Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Промоторы 11
1.2 сг-субъединицы 17
1.3 Структура холофермента 21
1.4 Функции доменов а-субъединицы 26
1.4.1. Район 1 27
1.4.2. Район 2 29
1.4.3. Районы 2.5 и 3 30
1.4.4. Район 4 32
1.5 Детерминанты узнавания ДНК РНК-полимеразой 35
1.5.1. Матрицы с одноцепочечными поли-dC З'-концами (tailed template).
35
1.6 Абортивная инициация 51
1.7 Путь от узнавания промотора до ухода в элонгацию - структурная модель 54
1.8 Диссоциация а-субъединицы 5S
1.9 Бесфакторная регуляция транскрипции 62
1.10 Влияние конформации ДНК на силу промотора 66
1.11 Взаимовлияние промоторов 67
2. Материалы и методы 70
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 70
2.2. Бактериальные среды 71
2.3. Электрофорез 71
2.4. Компетентные клетки и трансформация бактерий 71
2.5 Конъюгация бактерий 72
2.6 Заражение клеток бактериофагом М13 72
2.6 Белки 73
2.8 Приготовление сг -субъединицы и фрагментов сг-субъединицы 73
2.9. Приготовление РНК-полимеразы из клеток 76
2.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 78
2.11. Направленный ПЦР-мутагенез 78
2.12. Транскрипция in vitro 79
2.12.1. Транскрипция с laclJVS промотора 79
2.12.2. Транскрипция с Т7А1 промотора 81
2.12.3. Транскрипция на УНР М13 82
2.13 ДНК-белковая сшивка формальдегидом 84
2.14 Футпринтинг ДНКазой 1 85
2.15 Аффинное мечение РНКП 86
2.16 ДНК-белковая и белок-белковая сшивки в элонгационных комплексах.. 86
2.17 Расщепление РНК гидроксильными радикалами 87
2.18 Гель-фильтрация реакционных смесей после синтеза пРНК 88
3. Результаты и обсуждение 89
3.1 Изучение механизма воникновеиия паузы транскрипции при переходе от инициации к элонгации на промоторе lacUVS 89
3.1.1. Введение 89
3.1.2. Комплекс в состоянии паузы является элонгационным, сдвинутым назад (backtracked) 90
3.1.3. Г [ауза транскрипции в положении +17- явление, зависящее от сг -субъединицы 92
3.1.4. Пауза транскрипции в положении +17 возникает благодаря специфическому взаимодействию а -субъединицы с ДНК 92
3.1.5. Положение формальдегидной сшивки а70-субъедишщы на ДНК... 99
3.1.6. Последовательность района 2 о>субъединицы важна для образования паузы 101
3.1.6. Детерминанты взаимодействия а7 -субъединицы с корферментом в элонгационном комплексе 103
3.1.7. Заключение 106
3.2 Изучение роли <т -субъединицы в синтезе РНК-полимеразой Е.соН праймера для репликации генома бактериофага Ml3 110
3.2.1. Введение 110
3.2.2. Роль SSB в узнавании УНР 112
3.2.3. Предполагаемые -10 и -35 районы УНР не играют роли в узнавании 114
3.2.4. о -субъединица необходима для синтеза пРНК, но не нужна для узнавания УНР 116
3.2.5. ст7 -субъединица важна на стадии синтеза тринуклеотида 118
3.2.6. Роль района 3.2 о" -субъединицы в транскрипции пРНК 124
3.2.7. Функция в синтезе пРНК является общей для ст-факторов о"70-семейства 125
3.2.8. Место связывания шпильки УНР в корферменте 127
3.2.9. Заключение 129
3.3 Изучение механизма формирования РНК-праймера для репликации одноцепочечного генома бактериофага МЇЗ 132
3.3.1. Введение 132
3.3.2. После остановки синтеза РНК-полимераза продолжает быть связанной с РНК и ДНК, образуя необычный элонгационный комплекс- 132
3.3.3. Причина образования необычного элонгационного комплекса при синтезе пРНК 137
3.3.4. Расположение РНК-ДНК гибрида в РНК-полимеразе 147
3.3.5. Заключение 149
Выводы 151
Список сокращений 152
Список сокращений 152
Список литературы 153
Список опубликованных работ 177
- Функции доменов а-субъединицы
- Компетентные клетки и трансформация бактерий
- Изучение роли <т -субъединицы в синтезе РНК-полимеразой Е.соН праймера для репликации генома бактериофага Ml3
- Изучение механизма формирования РНК-праймера для репликации одноцепочечного генома бактериофага МЇЗ
Функции доменов а-субъединицы
