Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 12
1.1. Распространение дирофиляриоза, влияние дирофилярий на организм 12
1.2. Диагностика дирофиляриоза 28
1.3. Гетерологичные антигены в иммунодиагностике гельминтозов 33
II. Собственные исследования 41
2.1. Материалы и методы 42
2.1.1. Объекты исследования, их получение 42
2.1.2. Методика приготовления соматических экстрактов из половозрелых Dirofilaria immitis и Setaria labiato-papillosa, определение в них содержания белка 44
2.1.3. Физико-химическая характеристика белкового спектра соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий 46
2.1.4. Иммунизация кроликов соматическими экстрактами из дирофилярий и сетарий, получение гипериммунных сывороток, оценка их активности в иммуноферментной реакции 48
2.1.5. Иммунохимическая характеристика соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий реакцией иммунодиффузии 50
2.1.6. Соматический экстракт из половозрелых сетарий в диагностике дирофиляриоза собак 50
2.1.7. Фракционирование соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий, антигенная характеристика полученных белковых фракций 52
2.1.8. Разработка иммуноферментной реакции для диагностики дирофиляриоза собак на основе фракционированного соматического антигена из дирофилярий и сетарий 53
2.1.9. Диагностическая эффективность иммуноферментной реакции при дирофиляриозе собак с фракционированным антигеном из сетарий и дирофилярий 54
III. Результаты исследований 55
3.1. Характеристика белкового спектра соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий 55
3.2. Оценка активности гипериммунных сывороток к антигенам соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий в иммуноферментной реакции, характеристика их антигенного спектра реакцией иммунодиффузии 58
3.3. Эффективность иммуноферментной реакции при дирофиляриозе собак с соматическим антигеном — экстрактом из половозрелых сетарий 72
3.4. Характеристика спектра антигенов фракционированных соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий в иммуноферментной реакции 74
3.5. Параметры и режим иммуноферментной тест-системы при дирофиляриозе собак на основе фракционированного соматического экстракта из сетарий и дирофилярий 81
Сравнительная диагностическая эффективность иммуноферментной реакции с фракционированными антигенами из сетарий и дирофилярий 84
Обсуждение полученных результатов . 87
Выводы 100
Практические предложения 101
Список использованной литературы 103
Приложение 1-
- Гетерологичные антигены в иммунодиагностике гельминтозов
- Иммунизация кроликов соматическими экстрактами из дирофилярий и сетарий, получение гипериммунных сывороток, оценка их активности в иммуноферментной реакции
- Соматический экстракт из половозрелых сетарий в диагностике дирофиляриоза собак
- Оценка активности гипериммунных сывороток к антигенам соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий в иммуноферментной реакции, характеристика их антигенного спектра реакцией иммунодиффузии
Введение к работе
Актуальность проблемы. Дирофиляриоз - зоонозное заболевание, переносчиком которого являются комары. Возбудителями инвазии у собак являются виды - Dirofilaria immitis и D. repens, широко распространенные во многих странах мира (К.И. Скрябин, 1930; ИЛ. Архипов, 2004; В.Б. Ястреб, 2006; А.Ю. Медведев, 2006). Они зарегистрированы и у человека, однако половой зрелости в организме человека дирофилярий не достигают и микрофилярий не выделяют. Широкому распространению дирофиляриоза в последние годы способствует увеличение численности собак, значительная миграция людей вместе с животными, а также адаптация дирофилярий к различным промежуточным хозяевам.
Прижизненная диагностика дирофиляриоза, в основном, базируется на обнаружении микрофилярий в крови и их идентификации. Однако при латентной форме и низкой интенсивности инвазии этот метод фактически не дает нужного эффекта, поэтому необходимо иметь на вооружении иммунодиагностические тесты, основанные на выявлении циркулирующих антигенов или антител, синтезируемых в организме инвазированного животного или человека.
Применение современных иммунологических методов позволяет изучить кинетику основных показателей иммуноаллергических реакций, антигенные и иммуногенные свойства паразитов, пути формирования защитных реакций организма при заражении.
Выяснение механизма действия антигенов гельминтов на организм хозяина является основой проведения целенаправленного поиска иммунодиагностических средств, более доступных источников иммуногенного материала, а также использования для этих целей гетерологичных антигенов.
