Содержание к диссертации
Введение 6
I. Обзор литературы и
1.1. Мультифункциональный белок YB-1 11
/././. Структура YB-1 И
1.1.2. Функции YB-1 12
1.1.3. YB-1 и пролиферация клеток 16
1.1.4. Активация YB-1 при стрессе 19
1.2. Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток 20
1.2.1. Лекарственная устойчивость, обусловленная снижением накопления препарата внутри клетки 22
1.2.1.1. Множественная лекарственная устойчивость, обусловленная Р-гликопротеином 22
/. 2.1.2. Множественная лекарственная устойчивость, определяемая белками семейства MRP :...27
1.2.1.3. Множественная лекарственная устойчивость и белок BCRP 28
1.2.1.4. Множественная лекарственная устойчивость, определяемая белком LRP. 29
1.3. Роль белка YB-1 в регуляции множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток 30
1.3.1. Экспрессия и внутриклеточная локализация YB-1 в культурах опухолевых клеток, резистентных к химиопрепаратам 30
1.3.2. Исследование участия YB-1 в регуляции генов и белков МЛУ. 32
1.3.3. Исследование взаимосвязи между уровнем экспрессии и внутриклеточной локализацией белка YB-1 с экспрессией белка Pgp и прогнозом лечения больных 34
П. Материалы и методы 37
II. 1. Линии клеток, использованные в работе 37
11.2. Препапаты, использованные в работе 37
ИЗ. Выделение РНК и ОТ-ИЦР. 37
П.4. Иммуноцитохимическое определение экспрессии YB-1 и белков МЛУ. 38
/7.5. Иммуноцитохимическое определение внутриклеточной локализации YB-1 и окраска клеток на белки МЛУ. 38
11.6. Иммунологический анализ клеточныхлизатов (Western-blot анализ) 40
11.7. Трансфекция клетокКВЗ-1 иНСТ116кДНК YB-1 41
11.8. Синтез и трансфекция siRNA/YB-1 41
11.9. Определение чувствительности клеток к цитостатикам 41
III. Результаты 42
III.l. Исследование экспрессии и локализации белка YB-1 в культивируемых линиях чувствительных и резистентных к лекарственным препаратам опухолевых клеток 42
III.l. 1. Модели исследования 42
III. 1.2. Анализ уровня экспрессии мРНК/белка YB-1 в клетках с разными уровнями лекарственной устойчивости 44
III. 1.3. Исследование локализации белка YB-1 в парах чувствительных и резистентных опухолевых клеток 46
III.l.4. Сопоставление уровня экспрессии и локализации белка YB-1 в парах чувствительных и резистентных опухолевых клеток с экспрессией генов/белков МЛУ. 49
НІ. 1.4.1. Анализ уровня экспрессии MDRl/Pgp 49
III.1.4.2. Определение уровня экспрессии генов/белков MRP I, BCRP, LRP 50
111.2. Влияние повышения экспрессии YB-1 на экспрессию генов/белков МЛУ и лекарственную устойчивость опухолевых клеток 55
Ш.2.1. Исследование влияния транзиторного введения YB-1 на лекарственную устойчивость опухолевых клеток 55
III.2.2. Исследование влияния транзиторного введения YB-I на экспрессию Pgp в условиях действия цитостатиков 57
Ш.2.3. Анализ влияния стабильной гиперэкспрессии YB-I на экспрессию генов/белков МЛУ. 58
III. 2.4. Определение скорости пролиферации клонов клеток с гиперэкспрессией YB-1 62
Ш.З. Влияние подавления экпрессии YB-1 на экспрессию генов/белков МЛУ (эффекты siRNA/YB-1) 63
///.5./. Подавление экспрессии эндогенного YB-1 и экспрессия генов МЛУ. 63
Ш.З.2. Влияние подавления эндогенного YB-1 на пролиферацию клеток 63
Ш.4. Влияние химиотерапевтических препаратов на локализацию YB-1 в клетках и на экспрессию генов МЛУ. 65
111.4.1. Влияние препаратов на локализацию YB-1 в клетках 65
111.4.2. Активация экспрессии генов МЛУ под действием цитостатиков 68
III.5. Определение уровня экспрессии мРНК YB-1 и белков МЛУ у больных острым нелимфобластным лейкозом (ОНЛЛ) 70
IV. Обсуждение 72
V. Выводы 83
VI. Список литературы 84
Введение к работе
Множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток (МЛУ) является серьезным препятствием на пути химиотерапии злокачественных новообразований. МЛУ - это система защиты популяции опухолевых клеток от множества лекарств, различающихся по химической структуре и механизму действия на клетку (Glavinas Н. et al., 2004; Ставровская А., 2000). Повышенная активность белка Р-гликопротеина (Pgp) была первым обнаруженным механизмом, определяющим МЛУ. В последующие годы были найдены другие молекулярные механизмы МЛУ и стало ясно, что лекарственная устойчивость опухолевых клеток — сложный феномен, в основе которого лежит целый ряд молекулярных изменений, и что в одной и той же клетке могут функционировать одновременно несколько механизмов, модулирующих чувствительность опухолевых клеток к лечению. Таким образом, на первый план в области изучении МЛУ выходят исследования молекулярных механизмов координированной регуляции разных защитных систем клетки, которые могут определять многофакторную МЛУ. С целью решения этой задачи мы исследовали роль белка YB-1 в регуляции МЛУ.
