Введение к работе
Более 40% женщин, поступающих в стационары, - это больные с распространенным РМЖ. Лечение данной категории пациенток очень сложно. В связи с этим, не теряет своей актуальности разработка новых подходов к оценке "биологического поведения" опухоли, а также общего прогноза заболевания и выбору наиболее адекватных схем лечения для каждой больной.
В последние годы большое внимание в этой области уделяется различным молекулярным и клеточным маркерам, характеризующим фундаментальные биологические свойства опухоли. Тем не менее, ввиду большого числа молекулярно-биологических факторов и значимых расхождений данных литературы об их прогностической ценности, выбор определенного типа лечения, основанный на биологических характеристиках опухоли, остается затруднительным и неопределенным для врача.
Некоторые исследователи вообще довольно скептически относятся к возможностям практического использования этих показателей у больных РМЖ из-за существующей во многих западных странах тенденции к повсеместному применению адъювантной терапии. Вместе с тем, по крайней мере, в трех ситуациях молекулярно-биологические и морфологические прогностические факторы при РМЖ могут быть полезны: во-первых, для выявления пациентов с хорошим прогнозом, для которых осложнения и стоимость лечения не будут оправданы имеющимся риском рецидива; во-вторых, для выявления группы больных с неблагоприятным прогнозом,
которым требуется более агрессивное адъювантное лечение; в-третьих, для определения чувствительности или резистентности опухоли к конкретным видам терапии.
Кроме того, на основании исследования молекулярно-биологических особенностей РМЖ, может быть создана новая стратегия лечения, непосредственно влияющая на определенные молекулы и процессы. Знание специфических биологических характеристик опухоли может помочь и в усовершенствовании существующих схем терапии, и в развитии новых подходов к лечению, основанных, например, на иммунотерапии, генной терапии или на модификации системы передачи регуляторных сигналов в клетке.
Так, в экспериментальных исследованиях последних десятилетий установлено, что нарушения механизмов программированной гибели клеток (апоптоза) лежат в основе многих заболеваний, в том числе злокачественных опухолей, а среди них - рака молочной железы.
Основной характеристикой злокачественных новообразований является их способность к неограниченному росту, устойчивость к действию факторов, регулирующих процессы пролиферации и дифференцировки, а также инвазии и метастазированию.
Известно, что одним из ключевых рецепторов, запускающих апоптоз в клетке, является Fas/APO-l/CD95 -трансмембранный гликопротеин первого типа, относящийся к семейству рецепторов TNF/NGF (Itoh N. et al., 1991; Oehm A. et al., 1992; С.Г.Аббасова и соавт., 2000). Fas экспрессируется в различных тканях организма, он также экспонирован на поверхности активированных . лимфоцитов, натуральных киллеров, вирус-инфицированных и опухолевых клеток (Nagata S. и Golstein Р., 1995; Ю.М.Степанов и соавт., 2000). Подобно рецептору TNF р55, Fas запускает в клетке апоптоз после взаимодействия со своим лигандом (FasL) или агонистическими моноклональными антителами (МА) против Fas. В
последние годы усилиями многих исследователей были идентифицированы основные белки, участвующие в передаче апоптотического сигнала от активированного Fas, установлены их структура и функции. Взаимодействие Fas с FasL или агонистическими МА против Fas приводит к активации протеаз caspase-8 или caspase-2 через адапторные белки FADD/MORT-1 или RIP и RAIDD. FLICE-ингибирующий белок FLIP блокирует активацию caspase-8, таким образом, ингибируя апоптоз. Активированные протеазы расщепляют жизненно необходимые для клетки субстраты, такие как полиАДФрибозополимеразу, ламин и другие и опосредуют функциональные и морфологические изменения цитоплазмы и ядра клетки, типичные для апоптоза. Выявлены также мутации в генах Fas и FasL, приводящие к неэффективной работе Fas-системы. Причиной устойчивости различных типов клеток к Fas-зависимому апоптозу может быть повышенная продукция растворимого Fas (sFas) этими клетками. sFas связывается с FasL, ингибируя действие последнего, и обеспечивает клеткам-продуцентам растворимого Fas преимущества в выживании и размножении.