Новые структурные модели вызвали появление гипотезы о том, как структурные элементы ст выполняют свои функции в инициации. Хоть и очевидно, что а-субъединица ответственна за узнавание промотора холоферментом РНК-поли меразы, свободная сг-субъединица не способна связывать и блокировать промоторную ДНК в клетке. Во-первых, каждый из трех потенциальных ДНК-связывающих модулей ст-субъединицы способен лишь к очень слабым взаимодействиям с соответствующими ДНК элементами (Campbell et al., 2002; Marr and Roberts, 1997). Ни одного из этих взаимодействий не достаточно для формирования промоторного комплекса. Во-вторых, в свободной а расстояние между ДНК-связывающими доменами не такое, чтобы связать соответствующие промоторные элементы одновременно (Callaci et al., 1999). Одновременное взаимодействие между ДНК-связывающими доменами сі и их мишенями в ДНК становится возможным только после формирования холофермента. В-третьих, взаимодействие внутри самого о-фактора приводит к автоингибированию узнавания промотора свободной о. Автоингибирование снимается при образовании холофермента (Kulbachinskiy et al., 1999; McMahan and Burgess, 1999). Долгое время считалось, что за автоингибирование ответственен район 1.1 (Camarero et al., 2002; Dombroski et al., 1992). Этот район, примерно 90 аминокислот длиной, обладает слабой консервативностью среди бактерий, хотя и несет характеристический суммарный отрицательный заряд. Мутантная о70-субъединица, у которой отсутствует район 1.1, но не а70 дикого типа, способна узнавать промоторный элемент -35 в отсутствии корфермента (Dombroski et al., 1992). Однако, биофизические исследования показывают, что район 1.1 не взаимодействует с районом 4 в свободной о70, и ингибирование связывания с ДНК, таким образом, может быть непрямым следствием сильного отрицательного заряда района 1.1 (Camarero et al., 2002). На некоторых промоторах район 1.1 способствует формированию открытого промоторного комплекса (Vuthoori et al., 2001). Последние структурные данные не предоставляют информации о роли района 1.1, так как в кристаллах холофермента Taq использовалась ад с делетированным 1.1 районом (Murakami et al., 2002b), а в структуре Tth холофермента этот район неупорядочен (Vassylyev et al., 2002).
Исследования холофермента Exoli с использованием резонансного переноса флюоресцентной энергии предоставили прямое свидетельство того, что район 1.1 занимает место в канале, связывающем передний дуплекс ДНК (Mekler et al., 2002). В связи с этим было предположено, что отрицательный заряд района 1.1 может имитировать ДНК, и при формировании промоторного комплекса этот район должен быть вытеснен. Действительно, биофизические данные подтверждают эту гипотезу, демонстрируя, что относительное положение района 1.1 меняется при взаимодействии холофермента с промоторной ДНК (Mekler et al., 2002). Это объясняет, как район 1.1 может оказывать эффект на кинетику образования открытого комплекса. Холофермент, собранный с т, у которой отсутствует район 1.1, оказался дефектен на поздних стадиях формирования открытого комплекса на большинстве промоторов (Vuthoori et al., 2001). Также образование стабильного промоторного комплекса таким ферментом занимало гораздо большее время (Wilson and Dombroski, 1997). Было предположено, что район 1.1 может расширять канал, способствуя тем самым входу в него ДНК (Murakami et al., 2002b), но установление точной функции этого района еще предстоит выяснить. Основное взаимодействие корфермента и ст-субъединицы происходит между районами 2.1 и 2.2 и эволюционно консервативным coiled-coil элементом р-субъединицы (Arthur and Burgess, 1998; Murakami et al., 2002b; Vassylyev et al., 2002), структурой, напоминающей платформу, торчащую из «пола» главного канала. Пептид, соответствующий районам 2.1 и 2.2 ннгибирует формирование холофермента (Sharp et al., 1999). Структурные и биохимические исследования свидетельствуют о том, что консервативный район 2.4 узнает лромоторный элемент -10 (Магг and Roberts, 1997; Murakami et al., 2002a; Severinova et al., 1996). Свободные ст-субъединицы или фрагменты о , содержащие район 1, взаимодействуют с двуцепочечным -10 элементом промотора очень слабо, однако в контексте холофермента они способны специфически узнавать одноцепочечную нематричпую