Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Механизмы эпигенетической регуляции экспрессии генов 10
1.1.1. Метилирование ДНК 12
1.1.2. Модификации гистонов 18
1.1.3. РНК – интерференция 23
1.1.4. Реализация эпигенетического молчания или взаимосвязь механизмов эпигенетической регуляции 27
1.2. Химический канцерогенез 30
1.2.1. Генотоксические и эпигенетические канцерогены 34
1.2.2. Влияние химических канцерогенов на эпигенетическую регуляцию экспрессии генов 44
2. Материалы И Методы 53
2.1. Клеточные культуры 53
2.2. Плазмидные векторы 53
2.3. Получение вирусного стока, инфицирование и анализ GFP экспрессии. 54
2.4. Выделение субпопуляции клеток, содержащей эпигенетически инактивированный геном вируса саркомы птиц 54
2.5. Трансфекция с использованием двухцепочечных олигонуклеотидных РНК-дуплексов (siRNA) 57
2.6. Определение белка методом Вестерн-блоттинг 58
2.7. Иммунопреципитация хроматина (ChIP) 59
2.8. Количественная ПЦР в реальном времени 60
2.9. Анализ метилирования методом бисульфитного секвенирования 61
2.10. Анализ метилирования методом ELISA 62
2.11. Анализ метилирования методом метилчувствительной ПЦР.. 63
2.12. Статистическая обработка данных 64
3. Результаты исследования 65
3.1. Характеристика модельной системы 65
3.1.1. Влияние сайтов интеграции ретровирусного вектора на реактивирующее действие химических соединений .. 65
3.1.2. Определение гистоновых модификаций на промоторе и гене GFP 68
3.1.3. Анализ метилирования ДНК интегрированного провируса 70
3.2. Реактивирующее действие химических соединений 74
3.2.1. Реактивирующее действие эпигенетических препаратов. 74
3.2.2. Тестирование химических соединений на модели HeLa-TI 75
3.2.3. Влияние химических соединений на общий уровень гистоновых модификаций.. 80
3.2.4. Изменение общего уровня метилирования 82
3.2.5. Влияние химических соединений на уровень метилирования ДНК клеток HeLa-TI при реактивации экспрессии GFP в результате обработки химическими соединениями.. 83
3.3. Изучение эпигенетических эффектов узкобороздочных лигандов 85
3.3.1. Анализ реактивирующего действия узкобороздочных лигандов 85
3.3.2. Влияние УБЛ на гистоновые модификации в модельной системе HeLa-TI 86
3.3.3. Влияние УБЛ на уровень метилирования ДНК клеток HeLa-TI 88
3.4. Взаимосвязь процессов модификации гистонов и ДНК метилирования 89
3.4.1. Совместное действие УБЛ и эпигенетических ингибиторов 89
4. Обсуждение результатов 94
4.1. Особенности используемой модельной системы 94
4.1.1. Распределение гистоновых модификаций на интегрированном векторе 96
4.1.2. Метилирование ДНК интегрированного провируса 99
4.2. Реактивирующее действие канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков 102
4.3. Действие узкобороздочных лигандов 111
4.4.Синергическое действие химических препаратов 115
Заключение 119
Выводы 121
Список цитируемой литературы
- Модификации гистонов
- Трансфекция с использованием двухцепочечных олигонуклеотидных РНК-дуплексов (siRNA)
- Влияние сайтов интеграции ретровирусного вектора на реактивирующее действие химических соединений
- Метилирование ДНК интегрированного провируса
Введение к работе
Актуальность темы. Химические канцерогены являются одним из самых распространенных этиологических факторов онкологических заболеваний человека. Наряду с индукцией повреждений структуры ДНК, они могут влиять на процессы метилирования ДНК, модификации гистонов и РНК-интерференции, вызывая изменения эпигенетической регуляции экспрессии генов. Такие изменения, в свою очередь, приводят к нарушению механизмов регуляции большинства биологических процессов: клеточной дифференцировки, пролиферации, репарации ДНК и апоптоза, что в конечном итоге вызывает опухолевую трансформацию и способствует опухолевой прогрессии. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что помимо канцерогенных соединений эпигенетически активными являются также противоопухолевые препараты, относящиеся к алкилгалогенидам, алкенам, эпоксисоединениям. Они способны необратимо ингибировать метилтрансферазы, эпигенетически модулируя экспрессию генов. Имеются также отдельные данные о влиянии некоторых химиопрепаратов на состояние гистонов, что играет большую роль в репарации повреждений ДНК, обеспечивая эффективность комбинированной химиотерапии. Однако, несмотря на активное развитие исследований отдельных эпигенетических изменений в процессе канцерогенеза и при проведении химиотерапии, проблема оценки эффектов химических соединений на реактивацию эпигенетически репрессированных генов изучена недостаточно. Таким образом, изучение влияния канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на эпигенетические механизмы регуляции экспрессии генов является актуальной задачей современной молекулярной онкологии. Помимо более детального понимания молекулярных механизмов влияния ксенобиотиков на системы эпигенетической регуляции генов, данное исследование представляется целесообразным в плане определения новых стратегий создания химиотерапевтических препаратов, а также скрининга потенциально опасных вновь синтезированных химических соединений.