С помощью молекулярного клонирования и анализа нуклеотидной последовательности было показано, что sFas является продуктом альтернативного сплайсинга полноразмерной мРНК Fas (Cheng J. et al., 1994; Cascino I. et al., 1995). Показано существование нескольких растворимых форм sFas, среди которых преобладает одна - FasdelTM, а остальные синтезируются в незначительных количествах.
Актуальность настоящего исследования определяется
необходимостью количественного определения sFas в сыворотке крови больных РМЖ как одного из возможных факторов, определяющих "биологическое поведение" опухоли, а именно, ее агрессивность, устойчивость к химиогормоиотерапии, а стало быть определяет прогноз опухолевого процесса в каждой конкретной клинической ситуации.
В настоящее время, наряду с процессом апоптоза, большое внимание исследователи уделяют проблеме иеоангиогенеза в злокачественных опухолях молочной железы. И это связано с тем фактом, что опухоль не может развиваться и расти без образования в ней разветвленной сети сосудов, обеспечивающих клетки кислородом и питательными веществами.
Интерес к этой проблеме возник более 30 лет назад, и только относительно недавно, в результате изучения молекулярных механизмов ангиогенеза, был продемострирован целый ряд регуляторов ангиогенных факторов, в числе которых - фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Динамический баланс этих факторов обеспечивает формирование и распространение новых сосудов внутри опухоли (Тої М. et al., 1994). В настоящее время VEGF считается важным регулятором ангиогенеза, и называется также фактором проницаемости сосудов. Основными растворимыми формами VEGF являются молекулы размером 121 и 165 аминокислотных остатков, они же считаются и основными биологически активными формами VEGF. В первом иммуногистохимическом исследовании по экспрессии VEGF в опухолях у 103 больных РМЖ было показано, что плотность микрососудов и ее прирост достоверно выше в опухолях с интенсивным окрашиванием на VEGF, чем в опухолях со слабым окрашиванием. В последующем было доказано, что концентрация VEGF в сильно васкуляризированных опухолях достоверно выше, чем в слабо васкуляризированных (Toi М. et al., 1996). Также была предложена классическая модель регуляции иеоангиогенеза в РМЖ, она предусматривает наличие паракринной системы, в которой VEGF продуцируется опухолевыми клетками, а его рецепторы, воспринимающие сигнал, находятся на клетках эндотелия сосудов (Brown L.F. et al., 1999). Показано, что VEGF является антиапоптотическим фактором не только для эндотелиальных, но и для опухолевых клеток, индуцируя экспрессию bcl-2 (Pidgeon G.P. et al., 2001).
Цель настоящего исследования - сравнительный анализ клинического значения экспрессии растворимого Fas-антигена и интерлейкина-6 в сыворотке крови больных раком и доброкачественными новообразованиями молочной железы, а также экспрессии фактора роста эндотелия сосудов в опухоли, их связь с чувствительностью опухолей к эстрогенам и основными клиническими и морфологическими характеристиками заболевания, прогнозом.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Провести сравнительное определение частоты выявления и содержания
рецепторов эстрогенов в цитозольной фракции опухоли при РМЖ с
учетом стадии заболевания, возраста больных и репродуктивной функции.
-
Изучить частоту выявления и уровни sFas в крови больных раком, доброкачественными новообразованиями молочной железы и в крови практически здоровых женщин соответствующего возраста.
-
Проанализировать взаимосвязь частоты выявления и значений растворимого Fas-антигена в сыворотке крови больных злокачественными и доброкачественными новообразованиями молочной железы с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания, возрастом больных, репродуктивной функцией, чувствительностью опухоли к эстрогенам.