цепь —10 элемента, что также указывает на возможную роль района 2 в плавлении промотора (Marr and Roberts, 1997; Murakami et al., 2002a). С другой стороны, отдельно взятый coiled-coil домен р1 индуцирует узнавание одноцепочечного -10 элемента о70 или ее фрагментом, содежаицим район 2 (Young et al., 2001). Таким образом, взаимодействие с coiled-coil доменом р"-субъединицы снимает автоингибирование связывания с промотором свободной ст-субъединицы, однако механизм этого процесса пока не ясен. Хотя детали взаимодействия между а-субъединицей и промоторной ДНК неясны, в структуре комплекса холофермента с фрагментом промотора, полученной с разрешением 6.5А, аминокислотные остатки района 2.4 ст расположены вблизи -12 положения (единственного положения -10 элемента этою фрагмента, находящегося в двуцепочечной форме), а несколько высококонсервагивных ароматических остатков района 2.3, необходимых для функции плавления, находятся в радиусе взаимодействия с экспонированными основаниями -10 элемента нематричной цепи, находящейся в одноцепочечной форме (Murakami and Darst, 2003).
Пожалуй, наиболее важным является остаток триптофана, абсолютно консервативный во всех о-факторах 1 группы, осуществляющий стэкинг-взаимодействия с плоскостью нуклеотида в положении -12, формируя таким образом заднюю границу транскрипционного пузыря (Murakami et al., 2002а). Биохимические исследования указывают, что в случае удлиненных -10 промоторов район 2.5 взаимодействует с TG мотивом этих промоторов, что способствует эффективному формированию промоторных комплексов на промоторах этого класса (Barne et al., 1997). Эти дополнительные контакты достаточно сильны, чтобы сделать образование промоторного комплекса на некоторых удлиненных -10 промоторах независимым от взаимодействий района 4.2 ст-субъединицы с -35 элементом. Из структуры комплекса холофермента с фрагментом промотора видно, что район 3 - это компактный домен, состоящий из трех а-спиралей. Аминокислотные остатки N-концевой а-спирали вовлечены в узнавание TG мотива удлиненных -10 промоторов (Вате et al., 1997; Voskuil and Chambliss, 2002). При удалении С-концевого фрагмента ст, содержащего район 4 и петлю 3.2, холофермент, собранный с такой а, сохраняет слабую активность на удлиненном -10 промоторе. Эта активность может быть увеличена до уровня фермента дикого типа путем увеличения концентрации инициирующего динуклеотида (Campbell et al., 2002). Близость петли 3.2 к активному центру в структуре холофермента позволяет предположить роль, что эта петля играет роль в связывании инициирующих нуклеотидов и объяснить дефект в Км для инициирующего динуклеотида. В работе (Campbell et al., 2002), однако, не исследуется роль а при инициации с мононуклеотида. В экспериментах с использованием аналога инициирующего нуклеотида, который может быть химически пришит к близлежащим аминокислотным остаткам, было показано, что в инициаторном комплексе этот нуклеотид пришивается к району 3.2 о-субъединицы (Severinov et а]., 1995). Активная і-рушіа аналога присоединена к гамма-фосфату нуклеотида. Таким образом, эти данные также свидетельствуют о том, что район 3.2 о-субъединицы может напрямую участвовать в формировании нуклеотид-связывающего центра в ходе инициации. С другой стороны, такое положение района 3.2 ст могло бы объяснить феномен абортивной инициации транскрипции. Абортивная трапе крипция является универсальным свойством всех ДНК-зависимых РНК-полнмераз, и, по-видимому, является ценой, которую платят ферменты этого класса за возможность инициировать матричный синтез в отсутствие праймера. Множество коротких абортивных транскриптов синтезируется связанной с промотором РНКП перед тем, как фермент синтезирует
Компетентные клетки и трансформация бактерий