Поскольку приобретение дирофилярий для приготовления антигенов и разработки на их основе иммунодиагностических тестов является в некоторой степени проблематичным, то возникает необходимость поиска гетерологичного, более доступного гельминтного материала, имеющего общие антигенные компоненты диагностического значения с дирофиляриями. Таким биологическим объектом могут быть сетарий, которые, как и дирофилярий, относятся к подотряду Filariata и вполне могут в белковом спектре содержать антигенные компоненты, способные диагностировать дирофиляриоз.
Цель и задачи исследований. Целью работы является иммунохимическая и физико-химическая характеристика антигенов-экстрактов из дирофилярий и сетарий, определение и выделение из них диагностически эффективных антигенных компонентов при дирофиляриозе, разработка на их основе иммуноферментной тест-системы.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
приобрести гельминтный материал - половозрелых сетарий и дирофилярий, приготовить белковые соматические экстракты и определить в них содержание белка;
провести иммунизацию кроликов соматическими экстрактами из сетарий и дирофилярий, получить иммунные сыворотки и определить их активность иммуноферментной реакцией с гомологичным и гетерологичкым антигеном;
провести иммунохимический анализ соматических экстрактов из сетарий и дирофилярий реакцией кммунодиффузии в агаровом геле;
провести фракционирование соматических экстрактов из сетарий и дирофилярий гель-хроматографией, исследовать полученные фракции ИФР, определить в них антигеноактивные и диагностически эффективные при дирофиляриозе;
разработать на основе фракционированного антигена-экстракта из сетарий диагностическую иммуноферментную тест-систему при дирофиляриозе собак;
сравнить диагностическую эффективность ИФР при дирофиляриозе собак на основе фракционированного антигена из сетарий и дирофилярий.
Научная новизна. Впервые проведена сравнительная физико-химическая и иммунохимическая характеристика соматических экстрактов из половозрелых Dirofilaria immitis и Setaria labiato-papillosa. В экстракте из дирофилярий диск-электрофорезом регистрировали 18, а из сетарий - 16 белковых компонентов, располагающихся в диапазоне белков молекулярной массы 6,5-200 кДа. Реакцией иммунодиффузии с гипериммунными сыворотками от кроликов в экстракте из дирофилярий определено не менее 7, а из сетарий не менее 6 потенциальных антигенных компонентов.
В обоих экстрактах выявлен один антигенный компонент диагностического значения при дирофиляриозе.
Фракционированием антигена-экстракта из сетарий и дирофилярий гель-хроматографией на Superose 12 Prep Grade выделены диагностически эффективные антигенные фракции при дирофиляриозе собак.
Впервые при дирофиляриозе собак разработана иммуноферментная тест-система на основе фракционированного антигена из сетарий, сопоставимая по своей чувствительности и специфичности с аналогичной реакцией на основе фракционированного соматического экстракта из дирофилярий.
Чувствительность ИФР с фракционированным антигеном из дирофилярий и сетарий составила соответственно 82,4%, специфичность -86,7; 83,3%. Установлена возможность использования в качестве источника диагностического антигена при дирофиляриозе собак гегерологичного вида гельминта-Setaria labiato-papillosa.
Практическая значимость. Предложена иммуноферментпая тест-система на основе фракционированного соматического экстракта из половозрелых сетарий для диагностики дирофиляриоза собак.
По материалам диссертационной работы разработаны:
-
Лабораторный регламент на выявление сывороточных антител при дирофиляриозе антигеном из сетарий, одобренный секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РЛСХН 25.09.2008.
-
Методика постановки ИФР с фракционированным антигеном из сетарий для диагностики дирофиляриоза, одобренная секцией «Инвазионные болезни животных » Отделения ветеринарной медицины РАСХН 25.09.2009.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены: -на заседаниях Ученого совета ВИГИС (2006-2009гг.)
на научных конференциях ВОГ «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями человека и животных» (г. Москва 2007,2009).
секции «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2008,2009 гг.)
Личный вклад. Представленная диссертационная работа является результатом 3-летних научных исследований автора. Исследования по получению соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий, их фракционированию, выделению диагностически эффективных фракций и разработке на их основе иммуноферментной диагностической тест-системы при дирофиляриозе собак проведены самостоятельно под руководством доктора биологических наук, профессора Бережко В.К., которая оказывала научно-методическую помощь в проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов. Статьи, написанные в соавторстве, включают более 80% материалов исследований соискателя.