-
Изучить частоту выявления и уровни интерлейкина-б в сыворотке крови больных раком, доброкачественными новообразованиями молочной железы и практически здоровых женщин соответствующего возраста.
5. Провести сравнительный анализ взаимосвязи между показателями
; интерлейкина-6 в сыворотке крови и рецепторами эстрогенов в опухоли с
учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания.
-
Изучить взаимосвязь растворимого Fas-антигена и интерлейкина-6 в сыворотке крови у больных раком молочной железы в зависимости от распространенности опухолевого процесса и гистологического строения новообразования.
-
С помощью иммуногистохимического исследования провести анализ уровней экспрессии фактора роста эндотелия сосудов в первичной опухоли больных раком молочной железы и оценить их значение в прогнозе безрецидивной выживаемости.
-
Изучить взаимосвязь индекса пролиферативной активности антигена Ki-67 с уровнем экспрессии фактора роста эндотелия сосудов в первичной опухоли больных раком молочной железы, выявить их связь с основными клинико-морфологическими характеристиками болезни и прогнозом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика обследованных больных
Под нашим наблюдением находилось 140 больных РМЖ и 22 доброкачественными новообразованиями молочной железы в возрасте от 26 до 85 лет (53,6±1,0; медиана - 52 года). У 82 больных была сохранена менструальная функция; 80 пациенток были в постменопаузе длительностью от 2 до 38 лет(12,34±0,96; медиана- 10 лет).
Все больные обследовались и получали лечение в отделении радиохирургии Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН с января 1997 г. по февраль 2002 г.
Клинический диагноз новообразования молочной железы у всех подтвержден данными морфологического исследования удаленной опухоли и до проведения настоящего исследования специфического лечения больным не проводили.
Контрольную группу составили 55 практически здоровых женщин соответствующего возраста.
У 23 больных РМЖ диагностирована 1а стадия (T|N0M0), у 47 - Па (T2NoMo), у 35 - Иб (T2N,M0, T3N0M0), у 11 - Ilia (T,N2M0, T2N2M0) T3N,. 2Мо), у 22 - Шб (T4No.3Mo T0.4N3M0), у 2 - IV (,).
При доброкачественных новообразованиях молочной железы у 21 больной была выполнена секторальная резекция молочной железы и в одном наблюдении - туморэктомия с подмышечной лимфоаденэктомией со стороны поражения и торакоскопической лимфодиссекцией парастернальных лимфатических узлов.
При РМЖ 20 больным с 1-Па стадиями болезни выполнена радикальная резекция молочной железы; 61 больной с На-Ша стадиями -радикальная резекция молочной железы с торакоскопической лимфодиссекцией парастернальных лимфатических узлов; у 32 -радикальная мастэктомия с сохранением обеих грудных мышц; у 27 больных в связи с большой распространенностью опухолевого процесса была выполнена радикальная мастэктомия с сохранением обеих грудных мышц и торакоскопическая лимфодиссекция парастернальных лимфатических узлов.
В послеоперационном периоде 36 больных РМЖ не получали никакого лечения; 16 пациенток получали химиотерапию с использованием схем CAF или CMF; 51 больной проведена химиотерапия в сочетании с лучевой терапией на область послеоперационного рубца; 36 - только лучевая терапия на область послеоперационного рубца.
Для лечения 60 больных РМЖ во ІІб-IV стадии болезни, с рецепторположительными по РЭ опухолями, в комплексное лечение включали тамокснфен, после выключения функции яичников у женщин репродуктивного возраста или находящихся в пременопаузе.
При гистологическом исследовании операционного материала, среди доброкачественных новообразований молочной железы, в 3 наблюдениях
была выявлена внутрипротоковая папиллома, в 10 - фиброаденома, в 9 -фиброзно-кистозная болезнь.
При РМЖ в 97 образцах обнаружен протоковый инфильтративный рак, в 27 - дольковый инфильтративный рак, в 9 - смешанный, в 3 -внутрипротоковый, в 3 - слизистый, в 1 наблюдении - рак Педжета.