Компетентные клетки для трансформации готовили по стандартной процедуре (Маниатис и др., 1984) и хранили при -70С. Высокоэффективные компетентные клетки XL-1 для клонирования готовили точно как описано в (Inoue et al., 1990). Трансформацию клеток проводили как описано в Маниатис и др., 1984. Компетентные клетки штаммов MG-1655 и JE-1134 были трансформированы плазмидой pUC19 для придания устойчивости к ампициллину. Коньюгация полученных трансформантов со штаммом, несущим F-фактор с геном устойчивости к канамицину, была проведена как описано в Маниатис и др., 1984. После этого клетки высевали на твердую среду, содержащую канамицин и ампициллин. Отобранные таким образом клетки использовались для заражения бактериофагом М13. Для получения бактериофага компетентные клетки XI-1 Blue были трансформированы одноцепочечным геномом фага М13 и высеяны в мягком агаре как описано Маниатис и др., 1984. Зоны просветления вырезали и помещали в жидкую культуру клеток штамма Xl-1 Blue с оптической плотностью OD oo 0.1 о.е. Получение суспензии фаговых частиц проводилось как описано в Маниатис и др., 1984. Разведение фага было подобрано так, чтобы при заражении в мягком агаре получались отдельные зоны просветления. Это разведение использовалось для заражения бактерий штаммов MG-1655 и JE-1134 как описано в Маниатис и др., 1984. 2.6 Белки. РНКП, несущая делецию аминокислот 1149-1190 р1 -субъединицы была предоставлена К. Севериновым, белок gp2 фага Т7 был предоставлен С. Нечаевым, а70-субъединица, несущая делецию 507-519 аминокислот была предоставлена Л. Минахиньтм, а-субъединицы Е.соИ были предоставлены V. Berengald, GreB фактор был предоставлен С. Боруховым, химерные а-субъединицы были предоставлены А. Кульбачинским (схема конструкций представлена на Рис. 12) Схемы конструкций использованных в работе с-субъединиц приведены на Рис. 11. Все фрагменты и полноразмерная сг -субъединица содержали мотив из 6 остатков гистидина на N-конце.
Для суперэкспрессии фрагментов ст-субъединицы использовался штамм BL-21(DE3), трансформированный соответствующей плазмидой (любезно предоставлены И.А. Басе). Клетки растили ночь при 30С, после чего собирали низкоскоростным центрифугированием и ресуспендировали в буфере (50 мМ Трис-НС1 рН 7,9; 200 мМ NaCl, 5% глицерин, 10 мМ ЭДТА) (использовали 10 мл буфера для клеток, собранных с 1 литра культуры). Клетки разрушали ультразвуком и лизат осветляли центрифугированием (12000 об/мин в течение 10 мин). Супернатант наносили на колонку с хелатирующей сефарозой (Pharmacia), заряженной ионами Ni2+, и уравновешенную буфером (20 мМ Трис-НС1 рН 7,9; 600 мМ NaCl; 5% глицерин). После нанесения колонку промывали буфером (20 мМ Трис-HCl рН 7,9; 600 мМ NaCl; 20 мМ имидазол; 5% глицерин), после чего элюировали РНКП буфером (50 мМ Трис-HCl рН 7,9; бООмМ NaCl; 50мМ имидазол; 5% глицерин). Фракции, содержащие искомый белок, объединяли и диализовали против буфера хранения (20 мМ Трис-HCl рН 7,9; 400мМ NaCl; 10 мМ р-меркаптоэтанол; 50% глицерин). Препараты хранили при -20С. Для вьщеления РНК-полимераз использовали штамм E.coli RL721, содержащей мотив из 6 остатков гистидина на N-конце р"-субъединицы РНКП. Клетки растили до оптической плотности OD oo = 1,0 о.е. в среде LB при 37С, после чего собирали низкоскоростным центрифугированием и ресуспендировали в буфере (50 мМ Трис-HCl рН 7,9; 200 мМ NaCl, 5% глицерин, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ р-меркаптоэтанол) (использовали 10 мл буфера для клеток, собранных с 1 литра культуры). Клетки разрушали с помощью French Press Homogenizer (Austin, Canada). Лизат осветляли центрифугированием (12000 об/мин в течение 10 мин), и к супернатанту добавляли 10% раствор полимина Р (Sigma) до конечной концентрации 0,8%. Суспензию инкубировали в течение 15 минут при 4С и центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 минут. Осадок промывали трижды ресуспендированием в буфере (50 мМ Трис-HCl рН 7,9; 500 мМ NaCl, 5% глицерин, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ р-меркаптоэтанол) и собирали центрифугированием (5000 об/мин 5 минут). Для элюции осадок ресуспендировали в буфере (50 мМ Трнс-НС1 рН 7,9; 1М NaCl, 5% глицерин, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ р-меркаптоэтанол) и центрифугировали в тех же условиях.