Основные цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является изучение влияния канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на процессы эпигенетической регуляции экспрессии генов.
В соответствии с основной целью нашего исследования были поставлены следующие
4 задачи:
-
Оценить возможность использования модельной системы, представляющей собой субпопуляцию HeLa клеток, несущую ретровирусный вектор с эпигенетически репрессированным репортерным геном зеленого флуоресцентного белка GFP, для скрининга химических соединений на способность реактивировать экспрессию генов.
-
Провести скрининг химических канцерогенов и химиотерапевтических препаратов на способность реактивировать экспрессию генов на данной модельной системе.
-
Оценить эффекты канцерогенов и химиотерапевтических препаратов, вызвавших реактивацию экспрессии GFP, на метилирование ДНК.
4. Исследовать влияние канцерогенов и химиотерапевтических препаратов на
модификации гистонов.
5. Изучить влияние соединений, оказавших реактивирующее действие на экспрессию
GFP, на активность отдельных факторов эпигенетической регуляции экспрессии генов.
Научная новизна. В данном исследовании впервые был предложен метод скрининга канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на модельной системе клеток человека, несущих эпигенетически репрессированный ретровирусный геном, содержащий флуоресцентный белок GFP. В результате скрининга был исследован эффект широкого ряда химических и противоопухолевых ксенобиотиков на реактивацию транскрипции эпигенетически репрессированных генов, исследовано их влияние на гистоновые модификации и метилирование ДНК. Впервые продемонстрированы эпигенетические эффекты противоопухолевых препаратов Bortezomib, MLN4924, Mimosine, Bleomycin. Также было показано, что реактивацию экспрессии генов способны вызывать соединения класса узкобороздочных лигандов, что является одним из первых экспериментальных свидетельств влияния соединений Hoechst 33342 и Hoechst 33258 на модификации гистонов и метилирование ДНК. Впервые был показан синергизм действия данных соединений в различных комбинациях с эпигенетическими препаратами (трихостатином-А (TSA) и 5-азацитидином (5-azaC)).
Научно-теоретическая и практическая значимость исследования. На основании результатов настоящего исследования было расширено понимание механизмов химического канцерогенеза, в частности, для Bleomycin, известного генотоксического
5 агента, вызывающего двунитевые разрывы, выявлена способность к эпигенетической регуляции экспрессии генов. Также в работе был оптимизирован метод быстрого скрининга канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков, позволяющий выявлять соединения, вызывающие значимую реактивацию экспрессии эпигенетически репрессированных генов. Оценка влияния канцерогенных и противоопухолевых ксенобиотиков на эпигенетические механизмы регуляции генов может послужить руководством к выбору стратегий синтеза новых химиотерапевтических препаратов и разработки путей их внедрения в клинику.
Личный вклад автора. Автором самостоятельно проведен аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой теме, разработан план исследования и проведены все необходимые эксперименты. Математико-статистическая обработка данных, полученных в результате исследования, проводилась с личным участием автора. Автором был осуществлен анализ полученных данных, интерпретация результатов экспериментов, сформулированы выводы и оформлена диссертационная работа.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 - «онкология», пунктам 1, 2, 3.
Положения, выносимые на защиту:
Модельная клеточная линия HeLa-TI, несущая эпигенетически репрессированный ретровирусный геном, содержащий зеленый флуоресцентный белок GFP, является адекватной системой для быстрого скрининга химических соединений на способность реактивировать эпигенетически репрессированные гены.
В ходе скрининга широкого ряда химических соединений в их механизме действия выявлен эпигенетический эффект, приводящий к реактивации эпигенетически репрессированных генов как путем изменения профиля метилирования ДНК, так и путем различных охарактеризованных в работе модификаций гистонов.
