных для изучаемого сложнонаследуемого заболевания. В заболеваниях со сложным рисунком наследования, как правило, не наблюдается ярко выраженного нарушения функции изучаемого гена. В случае молчащих замен это предполагает небольшие изменения в экспрессии гена. Для их выявления необходимо использовать высоко чувствительные методы измерения. Разработка таких методов является актуальной задачей современной молекулярной генетики. Ген 5HT2A-R является одним из главных кандидатных генов для такого распространенного и тяжелого сложнонаследуемого заболевания, как шизофрения. К настоящему времени можно считать установленной ассоциацию синонимического полиморфного варианта (102)C/(-1438)G (аллель С) с шизофренией. Однако механизм, лежащий в основе этой ассоциации, до сих пор неизвестен. Выяснение функциональной роли рецептора 5НТ2А в развитии шизофрении и механизма, лежащего в основе ассоциации названного полиморфного варианта с шизофренией, необходимо для выяснения биохимической природы заболевания и будет способствовать разработке более точной его диагностики и более эффективных методов лечения.
Цель работы: разработать методы измерения экспрессии аллельных вариантов гена, не связанных со структурными изменениями белка, на примере анализа полиморфных вариантов гена рецептора 5НТ2А у здоровых людей и при шизофрении.
Основные задачи:
Разработать методические подходы для определения уровня экспрессии гена в зависимости от его аплельного состояния.
Измерить уровень общей экспрессии гена 5HT2A-R в норме и при заболевании.
Изучить экспрессию аллельных вариантов гена 5HT2A-R в норме и при заболевании.
Разработать методы для определения степени метилирования как возможного механизма регуляции экспрессии. р
П^овеети ^нализ^ ^степени метилирования полиморфных сайтов гена 5HT2A-R} БИБЛИОТЕКА
З I С Петербург,
Новизна результатов исследования. В настоящем исследовании разработаны методические подходы, позволяющие с высокой точностью измерять экспрессию аллельных вариантов гена, а также уровень метилирования определенных сайтов у гетерозиготных индивидов. Также была разработана новая методика определения степени деградации РНК в аутопсийных образцах мозга. При помощи этих методов, а также модификаций стандартных методов в работе был проведен анализ функциональной роли разных аллелей гена рецептора серотонина типа 2А (5HT2A-R). Впервые в практике исследований этого рецептора была измерена экспрессия кодирующего его гена в аутопсийных тканях мозга пациентов, страдавших шизофренией, и здоровых индивидов. Впервые проведено измерение степени метилирования полиморфных сайтов аллеля С гена 5HT2A-R. На основе данных, полученных в настоящей работе, предложена новая гипотеза, которая описывает один из возможных молекулярных механизмов регуляции экспрессии гена 5HT2A-R, вовлеченных в развитие связанных с ним психических заболеваний.
Практическая значимость работы. Разработаны методические подходы к функциональному анализу полиморфизмов в генах предрасположенности к сложнонаследуемым заболеваниям. Получены новые данные, раскрывающие функциональную роль рецептора серотонина 5НТ2А и его полиморфных вариантов в развитии шизофрении и, таким образом, проясняющие природу этого сложнонаследуемого заболевания. Поскольку рецептор 5НТ2А и серотониновая система в целом являются мишенями воздействия нейролептиков, полученные данные о дифференциальной экспрессии аллельных вариантов гена 5HT2A-R открывают возможности для разработки новых лекарств, а также оптимизации применения уже существующих препаратов в зависимости от генотипа пациента.
Положения, выносимые на защиту:
Новые методы, разработанные в данной работе, позволяют проводить измерение относительной экспрессии аллелей в гетерозиготных индивидах и определение общего уровня экспрессии гена 5HT2A-R в аутопсийных образцах мозга.
Общий уровень экспрессии гена 5HT2A-R снижен в тканях мозга больных шизофренией по сравнению со здоровыми индивидами.
Уровень экспрессии аллельного варианта 102C/-1438G гена 5HT2A-R ниже, чем уровень экспрессии аллельного варианта 102Т/-1438А.
Аллельный вариант 102C/-1438G обладает двумя дополнительными по сравнению с аллельным вариантом 102Т/-1438А сайтами метилирования. Эти сайты метилированы в ДНК клеток головного мозга.
Публикации. По материалам исследования опубликовано пять печатных работ.
Личное участие автора. Все научные результаты, положенные в основу диссертации, получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Из работ, сделанных в соавторстве, в диссертацию вошли только те результаты, в получении которых автор принимал непосредственное творческое участие.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на семинарах Института молекулярной генетики РАН, на Ученом Совете Медико-генетического научного центра РАМН, на собрании American College of Neuropsyhopharmacology в 2000 году (Пуэрто-Рико) и на ежегодных конференциях Society of Biological Psychiatry в 2001 г. (Новый Орлеан, США) и 2002 г. (Филадельфия, США).
Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты и обсуждение», «Выводы». Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 27 иллюстраций и 7 таблиц. Список использованной литературы содержит 239 наименований.