Супернатант, содержащий РНК-полимеразу, переносили в новую пробирку. РНК-полимеразу осаждали добавлением сухого сульфата аммония (0.35 г на 1 мл); осадок собирали центрифугированием (12000 об/мин, 10 мин), растворяли в буфере (50 мМ Трис-HCl рН 7,9; 5% глицерин, 10 мМ р-меркаптоэтанол) и наносили на колонку с гепарин сефарозой (Pharmacia), уравновешенную тем же буфером. Колонку промывали буфером (50 мМ Трис-НСІ рН 7,9; 300 мМ NaCl; 5% глицерин), после чего РНК-полимеразу элюировали буфером (50 мМ Трис-HCl рН 7,9; 600 мМ NaCl; 5% глицерин). Фракции, содержащие РНКП, объединяли и наносили на колонку с хелатирующей сефарозой (Pharmacia), заряженной ионами Ni +, и уравновешенную буфером (50 мМ Трис-НСІ рН 7,9; 600 мМ NaCl; 5% глицерин). После нанесения колонку промывали буфером (50 мМ Трис-НСІ рН 7,9; 600 мМ NaCl; 20 мМ имидазол; 5% глицерин), после чего элюировали РНКП буфером (50 мМ Трис-НСІ рН 7,9; 600 мМ NaCl; 50мМ имидазол; 5% глицерин). Фракции, содержащие РНК-полимеразу, разбавляли таким образом, чтобы концентрация соли была равна 150 мМ и в режиме FPLC наносили на ионообменную колонку MonoQ (Waters), уравновешанную буфером (50 мМ Трис-НСІ рН 7,9; 150 мМ NaCl; 10 мМ р-меркаптоэтанол; 5% глицерин). Холофермент отделялся от корфермента при элюции линейным градиентом NaCl от 150 мМ до 500 мМ в буфере (50 мМ Трис-HCl рН 7,9; 10 мМ р-меркаптоэтанол; 5% глицерин). Фракции, содержащие кор- и холофермент концентрировались на концентраторах фирмы Centricon, потом к препаратам добавлялся глицерин до концентрации 50%. Препараты хранили при -20С.
Изучение роли <т -субъединицы в синтезе РНК-полимеразой Е.соН праймера для репликации генома бактериофага Ml3
Геномом бактериофага М13 является одноцепочечная кольцевая ДНК. При попадании в клетку эта ДНК специфически узнается клеточной РНК-полимсразой, которая синтезирует 18-20 нуклеотидную РНК (пРНК). Эта РНК служит праймером для ДНК-полимеразы III, которая и осуществляет репликацию одноцепочечного генома с получением двуцепочечной формы (Geider, Komberg, 1974). В присутствии SSB холофермент РНК-полимеразы специфически узнает участок одноцепочечной ДНК, называемый участком начала репликации минус цепи (далее У HP) (Tabak et, al., 1974). Последовательность VHP содержит два палиндромных повтора, которые могут образовать две несовершенных шпильки. Расположенные параллельно, эти шпильки образуют подобие фрагмента двуцепочечной ДНК (Рис. 20, фрагмент 1). Так как синтез праймерной РНК (пРНК) полностью зависит от ст -субъединицы (Kaguni, Komberg, 1982), было предположено, что псевдо-двуцеиочечный фрагмент может работать как бактериальный промотор (Higashitani et al., 1996). И действительно, на этом фрагменте, в положениях -10 и -35 относительно старта транскрипции пРНК, были обнаружены последовательности, слабо напоминающие промоторные консенсусные элементы.