Основные положения, выносимые на защиту:
Иммунохимическая и физико-химическая характеристика экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий;
Фракционирование белковых экстрактов из дирофилярий и сетарий, анализ полученных фракций, выявление диагностически активных;
Отработка параметров и режима постановки ИФР с диагностически активными фракциями из дирофилярий и сетарий;
Сравнительная оценка диагностической эффективности ИФР с выделенными антигеноактивными фракциями из сетарий и дирофилярий при дирофиляриозе собак.
Публикации. По материалам исследований опубликовано 6 статей, в которых изложены основные положения и выводы по работе, 2 из них в рекомендованном ВАК РФ издании.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы и собственных исследований, включающих материалы и методы, результаты,
Гетерологичные антигены в иммунодиагностике гельминтозов
Иммунохимические методы в гельминтологии открывают широкие возможности на пути к решению целого ряда важнейших проблем как в теоретическом, так и в практическом отношении (Г.Н. Андреева 1981). Особое значение приобретает изучение спектра антигенов различных видов гельминтов, что позволяет не только устанавливать их антигенное многообразие, но и выявлять компоненты, представляющие ценность в диагностике и оказывающих иммунизирующее воздействие на организм хозяина к соответствующей инвазии. Изучение родства антигенов различных объектов имеет общую биологическую ценность, поскольку оно отражает систематическую принадлежность и показывает их филогенетическую связь. Важность изучения антигенов гельминтов в проблеме иммунитета животных и человека отмечалась А.С. Бессоновым (1970), Е.С. Лейкиной (1973), М.И. Наумычевой (1975).
В гельминтологии научным исследованиям, посвященным изучению отдельных антигенных компонентов, их химической природы, оценки иммуногенных свойств антигенов, полученных на разных стадиях паразита, придавалось большое значение (В .В. Клименко, 1971; Z. Boroskova et al., 1978; J.M. Flores, 1978).
В сравнительном аспекте был изучен антигенный спектр близкородственных видов гельминтов: Moniezia expansa, М. benedeni (Н.Ф. Смирнов, 1971), Dictyocaulus filaria, D. viviparus (B.K. Бережко, 1972), Ascaris suum, A. lumbricoides, Toxocara canis (Р.Ц. Желева, 1975). В указанных работах прослеживается определенная закономерность, выражающаяся в том, что число общих антигенных компонентов между исследуемыми видами значительно превышает число видоспецифических.
Большинство исследований по антигенному спектру гельминтов свидетельствует о наличии перекрестно-реагирующих (ПР) антигенных компонентов между различными паразитами, причем последние удалось обнаружить даже у таксономически далеких групп, относящихся не только к разному семейству, отряду, но и классам. Как правило, серологическое родство между отдаленными видами гельминтов определяется числом общих антигенных компонентов.
Исследованиями A. Capron et al., (1972) установлено, что антигенное родство сокращается с таксономической удаленностью изучаемых гельминтов. Например, у представителей подсемейства Toxocarinae и Ascaridinae обнаруживают 8-12 общих антигенных компонентов, у представителей подотрядов Ascaridata и Filariata около 10, а классов Cestoda и Trematoda менее 3-х антигенных компонентов. При сравнении классов нематод, цестод, трематод с Turbellaria и Acanthocephala отмечено незначительное число общих антигенных компонентов (1-2), а в некоторых случаях и отсутствие серологической связи между ними.
По данным В.А. Пинчук (1970), жидкость эхинококкового пузыря имеет 4 общих антигенных компонента с бычьими цистицерками и жидкостью тонкошейных финн, два с мониезиями и один с фасциолами и дикроцелиями. Таксономическая закономерность в антигенной связи гельминтов прослеживается и в других работах (Н.А. Мунтян, 1971; Н.А. Раззаков,1976). ПР антигены найдены не только у представителей класса цестод и трематод, но и представителей классов цестод и нематод. Например, общие антигенные компоненты выявлены между эхинококками и трихинеллами (J. Biguet et al., 1965), бовисными цистицерками и диктиокаулами (В.К. Бережко, 1970), эхинококками и аскаридами (Л.П. Свириденко-Степановская и др., 1972). В ряде работ отмечено, что общие антигены обнаружены также между трематодами и нематодами. Серологическое родство между ниппостронгилами и шистосомами, аскаридами и шистосомами, трихинеллами и фасциолами показано в исследованиях M.W. Campos et al. (1974); J. Oelerich et al. (1974). В литературе имеются также сообщения о присутствии ПР антигенов между свободноживущими видами нематод и некоторыми гельминтами животных. Использование гипериммунной сыворотки к Rhabditis elongata позволило выявить антигенное родство этой нематоды с Toxocara canis, Ascaris suum, Ancilostoma caninum, Gnatostoma doloresi, Dirofilaria immitis, в тоже время серологического родства Rhabditis elongata с Fasciola hepatica автором не установлено (S. Hiroshi Schinoda, 1969). Подобные сообщения представляют большой интерес и находят свое отражение в исследованиях по изучению вопросов, связанных с поиском методов иммунодиагностики и иммунопрофилактики гельминтозов.