Принадлежащие к группе узкобороздочных лигандов соединения Hoechst 33258 и Hoechst 33342, отличающиеся лишь заместителями в пара-положении фенильного кольца, реактивируют экспрессию эпигенетически репрессированных генов по различным механизмам: Hoechst 33258 - за счет снижения метилирования ДНК в промоторной области гена и увеличения уровня ацетилирования гистонов НЗ/Н4, а Hoechst 33342 - только путем
6 изменения модификаций гистонов, без влияния на метилирование ДНК.
Апробация работы и публикации. Диссертация апробирована и рекомендована к защите 4 июля 2013 года на совместной научной конференции отделов химического канцерогенеза, трансформирующих генов опухоли, эпидемиологии и профилактики опухолей и лабораторий вирусного канцерогенеза, механизмов прогрессии эпителиальных опухолей, цитогенетики, генетики опухолевых клеток, молекулярной эндокринологии НИИ Канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 4 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 25 рисунков и 6 таблиц. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследования», «Обсуждение результатов», «Выводы», «Список цитируемой литературы». Список литературы содержит 348 литературных источников, в том числе 8 в отечественных рецензируемых изданиях.
Модификации гистонов
DNMT3A и DNMT3B. К de-novo ДНК метилтрансферазам в настоящее время относят белки DNMT3A и DNMT3B. Об их участии в de-novo метилировании свидетельствует высокий уровень их активности в эмбриональных клетках и независимость их экспрессии от фаз клеточного цикла [Okano, Bell et al., 1999]. Однако во время S-фазы клеточного цикла были обнаружены локусы, содержащие DNMT3A и частично перекрывающиеся с локусами репликации [Bachman, Rountree et al., 2001]. По сравнению с экспрессией DNMT3A, распространенной в тканях повсеместно, уровень экспрессии DNMT3B значительно ниже. Основную роль DNMT3B играет в в сперматогенезе, так как в тканях яичка наблюдается наиболее высокий уровень экспрессии этого белка [Okano, Bell et al., 1999; Robertson, Uzvolgyi et al., 1999]. Также была показана ассоциация данных белков с транскрипционными факторами [Fuks, Burgers et al., 2001].
К настоящему времени известно три возможных механизма de-novo метилирования ДНК: (1) DNMT3 ферменты сами способны распознавать ДНК или хроматин за счет специфического PWWP-домена; (2) DNMT3A и DNMT3B могут привлекаться за счет белковых взаимодействий с транскрипционными репрессорами или другими факторами; (3) система РНК- интерференции может привлекать ферменты de-novo метилирования к специфическим последовательностям ДНК [Klose and Bird, 2006]. Тем не менее, механизмы образования нового профиля метилирования ДНК остаются изученными не до конца. Кроме того, для DNMT3A и DNMT3B было показано участие и в процессе поддержания метилирования ДНК [Liang, Chan et al., 2002; Chen, Ueda et al., 2003].
DNMT2. ДНК-метилтрансфераза DNMT2 была изначально отнесена к семейству ДНК-метилтрансфераз по гомологии ее каталитического домена с другими ДНК-метилтрансферазами [Okano, Xie et al., 1998]. Однако ферментативная метилтрансферазная активность данного белка значительно ниже по сравнению другими ДНК-метилтрансферазами (DNMT1, DNMT3A и DNMT3B) [Jeltsch, Nellen et al., 2006]. Также позднее была продемонстрировано участие данного белка в метилировании РНК [Schaefer, Pollex et al.] DNMT3L. ДНК-метилтрансфераза 3L (DNMT3L) не обладает метилтрансферазной активностью, но может стимулировать активность DNMT3A и DNMT3B [Suetake, Shinozaki et al., 2004]. Снижение уровня транскрипции при участии DNMT3L происходит за счет белок-белкового взаимодействия с другими ДНК-метилтрансферазами и образования репрессорного комплекса при участии гистоновых деацетилаз и метилтрансфераз [Aapola, Liiv et al., 2002; Deplus, Brenner et al., 2002].
Метилирование ДНК является стабильной и наследуемой модификацией, однако она может быть обратима под воздействием деметилирующих агентов - ингибиторов ДНК-метилтрансфераз [Xiao, Ding et al., 2006].
