Введение к работе
Актуальность исследований. Методы абсорбционной и люминесцентной спектроскопии находят широкое применение в биофизике [1]. Оптические методы, являющиеся неразрушающими методами исследования биосистем, позволяют получить сведения, как о структурной организации биологических объектов, так и о процессах, происходящих в них. Значительно расширить круг задач, решаемых оптическими методами, и получить дополнительные данные о биосистемах позволяет применение люминесцентно-кинетических методов исследования.
Для определения структурных изменений в белках с успехом применяются люминесцентные методы, основанные на наблюдении флуоресценции [2] и фосфоресценции [3] хромофоров белков. Однако число люминесцирующих хромофоров белков ограничено и квантовый выход люминесценции незначителен, поэтому для исследования структурных перестроек в белках применяются флуоресцентные зонды [4, 5], обладающие высоким квантовым выходом свечения и способностью сорбироваться в определенных местах глобулы белка.
Перспективным является метод, основанный на флуоресцентном синглет-синглетном переносе энергии электронного возбуждения между хромофорами белка. Флуоресцентный перенос энергии, протекающий по индуктивно-резонансному механизму, осуществляется на расстоянии до 100 А. Применение метода флуоресцентного переноса энергии электронного возбуждения между хромофорами белка и люминесцентными зондами [6, 7] позволяет получить информацию о локализации и взаимодействии молекул люминесцентных зондов с белками, а также применяется для изучения трансмембранного движения белков. Внутримолекулярные структурные изменения регистрировать этим методом затруднительно, так как расстояние переноса энергии соизмеримо с размерами белка, поэтому незначительные смещения участков полипептидной цепи в глобуле белка могут быть не обнаружены. Кроме того, время жизни флуоресцентных состояний хромофоров и люминесцентных зондов составляет несколько наносекунд. Вследствие этого изучение медленных внутримолекулярных перестроек в белках становится невозможным.
Уникальные возможности исследования медленной внутримолекулярной структурной динамики белка представляет рассмотренный в данной работе метод триплет-триплетного (Т-Т) переноса энергии электронного фотовозбуждения между люминесцентными зондами, связанными с белками. Преимущество Т-Т переноса энергии по сравнению с синглет-синглетным состоит в том, что перенос энергии по обменно-резонансному механизму осуществляется на незначительном расстоянии порядка несколько ангстрем. Вероятность Т-Т переноса энергии экспоненциально убывает с увеличением расстояния между партнерами, вследствие этого возможно определение незначительных внутримолекулярных структурных изменений в белках.
Цель работы заключается в установлении закономерностей изменений спектрально-кинетических характеристик излучательных внутримолекулярных переходов в люминесцентных зондах и параметров межмолекулярного безызлучательного переноса энергии электронного возбуждения между зондами, связанными с белками, при переходе от нативных белков к денатурированным.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Исследовать процессы взаимодействия полярных и неполярных люминесцентных зондов с белками люминесцентно-кинетическими методами, а также методами абсорбционной и люминесцентной спектроскопии.
Методами флуоресцентной спектроскопии, по перераспределению интенсивности первого и третьего максимума флуоресценции пирена, определить чувствительность колебательной структуры спектров флуоресценции пирена к структурной перестройки белков.
Методом фосфоресценции при комнатной температуре (ФКТ) люминесцентного зонда - эозина, относящегося к красителям ксантенового ряда, определить влияние структурных перестроек в белках на излучательные и безызлучательные процессы дезактивации энергии электронного возбуждения триплетных состояний люминесцентного зонда.
Определить радиус синглет-синглетного переноса энергии между хромофором белка - триптофанилом и люминесцентным зондом эозином.
Доказать возможность существования межглобулярной диффузии молекул донора энергии - эозина в процессе триплет-триплетного переноса энергии между полярным и неполярным зондами, связанными с белками.
Определить константу скорости триплет-триплетного переноса энергии между полярными и неполярным люминесцентными зондами, связанными с белками: сывороточным альбумином человека (САЧ) и бычьим сывороточным альбумином (БСА).
Определить зависимость константы скорости триплет-триплетного переноса энергии электронного возбуждения от концентрации поверхностно-активных веществ в белках.
Установить особенности моно- и бимолекулярных процессов деактивации энергии электронного возбуждения люминесцентных зондов в системе БСА-глюкоза.
Научная новизна работы состоит в следующем: Детально изучены процессы триплет-триплетного переноса энергии между связанными с белками полярным донором энергии электронного возбуждения - эозином и неполярным зондом - антраценом. Определены радиусы триплет-триплетного переноса энергии электронного возбуждения для исследованной системы. Обнаружена чувствительность константы скорости триплет-триплетного переноса энергии и радиусов переноса к структурным изменениям в белках.