Экспериментальными исследованиями перекрестно реагирующие антигенные компоненты, имеющие диагностические значения при гельминтозах, были обнаружены даже у организмов, стоящих на разных ступенях зоологической лестницы, у свободноживущих, растительных нематод и паразитов животных (Г.Н. Андреева, В.К Бережко, 1980). Авторы установили, что антигены, приготовленные из свободноживущих нематод Rhabditis axei, нематод растений Aphelenchus avenae, выявляли антитела в сыворотках зараженных диктиокаулами овец.
Дальнейшими исследованиями антигенного спектра паразитов физико-химическими и иммунохимическими методами было показано, что число потенциальных антигенов в соматических экстрактах из гельминтов значительно превышает количество функциональных, вызывающих синтез антител в инвазированном организме и имеющих диагностическое значение.
Иммунизация кроликов соматическими экстрактами из дирофилярий и сетарий, получение гипериммунных сывороток, оценка их активности в иммуноферментной реакции
Постановку иммуноферментной реакции проводили в непрямом варианте с целью выявления антител в сыворотке крови зараженных животных. Параметры и режим постановки ИФР с соматическим фракционированным антигеном отрабатывали в предварительных экспериментах на сыворотках собак с гомологичной инвазией (слабый и умеренный иммунный ответ), гетерологичной инвазией и отрицательного контроля (клинически здоровые). Твердой фазой служили планшеты из полистирола (Медполимер, Санкт-Петербург).
При выборе оптимальной концентрации белка антигена для сенсибилизации полистироловых планшетов нами были испытаны следующие концентрации: 15; 12; 10; 8; 7 мкг/мл. Антиген разводили в 0,1 М карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,6.
Определение режима сенсибилизации планшетов фракционированным антигеном проводили по образу модели, в качестве которой был взят соматический экстракт из сетарий в концентрации по белку 10 и 8 мкг/мл в карбонатно-бикарбонатном буферном растворе, рН 9,6. Испытаны следующие режимы сенсибилизации: при 4є - 18-20 часов, при 37 С - 1 час, затем при 4С — 18 часов.
Определение минимального диагностического титра провели на двух пулах сывороток от собак, спонтанно зараженных D. immitis, со слабым и умеренным иммунным ответом. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови клинически здорового животного, а также три сыворотки собак с гетерологичной инвазией (Toxocara canis, Babesia canis, Cystoisosporum canis). Испытали разведения сывороток 1:50 и 1:100.
Минимальным диагностическим титром в иммуноферментной реакции считали титр разведенной сыворотки, при котором наблюдали окрашивание субстратной смеси до красновато-буроватого цвета и отсутствие или незначительные изменения цвета субстрата с гетерологичными и отрицательной сыворотками.
Исследование диагностической эффективности в ИФР фракционированных соматических антигенов из сетарий и дирофилярий проводили с сыворотками крови собак, больных D. immitis, D. repens, а также свободных от данной инвазии, и собак с другими паразитарными и не паразитарными патологиями. Кровь собак перед исследованием проверили на наличие микрофилярий классическим методом Кнотта. Сыворотку хранили при минус 20С. Постановку и учет результатов проводили в соответствии с программой комиссионной проверки. Испытания проводили на 47 пробах сывороток собак, из которых 11 — от естественно инвазированных D. immitis; 6 - D. repens; 3 — естественно инвазированных В. canis; 3 - Т. canis; 9 проб сывороток собак с непаразитарными патологиями и 15 — клинически здоровых из г. Москвы, г. Краснодара, Московской и Ростовской области, у которых не обнаружили других гельминтов. Эффективность ИФР устанавливали по показаниям оптической плотности на автоматическом ридере при длине волны 492 нм.
В белковом спектре соматического экстракта из дирофилярий после окрашивания и отмывки электрофореграммы регистрировали не менее 18 белковых компонентов, располагающихся в диапазоне белков молекулярной массы 14,4-200 кДа и отличающихся по степени окрашивания и электрофоретической подвижности (табл. 4; рис. 5).