В 2009 году было описано гидроксиметилирование цитозина как новая модификация ДНК, однако в настоящее время его роль остается слабо изученной. Эта модификация найдена в большинстве клеточных типов, включая нейроны и стволовые клетки [Stroud, Feng et al.; Лихтенштейн А.В. , 2001; Киселева Н.П., 2005; Kriaucionis and Heintz, 2009]. Было показано, что при процессинге метилцитозина in vitro и in vivo может образовываться гидроксиметилцитозин [Tahiliani, Koh et al., 2009]. таким образом данный аспект создает новое направление в области изучения регуляции экспрессии генов на уровне ДНК. Скрининг распределения гидроксиметилирования в геноме стволовых плюрипотентных клеток показал ассоциацию данной модификации с энхансерными и промоторными областями некоторых генов, а также с монометилированием H3K4 и ацетилированием H3K27 (модификациями, характерными для активно транскрибируемых промоторов и энхансерных областей) [Stroud, Feng et al.; Szulwach, Li et al.]. Структурное сходство 5-метилцитозина и гидроксиметилцитозина усложняет анализ функций данных модификаций в процессе исследований. Было показано, что наличие гидроксиметилцитозина может ингибировать связывание МВР-белков с ДНК и ингибировать функцию поддерживающей DNMT1 [Valinluck, Tsai et al., 2004; Valinluck and Sowers, 2007].
Список генов, эпигенетическая инактивация которых в опухолевых клетках происходит путем метилирования промоторов, постоянно растет [Залетаев Д.В., 2008]. Было установлено, что профиль метилированных генов представляет собой уникальную характеристику опухоли и может быть использован для классификации заболевания или определения стадии его развития. В настоящее время многие группы исследователей разрабатывают алгоритмы использования некоторых генов с высокой частотой метилирования в качестве маркеров для диагностики, определения групп риска возникновения рака, прогноза и мониторинга заболевания, а также проводят дизайн и испытания противоопухолевых препаратов на основании ингибиторов метилирования [Jones and Baylin, 2002; Baylin, 2005; Kisseljova and Kisseljov, 2005; Киселева Н.П., 2005; Кирсанова О.В., 2009].
У эукариот основание нуклеосомы составляют гистоновые белки. Тетраметр из гистонов Н3 и Н4 и двух гетеродимеров Н2А и Н2В образуют ядро нуклеосомы. У высших эукариот гистоновый белок Н1 осуществляет конденсацию хроматина и обеспечивает взаимодействие нуклеосом между собой [Francis, Kingston et al., 2004]. Степень конденсации хроматина регулирует доступность ДНК для транскрипционных факторов [Luger, Mader et al., 1997; Suto, Clarkson et al., 2000]. ДНК в составе эухроматина характеризуется наличием транскрипционной активности. Переход из эухроматина в гетерохроматин характерен для нетранскрибируемых областей в интерфазе и обеспечивает конденсацию хромосом непосредственно перед делением клетки.
Пространственная структура отдельного гистона представляет собой глобулярное ядро, осуществляющее димеризацию, и неструктурированный N-концевой домен, определяющий стабильность нуклеосомы [Hayes, Clark et al., 1991]. Особенностью N-концевых участков гистонов является их способность подвергаться большому числу модификаций: метилированию, ацетилированию, фосфорилированию, АДФ-рибозилированию, убиквитинированию, сумоилированию, деиминированию и изомеризации пролина. N-концевые участки гистонов могут быть одновременно модифицированы по нескольким аминокислотным остаткам [Barski, Cuddapah et al., 2007; Kouzarides, 2007]. Кроме того, некоторые аминокислоты (лизин и аргинин) могут находиться в состояниях моно-, ди- и триметилирования (моно- и диметилирования для аргинина). На рисунке 2 представлена схема образования нуклеосомы и возможных модификаций гистонов [Marks, Rifkind et al., 2001].
Такое разнообразие модификаций дает огромное количество потенциальных функциональных вариантов и позволяет предполагать наличие уникального гистонового кода, определяющего не только степень конденсации хроматина, но и уровень экспрессии генов [Jenuwein and Allis, 2001; Turner, 2002]. Изменение модификаций гистонов - очень динамичный процесс, что представляет дополнительную сложность в изучении роли модификаций гистонов в эпигенетической регуляции генов.
Трансфекция с использованием двухцепочечных олигонуклеотидных РНК-дуплексов (siRNA)
В настоящее время изучены различные пути активации химических канцерогенов. На основе этого различают канцерогены прямого действия, которые обладают первичной канцерогенной активностью и не требуют какого-либо видоизменения в организме и проканцерогены, нуждающиеся в метаболической активации. Так как большинство проканцерогенов гидрофобны, способ их выведения из организма сводится, в основном, к повышению их водорастворимости [McCoy, Rosenkranz et al., 1990]. В данном процессе принимает участие система цитохрома Р450 (CYP).