Лабораторные методы исследования
Определение растворимого Fas-антигена (sFas). sFas определяли иммуноферментным методом (Sandwich-ELISA) в сыворотке крови больных РМЖ и практически здоровых женщин контрольной группы по ранее разработанному методу в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН совместно с научными сотрудниками РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.
Рецепторы эстрадиола-17|3 определяли в цитозольной фракции опухолей молочной железы общепринятым радиолигандным методом, разработанным группой EORTC. В настоящем исследовании рецепторположительными (РЭ+) считали опухоли, в которых содержание РЭ было 10,0 и более фмоль/мг общего белка цитозольной фракции.
Иммуногистохимический метод исследования опухолей. Для иммуногистохимических исследований образцы тканей РМЖ фиксировали в 10% забуференном формалине, заливали в парафин с точкой отвердения 56С, готовили серийные срезы толщиной 3-5 мкм, а затем их депарафинировали по стандартной схеме.
Иммуногистохимическое исследование проводили пероксидазно-антипероксидазным методом (ПАП) с применением антител к VEGF (антитела VEGF (С-1): sc-726; фирма «Santa Cruz Biotechnology, Inc.», США; рабочее разведение антител 1:100); к Ki-67 (антитела Ki-S5; фирма «DAKO», Дания; рабочее разведение антител 1:50).
При использовании антител VEGF с целью демаскировки антигенных детерминант проводили предварительную обработку парафиновых срезов в микроволновом режиме (MW-processing) при мощности 750 Вт 2 раза по 5 мин с перерывом между процедурами 2 мин.
Для Ki-67 использовали микроволновую обработку тканевых срезов 3 раза по 5 мин при 750 Вт и 10 мин при 600 Вт соответствующими охлаждениями в течение 2 мин между каждой процедурой. Затем срезы охлаждали при комнатной температуре не менее 15-20 мин. После этого срезы промывали в ТРИС-буфере 2-5 мин, просушивали и инкубировали с первичными антителами в течение 60 мин при комнатной температуре, затем 18 часов при температуре +4С. Далее в качестве вторичных антител и пероксидазного комплекса использовали стандартный контрольно-иммунный тест фирмы "DAKO" (StreptABComplex/HRP, Mouse/Rabbit).
Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали раствор диаминобензидина с докрашиванием ядер клеток гематоксилином Майера.
Рассчеты интенсивности иммуногистохимического окрашивания образцов тканей рака молочной железы
Количественный метод использовали в оценке
иммуногистохимического окрашивания ядер клеток РМЖ при использовании антител к Ki-67. Рассчет проводили общепринятым методом: вычисляли индекс мечения или количество окрашенных ядер опухолевых клеток этим маркером на 100 опухолевых клеток при репрезентативных полях зрения. Этот показатель рассчитывали при анализе не менее 500-1000 клеток.
Полуколичественный метод использовали при анализе иммуногистохимического окрашивания антителами VEGF цитоплазмы раковых клеток и оценивали по 3-балльной системе: 0 баллов - отсутствие окрашивания; + (1 балл) - более 20% клеток со слабой интенсивностью
окрашивания цитоплазмы; ++ (2 балла) — умеренное окрашивание цитоплазмы раковых клеток; +++ (3 балла) - интенсивное окрашивание. Далее выводили среднее число баллов. В тех случаях, когда интенсивность окрашивания варьировала, например от + (1 балл) до ++ (2 балла), среднее получали -1,5 балла. Когда выявляли равномерное окрашивание цитоплазмы клеток РМЖ, тогда цифра, характеризующая интенсивность окрашивания, была округленной - + (1 балл), ++ (2 балла) или +++ (3 балла).
Статистический анализ полученных результатов проводили на персональном компьютере с использованием пакета программ Statistica for Windows, Release 6.0, STARSOFT Inc. Достоверность отличий средних значений оценивали по t-критерию Стьюдента. Во всех случаях различия считали достоверными при р<0,05.