Степень окрашивания проявившихся белковых компонентов является характерным признаком количественного содержания той или иной фракции в исследуемом экстракте.
Наиболее четко выраженные и интенсивно окрашенные 4 белковых компонента в этом биоматериале располагались в области подвижности белков молекулярной массы 14,4 кДа (лизоцима); 45,0 кДа (овальбумина); 66,0 кДа (бычьего сывороточного альбумина) и 200 кДа (миозина). Несколько слабее окрашенные, но достаточно четко выраженные еще 3 компонента проявились в диапазоне белков молекулярной массы 21,0 кДа (ингибитора трипсина); 31,0 кДа (углекислой ангидразы) и между белками мол. массы - 31,0-45 кДа. Менее выраженные, слабо окрашенные белковые компоненты, располагались по всей длине электрофореграммы.
Аналогичный анализ соматического экстракта из половозрелых сетарий позволил определить в нем не менее 16 белковых компонентов, также различающихся как по подвижности, так и по степени проявления (табл. 4; рис. 5). В этом биоматериале регистрировали не менее 6 наиболее интенсивно окрашенных полос, представляющих компоненты молекулярной массы 14,4 кДа - 1; 45,0 кДа - 1; в области белков молекулярной массы 45,0 и 66,0 кДа - 2 и 200 кДа — 2 компонента. Из этих 6 компонентов мажорными были 3, два из которых проявились в диапазоне белков между 45,0 и 66,0 кДа (овальбумина и бычьего сывороточного альбумина), а 1 - в области подвижности миозина - 200,0 кДа.
Наиболее многочисленные, но слабо выраженные компоненты располагались на электрофореграмме в диапазоне белков мол. массы между 14,4 и 45,0 кДа, а также не менее 2 из них - между белками мол. массы 66,0 и 116,0 кДа. Судя по окраске количественное содержание этих белков в общей массе соматического экстракта незначительное.
Соматический экстракт из половозрелых сетарий в диагностике дирофиляриоза собак
Отмеченные различия в иммунном ответе кроликов безусловно являются следствием их индивидуальной реактивности, поскольку доза введенного белка-антигена при иммунизации была одинаковой для всех животных и составила 10,5 мг (табл. 3). Полученные гипериммунные сыворотки были в дальнейшем использованы для характеристики антигенного спектра соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий в гомологичной и гетерологичной системе реакции иммунодиффузии.
Результаты изучения антигенного спектра соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий с использованием иммунных сывороток, полученных от кроликов на 7-9-й день после окончания цикла иммунизации, были недостаточно информативными, поскольку преципитирующая активность этих сывороток была слабой (табл. 9, 10; рис. 6-Ю).
Соответственно и число выявленных в реакции комплексов антиген-антитело (АГ-АТ) было неодинаковым. Эти различия четко обозначились в РИД не только количеством, но и степенью выраженности проявленных полос преципитации. Более активная иммунная сыворотка к антигенам соматического экстракта из дирофилярий проявляла в гомологичной системе реакции не менее 3 комплексов АГ-АТ, менее активная - не более одного-двух (табл. 9; рис. 7).
В обоих случаях представляющие эти иммунные комплексы полосы преципитации были недостаточно четко выражены, отдельные из них имели несколько диффузный характер. Исследование этих сывороток в гетерологичной системе реакции с антигеном-экстрактом из сетарий показало не более 1-2 комплексов АГ-АТ, проявившихся также в виде диффузных полос преципитации. Аналогичный анализ, проведенный с иммунными сыворотками к антигенам соматического экстракта из сетарий, также подтвердил эту закономерность в РИД. В гомологичной системе реакции в зависимости от активности иммунной сыворотки регистрировали 2-3 или 1 комплекс АГ-АТ в виде полос преципитации в агаровом геле разной четкости и интенсивности. В гетерологичной системе эти антисыворотки с экстрактом из дирофилярий проявляли 1-2 комплекса АГ-АТ (табл. 10 рис. 6). Проведенная на 28-й день после окончания иммунизирующего цикла реиммунизация повысила преципитирующую активность сывороток, что отразилось на качественном и количественном показателе проявленных в РИД комплексов АГ-АТ.В белковом спектре соматического экстракта из дирофилярий этими антисыворотками регистрировали не менее 4-5 и 6-7 преципитирующих комплексов, большинство из которых проявлялось в агаровом геле четкими полосами. Что касается гипериммунных сывороток к антигенам соматического экстракта из сетарий, полученных после реиммунизации, то их преципитирующая активность также существенно повысилась, хотя была ниже аналогичных антисывороток к антигенам экстракта из дирофилярий (рис. 8).