Цитохром Р450 впервые был открыт Клингенбергом и представляет собой индуцируемый гемопротеин, который катализируют расщепление различных веществ с участием донора электрона НАДФН и молекулярного кислорода [Klingenberg, 1958]. По характеру катализируемых реакций цитохром Р450 был обозначен как оксидаза со смешанной функцией, поскольку в широкий круг катализируемых им процессов входят не только монооксигеназные, но и оксидазные реакции. Ферменты системы цитохрома Р450 локализованы в мембранах эндоплазматического ретикулума, в наружных мембранах митохондрий и ядерной оболочке [Szczesna-Skorupa and Kemper, 2008]. Одной из основных функций этой системы является удаление из клетки гидрофобных ксенобиотиков путем их окисления и превращения в более гидрофильные соединения.[Ingelman-Sundberg, 2005]. В организме цитохром Р450 существует в виде множества изоформ, обладающих различной, иногда перекрывающейся субстратной специфичностью. При этом один и тот же субстрат может метаболизироваться несколькими изоформами с образованием одинаковых или разных производных [Danielson, 2002]. В зависимости от преобладания в клетке тех или иных изоформ изменяется спектр метаболизма проканцерогена и, в частности, соотношение продуктов активации и детоксикации. У представителей одного вида каждая изоформа CYP может быть представлена набором вариантов, отличающихся по своей активности. Таким генетическим полиморфизмом в значительной степени обусловлено существование межвидовых, внутривидовых, половых, тканевых и клеточных различий в чувствительности к канцерогенам [Ingelman-Sundberg, Sim et al., 2007; Wijnen, Op den Buijsch et al., 2007]. Многие ферменты семейства генов CYP1, CYP2, CYP3 и CYP4 принимают участие в метаболизме эйкозаноидов, обмене жирных кислот, лейкотриенов и др.[Panigrahy, Kaipainen et al., 2010]. Например, CYP1A2, гидроксилируя эстрогены, изменяет их активность, что существенно для промоции опухолей из гормонозависимых тканей [Long, Cai et al., 2007]. Некоторые изоформы, экспрессируемые генами семейств CYP2, CYP3 и CYP4, кроме ксенобиотиков метаболизируют желчные кислоты, тестостерон, холестерин и другие эндогенные субстраты, производные которых могут оказывать промоторный эффект.
Реакции второго этапа метаболизма ксенобиотиков сводятся в основном к образованию гидрофильных конъюгатов, легко выводимых из организма, и обеспечиваются ферментами, находящимися, в цитоплазме [Guengerich, 1992]. В ходе этих реакций продукты метаболической активации гидрофобных проканцерогенов превращаются в комплексные соединения. Для большинства ксенобиотиков это путь детоксикации, а для некоторых проканцерогенов – необходимый промежуточный этап в дальнейших реакциях активации.
Эпоксидгидролазы превращают эпоксиды в трансдигидродиолы, которые соединяются затем с глюкуроновой кислотой, глютатионом или сульфатом и экскретируются в виде нейтральных комплексов [Morisseau and Hammock, 2005]. Модификация бензена под действием эпоксидгидролаз приводит к активации молекулы и ее превращению в канцерогенный метаболит [Bauer, Faiola et al., 2003]. Бензол под действием эпоксидгидролаз превращается в орто- и парабензохиноны – метаболиты, вызывающие лейкоз [Gillis, Gavin et al., 2007].
Глутатион-S-трансферазы катализируют перенос глутатиона на электрофильные соединения (оксиарены, эпоксиды алкенов, ионы нитрония, ионы карбония и свободные радикалы). Это приводит к нейтрализации активных метаболитов бензола, афлатоксина, ПАУ и к активации хлористого метилена или дибромэтилена [Hishida, Terakura et al., 2005].
УДФ-глюкуронилтрансферазы также инактивируют многие электрофильные соединения, но активируют производные гетероциклических аминов. В кишечнике комплексы расщепляются р-глюкуронидазой и в конечном итоге превращаются в высокореактивные электрофилы – N-ацетоксиариламины. Считается, что эти соединения играют существенную роль в возникновении рака толстого кишечника у человека [Fahmy and Fahmy, 1976].