По результатам исследования синглет-синглетного переноса энергии между остатками триптофана САЧ и связанным с САЧ эозином, установлено, что эозин сорбируется на белок вблизи триптофанила белка.
Обнаружена чувствительность спектров поглощения и флуоресценции эозина и пирена к структурным изменениям белков. Определены коэффициенты экстинкции и сила осциллятора синглет-синглетного поглощения молекул люминесцентных зондов (эозин и антрацен), связанных с САЧ.
Определено влияние структурной перестройки белков на колебательную структуру спектров флуоресценции связанных с белками молекул пирена. Показана возможность применения спектрального параметра «индекс полярности микроокружения пирена» для определения изменения микроокружения неполярного люминесцентного зонда в процессе структурной перестройки белков.
Установлено существование межглобулярной диффузии молекул эозина донора энергии в процессе Т-Т переноса энергии между связанными с САЧ эозином и антраценом.
Предложен метод определения наличия структурных изменений белков плазмы крови человека и гликированных белков, основанный на применении триплет-триплетного переноса энергии между люминесцентными зондами, связанными с белками.
Научно-практическая значимость работы заключается в следующем:
Показано, что интенсивность фосфоресценции и время жизни триплетных состояний люминесцентного зонда эозина, колебательная структура спектра флуоресценции пирена, а также константа скорости Т-Т переноса энергии могут быть использованы для регистрации структурных изменений в белках.
Результаты исследований переноса энергии между люминесцентными зондами могут найти применение в медицине при определении белковых молекул с измененной структурой, а также для аналитического определения полициклических ароматических углеводородов в плазме крови.
На защиту выносятся следующие положения:
Экспериментально наблюдаемый процесс Т-Т переноса энергии между донором энергии эозином и акцептором антраценом свидетельствует о том, что полярный эозин может приближаться к молекуле неполярного антрацена в глобуле белка на расстояние перекрывания электронных облаков этих молекул. Уменьшение радиуса сферы тушения фосфоресценции донора, в результате триплет-триплетного переноса энергии, от 10 А до 7 А, при незначительных добавках додецилсульфата натрия (ДСН), концентрацией 0,4-10 М, связано с увеличением расстояния между донором и акцептором вследствие структурных изменений белка под действием ДСН.
Возрастание силы осциллятора синглет-синглетного поглощения зонда -эозина при переходе от водных растворов (є =(14820 =ь 270) М_1см-1, Х= 514 нм) к САЧ (єм = (19410 ± 2020)М~1см~1, Х=530 нм), свидетельствует об эффективном связывании эозина с глобулой белка. Уменьшение интенсивности свечения
САЧ на длине волны 360 нм и возрастание максимума флуоресценции эозина в области 530-545 нм обусловлено синглет-синглетным переносом энергии с донора - триптофанил белка на акцептор - эозин, находящийся в глобуле белка. Полученное значение радиуса переноса энергии (R0 - (9 ± 2) А) меньше размера глобулы белка (-100А), следовательно, синглет-синглетный перенос энергии между триптофанилом и эозином осуществляется в условиях локализации гидрофильного эозина вблизи гидрофобного триптофанила.
Уменьшение индекса полярности микроокружения пирена, которое определялось по отношению интенсивностей первого максимума флуоресценции (її) к интенсивности третьего максимума (Із), при переходе от водного раствора (І1/І3 =1,74) к плазме крови человека (Іі/Із=1,03) свидетельствует о связывании гидрофобных люминесцентных зондов с белками плазмы. Возрастание интенсивности флуоресценции пирена и увеличение индекса полярности микроокружения пирена, при добавлении в плазму крови человека ДСН концентрацией от С=0,2-10 М до 0,6-10"М обусловлено локализацией молекул пирена на границе раздела гидрофобной и гидрофильной области глобулы белка плазмы вследствие изменения структуры белка под действием ДСН, встраивающегося в глобулу белка.
Возрастание интенсивности фосфоресценции зонда эозина в 1,24 раза, при переходе от БСА, содержащего глюкозу к БСА гликированному в течение 90 мин и неизменность константы скорости затухания фосфоресценции (430с" ) после импульсного возбуждения, связано с проникновением люминесцентного зонда в гидрофобные области белка. В этом случае глюкоза не подавляет связывания зонда с этими новыми областями. Подтверждением этого является длинноволновое смещение максимума флуоресценции эозина на 8 нм при переходе к гликированным белкам, что указывает на уменьшение полярности микроокружения молекул эозина, в глобулах белка с большей степенью гликирования.