YB-1 клеток млекопитающих является членом мульти функционально го семейства ДНК/РНК связывающих белков с эволюционно консервативным доменом холодового шока (Kohno К. et al., 2003; Evdokimova V. et al., 1999). В бактериальных клетках члены этого семейства, известные как главные белки холодового шока, определяют адаптацию бактерий к росту при низких температурах. YB-1 млекопитающих, связываясь с ДНК, функционирует в качестве фактора транскрипции и регулирует экспрессию генов, содержащих Y-бокс, в том числе, экспрессию гена главного комплекса гистосовместимости II (Didier D. et al., 1988), гена множественной лекарственной устойчивости MDR1 (Ohga Т. et al., 1998) и генов циклинов (Jurchott К. et al., 2003). Наряду с этим, YB-1 участвует в репарации, рекомбинации и репликации t ДНК (Gaudreault I. et al., 2004). Взаимодействуя с мРНК, этот белок принимает участие в альтернативном сплайсинге мРНК в ядре (Raffetseder U. et al., 2003), является основным упаковочным белком для мРНК в цитоплазме и регулирует время жизни (Evdokimova V. et al., 2001) и матричную активность мРНК в белковом синтезе (Evdokimova V. et 1998). Показано, что YB-1 может быть вовлечен в определение устойчивости клеток к действию ионизирующей радиации и химических агентов, повреждающих ДНК (Ohga Т. et al., 1996). Высказывают мнение, что он может претендовать на роль раннего маркера множественной лекарственной устойчивости опухолей.
В феномене МЛУ опухолевых клеток могут играть роль как повышение количества YB-1 в клетках, так и его перемещение из цитоплазмы в ядра клеток (Kohno К. et al., 2003; Kuwano М. et al., 2004). В различных опухолях (раках молочной железы, раках легкого, остеосаркомах и др.) повышено количество клеток с ядерной локализацией YB-1 по сравнению с нормальными тканями, и найдено, что такое повышение коррелирует с неблагоприятным течением заболеваний и устойчивостью новообразований к терапии (Bargou R. et al., 1997; Shibahara К. et al., 2001). Показано, что ряд химиотерапевтических препаратов индуцирует перемещение YB-1 в ядра клеток (Ohga Т. et al., 1996). Найдено, что введение YB-1 в клетки рака молочной железы может приводить к гиперэкспрессии гена MDR1, кодирующего Pgp, и к возникновению МЛУ (Bargou R. et al., 1997). Однако роль YB-1 в возникновении и развитии МЛУ остается недостаточно ясной. В частности, отсутствуют систематизированные исследования резистентных опухолевых клеток. Немногочисленные работы, в которых сравнивались отдельные резистентные линии опухолевых клеток с соответствующими клетками дикого типа, показывают, что количество белка YB-1 повышено в ядрах культур резистентных клеток рака кишечника НСТ15, рака яичников KFr и рака молочной железы MCF-7/ADR по V сравнению с их чувствительными вариантами (Stein U. et al., 2001; Yahata H. et al., 2002). После введения в культивируемые клетки GSEs (генетических супрессорных элементов) и последующего отбора в среде с цитостатиком культура клеток приобрела МЛУ, что сопровождалось увеличением уровня экспрессии мРНК нескольких генов, в том числе и YB-1 (Levenson V. et al., 2000). Неясно, однако, насколько часто связаны гиперэкспрессия и/или ядерная локализация YB-1 с конститутивной гиперэкспрессией генов и белков МЛУ, действительно ли гиперэкспрессия YB-1 в резистентных опухолевых клетках влияет одновременно на экспрессию нескольких разных генов МЛУ. Эти сведения позволили ли бы судить о том, вовлечен ли YB-1 в регуляцию сложной, многофакторной МЛУ. Нет данных относительно связи YB-1 с уровнем резистентности культур опухолевых клеток различного тканевого происхождения. Результаты таких опытов позволили бы оценить, насколько широко YB-1 участвует в формировании МЛУ, на каких этапах развития МЛУ необходимо участие YB-1. Недостаточно исследовано влияние химиотерапевтических препаратов разных типов на локализацию YB-1 в клетке и на экспрессию генов МЛУ.