Ацетилтрансферазы ацетилируют аминогруппы ариламинов и гидразинов, что является необходимым этапом их активации и (или) детоксикации, при этом 2-аминофлуорен активируется, а 2-нафтиламин и бензидин детоксицируются [Chung, Chang et al., 2000; Carreon, Ruder et al., 2006]. Полиморфизм ферментов NAT2 и NAT1 обеспечивает различие в активности данных белков в десятки раз. [Hein, Doll et al., 2000; Windmill, Gaedigk et al., 2000; Walker, Ginsberg et al., 2009]. Фенотип медленного ацетилирования также связан с мутациями гена NAT2, которые приводят либо к снижению активности фермента, либо к уменьшению его стабильности [Lin, Han et al., 1993] У людей с первым типом профессиональный рак мочевого пузыря, индуцируемый 2-нафтиламином и бензидином , развивается значительно реже [Carreon, Ruder et al., 2006; Walker, Ginsberg et al., 2009].
Сульфотрансферазы представлены в клетке множеством изоформ с различной активностью. В большинстве случаев образование сульфатов увеличивает водорастворимость и снижает фармакологическую и канцерогенную активности ксенобиотиков [Gamage, Barnett et al., 2006]. Обратный эффект наблюдается, когда образуются нестабильные сульфатные конъюгаты, которые, разрушаясь, образуют сильные электрофильные соединения. Сульфоконъюгация является необходимым этапом активации аминофлуоренов, ариламинов и некоторых других проканцерогенов [Jakoby, 1980].
Таким образом, прямые канцерогены и электрофильные метаболиты проканцерогенов взаимодействуя с нуклеофильными центрами повреждают многие клеточные структуры.
Генотоксические канцерогены. Генотоксические канцерогены способны повреждать ДНК без дополнительной активации, обеспечивая при этом все три стадии канцерогенеза -инициацию, промоцию и прогрессию. Основой их действия является прямое или непрямое повреждение генетического аппарата клетки, результатом которого является ее злокачественная трансформация. В клетке, подвергшейся воздействию химического канцерогена при значительных повреждениях ДНК происходит запуск апоптоза. Способ репарации ДНК напрямую зависит от типа повреждения ДНК, которое включает образования аддуктов, сшивок цепей, модификации оснований, индукции гидролиза N-гликозидных и фофодиэфирных связей, а также нарушения работы ферментов метаболизма ДНК.
Влияние сайтов интеграции ретровирусного вектора на реактивирующее действие химических соединений
Изменение модификаций хроматина при химическом канцерогенезе. Одним из механизмов возникновения наследуемых эпигенетических эффектов является изменение гистонового кода. Функции различных модификаций гистонов (метилирования, ацетилирования, фосфорилирования, убиквитинирования и т.д.) в эпигенетической регуляции были рассмотрены выше. Среди прочих функций структура хроматина определяет доступность поврежденных участков ДНК для ферментов систем репарации. Ацетилирование гистонов, фосфорилирование или метилирование их аминокислотных остатков, соответственно, несет информацию и о локализации повреждений ДНК.
Химические канцерогены, в числе других эффектов, индуцируют двухцепочечные разрывы ДНК, которые наиболее часто приводят к возникновению мутаций и хромосомных аберраций. В репарации этих разрывов большую роль играет состояние гистонов, модификации которых могут приводить к генетическим изменениям. Например, изменение структуры N-концевого участка гистона Н4, нарушающее нормальное ацетилирование лизина, увеличивает количество химически индуцированных мутаций и хромосомных аберраций в период S-фазы клеточного цикла. Также данный эффект сопроваждается замедлением прохождения контрольных точек S-фазы и замедлением репарации ДНК [Choy and Kron, 2002]. Тот же процесс может происходить и в результате индуцированного канцерогенами изменения транскрипции гена путем связывания регуляторов чекпойнтов клеточного цикла с гистонами. Такой механизм показан для 53BP1 - белка, участвующего в распознавании двухцепочечных разрывов ДНК. Появление двухцепочечных разрывов изменяет структуру хроматина таким образом, что в участке разрыва появляется метиллизин 79 гистона Н3, который служит специфическим местом связывания 53BP1. Поскольку метилирование гистона H3K79 при повреждении ДНК происходит обязательно, считается, что оно необходимо для функции распознавания повреждений [Loizou, Murr et al., 2006; Murr, Vaissiere et al., 2007]. Очевидно, что всякого рода нарушения этого процесса затрудняют распознавание повреждений и повышают риск возникновения мутаций .