В моей работе была поставлена задача изучить роль о70-субъединицы в синтезе РНК- праймера для репликации одноцепочечного генома фага М13.Для того, чтобы определить детерминанты специфического узнавания УНР РНК-полимеразой, было решено найти минимальный фрагмент одноцепочечного генома М13, на котором может быть осуществлен синтез пРНК. Фрагмент 1, с которого было начато это исследование, - 128 нуклеотидный фрагмент, соотвегствующий положениям 5624-5751 одноцепочечного генома М13, содержащий обе пары инвертированных повторов (Рис. 20). Несколько более длинный, 137 нуклеотидов, фрагмент генома близкородственного фага fl был использован ранее в работе Higashitani et al., 1996.
SSB необходим для синтеза пРНК на полноразмерном геноме. В отсутствие SSB наблюдается неспецифический синтез, очевидно, из-за случайного связывания РНК-полимеразы и неспецифической инициации транскрипции на одноцепочечной ДНК (Рис. 21 А). При уменьшении ДНК, содержащей УНР, до фрагмента, состоящего только из двух шпилек УНР без прилежащей ДНК (фрагмент 1, Рис. 20), зависимость специфической транскрипции от SSB пропадает, тогда как эффективность синтеза не уменьшается (Рис. 21 А). Аналогичный результат был получен и с фрагментом генома фага fl (Higashitani et al., 1996). Таким образом, роль SSB в узнавании УНР сводится к блокированию неспецифического связывания РНК-полимеразы с геномной ДНК, то есть к экспонированию псевдо-двуцепочечного УНР т остального одноцепочечного генома. Эта функция SSB была предположена в работе Kaguni and Romberg, 1982, в которой было показано, что эффективное праймирование репликации одноцепочечного генома М13 происходит только вприсутствии количества SSB, обеспечивающего полное покрытие одноцепочечной ДНК фага.
Надо отметить, что при синтезе на фрагменте 1 распределение продуктов транскрипции несколько изменяется: 18 нуклеотидный транскрипт становится мажорным продуктом, тогда как на полноразмерном геноме преобладал 20 нуклеотидный продукт (Рис. 21 А). Причина этот о различия неизвестна, однако такой же результат бьш получен и в работе Higashitani et al., 1996. Инициация транскрипции пРНК происходит высокоспецифично с +1 положения (см. ниже), таким образом, разница в длине пРНК обусловлена различием в 3 -концах транскриптов.Итак, 128 нуклеотидный фрагмент специфически узнается РНК-полимеразой, и для этого не требуется SSB. Как было упомянуто, предполагается, что узнавание этого фрагмента происходит аналогично узнаванию бактериального промотора (Higashitani et al., 1996). Чтобы проверить роль предполагаемого -35 элемента VHP в синтезе пРНК, была удалена левая шпилька УНР, содержащая -35 область и проверена способность 50 нуклеотидного фрагмента служить матрицей для синтеза пРНК (фрагмент 2, Рис. 20). Холофермент синтезировал пРНК на этом фрагменте, что указывает на то, что 35 район предполагаемого промотора не важен для узнавания УНР и синтеза пРНК (Рис. 22А, дорожка 4). Еще более удивительным оказался факт, что удаление области, содержащей предполагаемый -10 промоторный элемент (фрагмент 3, Рис. 20), яе привело к изменениям в транскрипции (Рис. 22А, дорожка 6). Дальнейший анализ привел к получению минимального, длиной в 33 нуклеотида, фрагмента УНР, способного поддерживать синтез пРНК (Рис. 20). Этот фрагмент может быть уложен в несовершенную шпильку длиной 12 пар оснований с трехнуклеотидной петлей на конце и шестинуклеотидньтм одноцеп очечным участком на 3 -конце. Укорочение минимального 33-нуклеотидного фрагмента с 5 - или З -конца хотя бы на один нуклеотид приводило к полному исчезновению синтеза праймера (Рис.21В). Таким образом, -10 и -35 области не играют роли в узнавании УНР, и узнавание происходит по какому-то иному механизму, нежели узнавание промоторов.Эффективный синтез на матрицах, у которых полностью отсутствуют промоторные элементы, заставляет задаться вопросом, является ли синтез на этих матрицах а70-зависимым, или корфермент сам способен синтезировать пРНК на коротких фрагментах УНР? Сравнение нечетных и четных дорожек на Рис. 22А показывает, что синтез пРНК на фрагментах 1 2 и 3 строго зависит от присутствия а -субъединицы. Для синтеза пРНК на минимальном фрагменте а70 также была необходима (дорожки 7 и 8).Полученные результаты можно объяснить двумя причинами: либо ст70-субъединица участвует в узнавании УНР, либо она играет роль в самом синтезе
Изучение механизма формирования РНК-праймера для репликации одноцепочечного генома бактериофага МЇЗ
Следующим этапом этой работы было выяснение причины остановки РНК-полимеразы после синтеза 18-20 нуклеотидной пРНК. Известно, что остановка транскрипции может осуществляться либо при терминании транскрипции, в ходе которой происходит распад комплекса полимераза-ДНК-РНК, либо при возникновении паузы транскрипции, когда РНК-полимераза по той или иной причине останавливается, но не диссоциирует из комплекса с ДНК и РНК. В последующих экспериментах использовался фрагмент 2 У ЯР.