Целью данной работы является исследование молекулярных механизмов регуляции экспрессии белков, определяющих множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток, при участии многофункционального белка YB-1.
В задачи данного исследования входило следующее:
- Исследовать уровень экспрессии и локализацию гена/белка YB-1 в шести парах чувствительных и резистентных клеточных линий различного гистогенеза.
- Исследовать взаимосвязь уровня экспрессии YB-1 в резистентных клетках с экспрессией генов/белков МЛУ: Pgp, MRP1, BCRP, LRP.
- Исследовать влияние повышенного уровня экспрессии YB-1 на возникновение лекарственной устойчивости опухолевых клеток.
- Исследовать влияние активации или подавления экспрессии YB-1 на базальный уровень экспрессии нескольких генов/белков МЛУ.
- Исследовать влияние активации или подавления экспрессии YB-1 на клеточную пролиферацию.
- Исследовать стресс-индуцированную транслокацию YB-1 в ядра опухолевых клеток и активацию экспрессии генов МЛУ при воздействии на клетку химиотерапевтических препаратов.
Новизна: в настоящей работе впервые исследована взаимосвязь уровня экспрессии и локализации YB-1 с экспрессией нескольких генов МЛУ, а также с уровнями лекарственной устойчивости клеток одновременно в достаточно большом наборе чувствительных и резистентных клеточных линий различного гистогенеза. Впервые показано, что хотя в резистентных линиях разного происхождения количество клеток с локализацией YB-1 в ядрах повышено по сравнению с родительскими чувствительными вариантами, однако, это количество может значительно различаться в разных линиях. Впервые обнаружено, что уровень экспрессии YB-1 в резистентных вариантах клеток повышен иногда, но не всегда и не коррелирует с уровнем лекарственной устойчивости клеток. Впервые показано, что повышение количества YB-1 может коррелировать с повышенным уровнем экспрессии нескольких генов/белков МЛУ. Впервые найдено, что увеличение (в результате стабильной трансфекции клеток конструкцией, содержащей YB-1) или подавление в клетках уровня экспрессии гена YB-1 (под влиянием siRNA/УВ-У) сопровождается, соответственно, либо активацией, либо супрессией базального уровня экспрессии нескольких генов МЛУ. Впервые показано, что введение в клетки полноразмерного гена YB-1 приводит к повышению экспрессии генов МЛУ MRP1, BCRP, LRP и повышению количества кодируемых ими белков. Получены оригинальные данные, показывающие, что количество мРНК гена MDR1 при этом не повышается. Впервые найдено, что некоторые химиотерапевтические препараты (винбластин и цисплатин) индуцируют перемещение белка YB-1 в ядра клеток, в то время как другие препараты (цитарабин и доксорубицин) не оказывают этого действия. Впервые показано, что лишь препараты, вызывающие перемещение YB-1 в ядра клеток, индуцируют повышение количества мРНК гена MRP1, в то время как количество мРНК гена MDR1 повышается всеми препаратами, независимо от их способности индуцировать транслокацию YB-1 в ядра. Впервые исследован материал от больных острым нелимфобластным лейкозом и показано, что повышенному количеству белка YB-1 сопутствует повышенное количество белка MRP1 в лейкозных клетках.