Таким образом, изменение гистонового кода ведет не только к нарушениу процессов репарации, но и транскрипции, репликации и работы контрольных точек клеточного цикла. Они же создают условия возникновения и накопления мутаций, инициирующих необратимые процессы канцерогенеза и прогрессии опухоли. В этих случаях генетические изменения возникают как следствие первичных эпигенетических процессов [Murr, Vaissiere et al., 2007]. Первичный характер таких изменений в генезе опухолей человека строго доказан пока для немногих опухолей, например, для спорадического рака толстого кишечника, проявляющегося при эпигенетическом выключении супрессоров RB1 и VHL или гена репарации мисмэтчей hMLH [Strahl and Allis, 2000; Feinberg, Ohlsson et al., 2006; Hake, Xiao et al., 2007; Jacinto and Esteller, 2007].
Влияние ксенобиотиков на микроРНК. В настоящий момент, когда изучение роли миРНК в химическом канцерогенезе находится на стадии накопления данных, есть сведения о том, что экспрессия некоторых из них может ингибироваться канцерогенными соединениями вместе с приобретением клеткой злокачественных свойств [Nakajima and Yokoi, 2011].
Так, при внесении мышьяка в виде NaAsO2 в культуру иммортализованных нормальных клеток бронхиального эпителия человека при нокдауне p53, приводила к ее злокачественной трансформации, сопровождавщейся не только эпителиально-мезенхимальным переходом, но и снижением концентрации мкРНК miR-200. Возобновление экспрессии miR-200b приводила к обратному эффекту, с восстановлением исходного фенотипа. Более того, экспрессия miR-200b в исходных нормальных клетках приводила к резистентности клеток к малигнизирующему действию NaAsO2 [Wang, Zhao et al., 2011].
Другим примером служит обработка культуры псевдонормальных клеток бронхиального эпителия человека диолэпоксидом бенз(а)пирена, который снижает экспрессию miR-506. Ее восстановление ингибирует экспрессию N-Ras, а также пролиферацию опухолевых клеток и рост опухоли, перевитой бестимусным мышам [Zhao, Liu et al., 2011].
Пролифераторы пероксисом активируют альфа-рецептор (PPARalpha) гепатоцитов, что приводит к ингибированию miR let-7C, которая, в свою очередь, является ингибитором онкогена c-myc. С-myc приводит к активации экспрессию онкогенного кластера mir-17-92 [Shah, Morimura et al., 2007]. На ранних стадиях индукции опухолей легких у крыс с помощью табакоспецифичного канцерогена 4-(метилнитрозамино)-1-(3пиридил)-1-бутанона отмечено снижение экспрессии miR-101, miR-126, miR-199 and miR-34, наблюдающееся также в опухолях легких человека. Подавление экспрессии miR-126 коррелировало с усилением экспрессии CYP2A3, превращающей данное вещество в его электрофильное производное [Kalscheuer, Zhang et al., 2008].
Таким образом, с одной стороны, миРНК могут влиять на все стадии канцерогенеза, в том числе и модифицируя важные сигнальные пути [Calin and Croce, 2007]. С другой, электрофильные метаболиты канцерогенов могу вызывать мутации в кластерах генов, кодирующих миРНК - как в независимых транскрипционных единицах, так и в тех, которые находятся в интронах белок-кодирующих генов.
В заключение следует отметить, что анализ влияния ксенобиотиков на процесс канцерогенеза через различные механизмы эпигенетической регуляции экспрессии генов сложен, так как эпигенетические характеристики клетки весьма динамичны, они являются тканеспецифичными, зависят от степени дифференцировки клетки, стадии клеточного цикла и т.д. Однако к настоящему моменту стала очевидной необходимость организации широкого тестирования ксенобиотиков на эпигенетическую канцерогенную активность. Данные о возможности существенного изменения паттерна экспрессируемых белков с помощью ксенобиотиков, запускающих эпигенетические механизмы как способствующие, так и препятствующие канцерогенезу, раскрывают новые возможности, как в плане профилактики онкологических заболеваний, так и для развития ранней диагностики, разработки новых методов химиотерапевтического лечения и мониторинга заболевания.
В таблице 4 приведены наиболее интересные данные о влиянии канцерогенных соединений, промоторов канцерогенеза и антиканцерогенных препаратов на процессы эпигенетической регуляции.
Метилирование ДНК интегрированного провируса
Далее мы исследовали влияние химических соединений на общий уровень гистоновых модификаций. Для этого нами были отобраны соединения, продемонстрировавшие положительный эффект на реактивацию экспрессии гена GFP в клетках HeLaI на предыдущем этапе работы. В эту группу попали: все узкобороздочные лиганды, генотоксических препарат Bleomycin, ингибиторы топоизомераз Camptothecin и Etoposide, ингибитор активности протеасомы 26S – MG132, индуктор оксидативного стресса триоксид мышьяка, ингибитор убиквитинирования MLN, глюкокортикостероид флуоцинолона ацетонид, а также гормональный канцероген Бисфенол А. В качестве положительного контроля были использованы TSA и 5-azaC.
