Содержание к диссертации
Список употребляемых сокращений 3
Введение 4
Глава I. Обзор литературы
Регуляторная функция тРНК. . 8
Аминоадил-тРНК-синтетазы эукариотов 19
Особенности биосинтеза белков ж нуклеиновых
кислот в регенерирующей печени. . . 32
Глава 2. Материалы и методы 44
Глава 3. Результаты и обсуждение
Транспортные РНК регенерирующей печени крыс. . . У. .63
Аминоацил-тРНК-синтетазы регенерирующей печени
крыс. . . *' 82
3.3. Высокомолекулярные комплексы /кодосомы/ регенери
рующей печени крыс 97
Заключение 117
Выводы. . 123
Список литературы 126
Список употребляемых сокращений
Введение к работе
К настоящему времени в целом изучены и охарактеризованы структура, свойства и функции белков и нуклеиновых кислот - биополимеров, участвующих в основных процессах жизнедеятельности клетки. На первый план выдвигается вопрос о регуляции функционирования этих макромолекул в клетке и, с другой стороны, о их роли в регуляции клеточного метаболизма в целом. Известно, что регуляция экспрессии генома является каскадной и осуществляется на разных уровнях. У высших организмов особое значение приобретает посттранскрипционная регуляция, в том числе на уровне трансляции. Накоплен большой экспериментальный материал о том, что одним из компонентов, участвующих в такой регуляции, являются транспортные РНК. Есть веские основания считать, что синтез тРНК не является конститутивным, а взаимосвязан с качественными и количественными изменениями набора мРБК, трансляция которых.происходит в данный период жизнедеятельности клетки. Этот вывод сделан на основе открытия явления "функциональной адаптации" тРНК к синтезу специфических белков в узкоспециализированных тканях /1-4/, таких как эпителий молочной железы, грануляционная ткань, шелковы-делительная железа, хрусталик глаза и др. Возникает вопрос, характерна ли адаптация только для узкоспециализированных тканей или это явление носит универсальный характер и свойственно всем клеткам при изменении в них качественного набора синтезируемых белков. Удобной моделью для выяснения этого вопроса является регенерирующая после частичной гепатэктомии печень, поскольку первые сутки после операции характеризуются существенной стимуляцией белкового синтеза в целом, а максимумы синтеза отдельных белков разобщены во времени. Так, через 6 ч наблюдается усиленный синтез рибосомальных белков, через 15 ч - первый, а через 21-23 ч - вто-
рой, более значительный пик синтеза гистонов /5/.
В литературе имеются сведения о свойствах транспортных РНК регенерирующей печени крыс, однако они очень ограниченны и противоречивы, а в указанные сроки регенерации биологическая активность тРНК никем не изучена. Кроме роли тРНК, регуляторная функция которых косвенно и прямо показана в значительном количестве экспериментальных работ, интерес представляет вопрос о функционировании эукариотических АРСаз при существенных изменениях биосинтеза белка. В ряде работ показано, что АРСазные активности в клетках эукариотов отличаются при различных физиологических и патологических состояниях организма, в частности, при гормональных воздействиях, в процессе онтогенеза, дифференцировки и т.д. Однако практически ни в одном случае не показано, связаны ли эти различия с изменением количественного содержания ферментов в клеточном пуле или с изменением их молекулярной активности. Кроме того, известно, что в отличие от прокариот большинство АРСаз в клетках эукариот функционируют в составе высокомолекулярных комплексов так называемых кодосом, составными частями которых также являются тРНК /6/, метилтрансферазы /7/, протеинкиназы /8/ и др. Однако биологический смысл надмолекулярной организации АРСаз и других компонентов белкового синтеза не известен, а вопрос о функционировании высокомолекулярных комплексов при существенных изменениях биосинтеза белка совершенно не изучен. Выбранная нами экспериментальная модель удобна и для решения этого вопроса, поскольку в печени крыс обнаружены и достаточно хорошо охарактеризованы высокомолекулярные комплексы АРСаз, а изменения биосинтеза белка в процессе регенерации дают возможность сравнить их состав и свойства в зависимости от характера белкового синтеза.
В связи с вышеизложенным целью настоящей работы явилось изу-
чение биологической активности и свойств транспортных РБК, АРСаз и их высокомолекулярных комплексов в регенерирующей печени крыс через 6, 15 и 21 ч после частичной гепатэктомии. Дяя достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.
Определить акцепторную активность тРНК in vitro, количественное содержание эндогенных аминоацил-тРНК in vivo и наличие тРБК в высокомолекулярных комплексах.
Изучить аминоацил-тРНК-синтетазные активности в суммарных препаратах АРСаз и в составе высокомолекулярных комплексов.
Получить высокоочшценные препараты глутамил-тРНК-синтета-зы из нормальной и регенерирующей печени крыс и изучить свойства ферментов в свободном и ассоциированном состояниях.
Определить белковый, фосфолипидный состав высокомолекулярных комплексов и наличие в них метилтрансферазной, протеинки-назной, протеазной и рибонуклеазной активностей.
В результате проведенной работы установлено, что колебания в биосинтезе белка в ранние сроки регенерации печени (6 и 15 ч после операции ) не связаны с изменениями биологической активности и свойств тРБК и АРСаз. Лишь через 21 ч после частичной гепатэктомии в период максимального синтеза гистонов наблюдается слабо выраженная адаптация клеточного состава тРНК и АРСаз к их биоеинтезу. Впервые показано, что изменение аминоацил-тРНК-синте-тазной активности в эукариотических клетках, в частности возрастание глутамил-тРНК-синтетазной активности в регенерирующей печени крыс, не связано с изменением молекулярной активности фермента, а, по-видимому, определяется увеличением его количественного содержания. Через 21 ч после частичной гепатэктомии существенно возрастает уровень метилирования тРНК и метилтрансферазная активность как в растворимой фракции гомогената печени, так и в
составе высокомолекулярных комплексов. Последние выделены и охарактеризованы из регенерирующей печени крыс впервые. Показано, что из изученных компонентов кодосом наиболее существенные изменения наблюдаются для метилтрансферазной и протеинкиназной активностей.
Не все обнаруженные нами изменения носят выраженный характер, однако эффективность процесса трансляции зависит от многих факторов, поэтому даже малые изменения, если они действуют одновременно и в одном направлении, могут привести к амшшфицирован-ному результату. В этом плане заслуживают внимания и дальнейшего изучения результаты по исследованию метилтрансферазной и протеинкиназной активностей кодосом. Изменение количественного содержания и набора этих ферментов, входящих в их состав, может иметь прямое отношение к регуляции биосинтеза белка.