Чтобы проверить остается ли РНК-полимераза связанной с ДНК У HP и пРНК по окончании синтеза, реакционная смесь была нанесена на гель-фильтрационную колонку и фракции были проанализированы на сцинтилляторе и с помощью денатурирующего электрофореза. Как видно из Рис. 28А, полимераза и пРНК элюировались вместе, тогда как пРНК из реакционных смесей, подвергнутых фенольной экстракции, выходила гораздо позже (показано черной стрелкой). Полученный результат был подтвержден в эксперименте с использованием иммобилизованных комплексов. РНК-полимераза, несущая гексагистидиновый якорь, была иммобилизована на Ni-NTA агарозе, и после синтеза было определено местонахождение РНК-продукта. Оказалось, что вся пРНК остается связанной с полимеразой (Рис. 28В). Исходя из того, что пРНК в конце концов должна служить праймером, то есть должна быть спарена с ДНК, а полученный результат допускает возможность того, что ДНК матрица диссоциировала из комплекса, реакционная смесь после синтеза была обработана РНКазой Н. При обработке реакционных смесей РІІКазой Н перед нанесением на гель-фильтрационную колонку пРНК, выходящая вместе с РНКП, деградировала, указывая на то, что она находится в дуплексе с ДНК (Рис. 28А). Итак, РНК, ДНК и РНК-полимераза остаются вместе по окончании синтеза пРНК, образуя комплекс, который можно назвать праймосомой, так как он служит в праймировании репликации.
Для установления природы комплекса, образующегося при синтезе пРНК, он был сравнен с подробно описанными в литературе активным (с 20-нуклеотидной РНК) и сдвинутым назад (backtracked) (с 27-нуклеотидной РНК) элонгационными комплексами, полученными при синтезе с А1 промотора фага Т7(Рис. 29А). Оказалось, что комплекс, образованный после синтеза пРНК (дорожки 11-15), функционально не похож ни на активный (дорожки 1-5), ни на сдвинутый назад (backtracked) (дорожки 6-10) элонгационные комплексы, так как РНК в нем не подвержена пирофосфоролизу, расщеплению ОгеВ фактором, и не может быть удлинена при добавлении нуклеотидов. Наиболее удивительным свойством праймирующего комплекса является чувствительность пРНК к РНКазе Н (Рис. 29А, дорожка 15). В нормальных элонгационных комплексах РНК устойчива к РНКазсН (Рис. 29А, дорожки 5 и 10), так как в районе РНК-ДНК гибрида она полностью закрыта РНК-полимеразой, а на других участках она находится в одноцепочечной форме. Следовательно, нуклеиново-кислотный остов в праймирующем комплексе имеет совершенно другую геометрию, нежели в известных элонгационных комплексах. При обработке комплекса экзонуклеазой III (Ехо III), щепящей РНК в дуплексе с ДНК, но, в отличие от РНКазы Н, зкзонуклеотически с 3 -конца, пРНК также деградировала (Рис. 29В). Таким образом, З -конец пРНК в комплексе на УНР экспонирован, то есть комплекс является сдвинутом назад, но, в отличие от нормального сдвинутого назад (backtracked) комплекса, З -конец РНК остается спарен с матричной цепью ДНК.
Таким образом, остановку транскрипции при синтезе пРНК нельзя отнести ни к терминации, ни к паузе транскрипции по известному механизму. После окончания синтеза пРНК формируется необычный комплекс, содержащий пРНК, ДНК и РНК-полимеразу, имеющий геометрию отличную от элонгационного комплекса. В праймирующем комплексе З -конец РНК спарен с матричной ДНК и