Измерение уровня модификаций гистонов проводили методом Вестерн-блоттинга. Клетки HeLaI инкубировались с химическими соединениями в концентрации 5мкМ (для TSA - 1 мкМ) в течение 24 часов. На рисунке 15 представлен анализ изменений гистоновых модификаций. На рисунке 15А показано изменение триметилирования лизинов гистонов H3 и H4 в положениях 9 (H3K9me3) и 20 (H4K20me3) соответсвенно. Эти модификации характерны для нетранскрибируемых генов. Ожидаемое снижение уровня этих модификаций после обработки клеток по сравнению с интактными клетками HeLaI наблюдалось для модификации H4K20me3 практически во всех образцах. Исключение составили 5-azaC, Hoechst 42 и Camptothecin, а наибольшие изменения наблюдались при обработке клеток соединениями TSA и MG132. Снижение уровня метилирования H3K9me3 (модификации, характерной для нетранскрибируемых генов) было наиболее выражено в образцах клеток, обработанных Camptothecin и MG132, тогда как для остальных количество данной модификации оставалось на уровне интактного контроля.
На рисунке 15Б представлены результаты анализа изменений гистоновых модификаций, характерных для активно транскрибируемых генов. Эпигенетическими маркерами транскрипции являются триметилирование лизина гистона H3 в положении 4 (H3K4me3), а также ацетилирование гистонов H3 и Н4 (acH3/acH4) в промоторных областях генов. Мы показали, что обработка HeLaI клеток TSA, Hoechst 42, DAPI, Camptothecin, Etoposide и MG132 приводит к увеличению уровня триметилирования лизинов в положении 4 гистонов H3 (H3K4me3). При этом уровень ацетилирования гистона Н4 остается без существенных изменений, за исключением образца клеток, обработанных TSA. Уровень ацетилирования гистона Н3, напротив, увеличился во всех образцах. При этом наибольшее значение было зарегистрировано для TSA, а наименьшее - для Bleomycin. В качестве внутреннего контроля и контроля нанесения были использованы антитела к гистонам H3 и Н4.
Одним из важных показателей эпигенетической активности химических соединений является изменение уровня метилирования ДНК. Общий уровень метилирования ДНК в клетке оценивали методом иммуноферментного анализа ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) с использованием белковых ДНК-метил-связывающих доменов и антител, специфически распознающих метилированную ДНК. Полученные данные свидетельствуют (Рисунок 16) о незначительном изменении общего уровня метилирования ДНК в клетках HeLaI после обработки большинством исследуемых соединениями. Статистически достоверные результаты (p 0,01) были получены для клеток, обработанных 5-azaC, веществом глюкокортикостероидного происхождения FA (флуоцинолона ацетонид), ингибитором 26S-протеасомы MG132 и индуктором оксидативного стресса ATO (триоксид мышьяка).
Поскольку изменение общего уровня метилирования ДНК после обработки клеток оказалось незначительным, дополнительно мы решили исследовать изменение уровня метилирования промоторной области GFP на модельной системе HeLaI. В нашей системе метилирование области LTR оказывает непосредственное влияние на экспрессию GFP.
Методом метилчувствительной ПЦР с модификациями нами было показано влияние некоторых из исследуемых химических агентов на уровень метилирования LTR в области сайта старта транскрипции. На рисунке 17А приведена схема LTR c локализацией сайта рестрикции метилчувствительного фермента HpaII и праймерами для ПЦР в реальном времени.
Статистически значимое (р 0,01) снижение уровня метилирования ДНК LTR в области сайта старта транскрипции было обнаружено при обработке клеток HeLaI следующими соединениями: 5-azaC, Hoechst58, Camptothecyn, FA, MG132, ATO и BPA. Следует отметить, что после обработки с Hoechst42 изменений уровня метилирования LTR не наблюдалось, в то время как обработка клеток Hoechst58 приводила к снижению уровня метилирования.
![Влияние регуляции микроэкологических нарушений кишечника на течение затяжных конъюгационных гипербилирубинемий [Электронный ресурс]](/i/i/4470/196295.png "Влияние регуляции микроэкологических нарушений кишечника на течение затяжных конъюгационных гипербилирубинемий [Электронный ресурс] Ковалева Оксана Васильевна")