Возрастание константы скорости переноса энергии от 3,1 10 М" с" до 15,1-10 M~V при уменьшении концентрации САЧ от 10 мг/мл до 1 мг/мл, связано с увеличением вероятности встреч молекул донора и акцептора вследствие выхода гидрофильных молекул донора энергии эозина из глобулы белка и проникновением их в другую глобулу, содержащую молекулу акцептора - антрацена, где и осуществляется перенос энергии. Подтверждением межглобулярной диффузии эозина является уменьшение интенсивности фосфоресценции эозина, а также возрастание константы скорости затухания фосфоресценции эозина от 260 с"1 (Ссач=Юмг/мл) до 340 с"1 (Ссач=1 мг/мл), вследствие увеличения вероятности тушения триплетных состояний молекул эозина, вышедших из глобул белка в водную макрофазу раствора белка, остаточным кислородом, растворенным в воде.
Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на International School for Young Scientists and Students on Optics. Laser Physics and Biophysics. (Saratov, 2004-2010 г.г.); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов». (Москва. Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Физический
факультет. 2004-2009 г.г.); Международной научной конференции "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем". (Минск, Беларусь. 2004); XXIII Съезде по спектроскопии, (Звенигород, Московская обл. 2005); IV съезд фотобиологов России (Саратов, 2005); International Memorial Symposium «Molecular Photonics» dedicated to academician A.N. Terenin. (St. Petersburg, 2006); VII съезд Белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков. (Минск, Беларусь. 2006); VII International Young Scientists Conference. Optics and High Technology Material. Science SPO. Scientific Works. (Kyiv, Ukraine. 2006); Симпозиум "Нанофотоника". (Черноголовка. 2007); XXI Международной научной конференции «Математические методы в технике и технологиях», (Саратов. 2008); V съезде Российского фотобиологического общества, (Пущино. 2008); XXII Международной научной конференции Математические методы в технике и технологиях, (Псков. 2009); International conference "Organic nanophotonics" (ICON - RUSSIA 2009), (Санкт-Петербург. 2009); Международном Форуме по Нанотехнологиям. «Сенсорные наноматериалы», (Москва, 2009); International conference «Dynamics and Fluctuations in Biomedical Photonics», (San-Francisco. 2010).
Достоверность результатов обеспечивается:
Использованием в экспериментах стандартной современной научной аппаратуры;
Воспроизводимостью полученных экспериментальных результатов;
Применением современных методов компьютерной обработки экспериментальных данных;
Совпадением результатов, полученных на специально созданном импульсном флуориметре, с известными литературными данными.
Личный вклад автора заключается в том, что автор совместно с научным руководителем участвовал в постановке задач исследований, анализе и обсуждении полученных результатов, теоретических моделей, а также подготовке к опубликованию печатных работ. Автором самостоятельно проведены экспериментальные исследования. Для определения времени жизни люминесцентных зондов в возбужденном состоянии им создана экспериментальная установка - импульсный флуориметр.
Участие в научных проектах. Научная работа автора по теме диссертации выполнена при финансовой поддержке американского фонда гражданских исследований и развития, тема проекта: «Кинетика фосфоресценции люминесцентных зондов в исследовании структурной динамики белков в плазме крови человека» (персональный грант N REC-006, 2005 год), и Фонда содействия развитию малого бизнеса и предпринимательства в науке и технике госконтракт № 6232р/8706 от 19.09.2008 в рамках Программы У.М.Н.И.К. 2009-2010г.г. Наименование НИОКР «Моделирование процессов тушения фотовозбужденных состояний люминесцентных зондов в белках».
Автор являлся исполнителем следующих научных проектов, результаты которых частично вошли в материалы диссертации: «Исследование структурно-динамического состояния сывороточного альбумина человека в буферном растворе и в составе плазмы крови методами собственной и зондовой фосфоресценции при комнатной температуре» (РФФИ проект №06-04-81006-
Бела, 2006-2007г.г.); «Исследование триплет-триплетного переноса энергии электронного возбуждения между люминесцентными зондами, связанными с биополимерами» (РФФИ проект №10 - 02 - 00159а, 2010-2011г.г.); "Разработка оптических методов исследования и мониторинга изменений параметров биологических тканей и цельной крови при изменении содержания глюкозы в тканях организма человека и животных" ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 гг., госконтракт 02.740.11.0770.
Публикации. Основные результаты исследований опубликованы в 24 печатных работах, включающих в себя 17 тезисов докладов, 7 статей в изданиях, рекомендованных ВАК для соискателей ученых степеней.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит 164 страницы, включая 52 рисунка и 6 таблиц. Список литературы включает 171 наименование.