При анализе этих сывороток в гомологичной системе РИД было проявлено от 4 до 6 комплексов АГ-АТ в виде четких полос преципитации. Количество проявленных полос преципитации в гетерологичной системе реакции в обоих случаях было на 1-2 меньше (табл.9, 10; рис. 6-Ю). Таким образом, проведенный иммунохимический анализ соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий в РИД с гипериммунными сыворотками позволил определить в них соответственно 7 и 6 потенциальных антигенных компонентов, вызывающих синтез антител у кроликов (табл. 9,10; рис. 6-10). Однако, учитывая невысокую разрешающую способность иммунодиффузионного теста, можно предположить, что количество потенциальных антигенов в белковом спектре исследуемых экстрактов значительно больше. Антигены-экстракты из половозрелых дирофилярий и сетарий были подвергнуты аналогичному анализу с сывороткой зараженных D. immitis собак. В обоих "случаях как в гомологичной, -так и в гетерологичнои системе реакции регистрировали одну полосу преципитации диффузного характера (табл. 9, 10, рис. 11). Неочищенные соматические экстракты из половозрелых дирофилярий и сетарий безусловно не отличаются гомогенностью и содержат антигенные компоненты различной молекулярной массы, активности и специфичности. Убедительным подтверждением этого являются результаты электрофоретической характеристики белкового спектра экстрактов из дирофилярий и сетарий, включающего не менее 16-18 компонентов, каждый из которых при оптимальной концентрации мог вызвать выработку антител у иммунизированных кроликов. Введенная нами доза антигена-экстракта в количестве 10,5 мг белка не могла обеспечить для каждого белкового компонента оптимальной концентрации, необходимой для стимуляции иммунного ответа и выработки антител. Тем не менее количество потенциальных антигеноактивных белковых компонентов, стимулирующих синтез антител у иммунизированных кроликов, было значительно больше, чем у естественно зараженных собак, что подтвердилось результатами иммунохимического анализа. Причиной проявления диффузных полос может быть, с одной стороны, наличие в сыворотке антител различной специфичности, а, с другой, не гомогенностью антигенов.
Оценка активности гипериммунных сывороток к антигенам соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий в иммуноферментной реакции, характеристика их антигенного спектра реакцией иммунодиффузии
Отмеченные различия в иммунном ответе кроликов безусловно являются следствием их индивидуальной реактивности, поскольку доза введенного белка-антигена при иммунизации была одинаковой для всех животных и составила 10,5 мг (табл. 3).
Полученные гипериммунные сыворотки были в дальнейшем использованы для характеристики антигенного спектра соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий в гомологичной и гетерологичной системе реакции иммунодиффузии.
Результаты изучения антигенного спектра соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий с использованием иммунных сывороток, полученных от кроликов на 7-9-й день после окончания цикла иммунизации, были недостаточно информативными, поскольку преципитирующая активность этих сывороток была слабой (табл. 9, 10; рис. 6-Ю).
Соответственно и число выявленных в реакции комплексов антиген-антитело (АГ-АТ) было неодинаковым. Эти различия четко обозначились в РИД не только количеством, но и степенью выраженности проявленных полос преципитации. Более активная иммунная сыворотка к антигенам соматического экстракта из дирофилярий проявляла в гомологичной системе реакции не менее 3 комплексов АГ-АТ, менее активная - не более одного-двух (табл. 9; рис. 7).
В обоих случаях представляющие эти иммунные комплексы полосы преципитации были недостаточно четко выражены, отдельные из них имели несколько диффузный характер. Исследование этих сывороток в гетерологичной системе реакции с антигеном-экстрактом из сетарий показало не более 1-2 комплексов АГ-АТ, проявившихся также в виде диффузных полос преципитации. Аналогичный анализ, проведенный с иммунными сыворотками к антигенам соматического экстракта из сетарий, также подтвердил эту закономерность в РИД. В гомологичной системе реакции в зависимости от активности иммунной сыворотки регистрировали 2-3 или 1 комплекс АГ-АТ в виде полос преципитации в агаровом геле разной четкости и интенсивности. В гетерологичной системе эти антисыворотки с экстрактом из дирофилярий проявляли 1-2 комплекса АГ-АТ (табл. 10 рис. 6). Проведенная на 28-й день после окончания иммунизирующего цикла реиммунизация повысила преципитирующую активность сывороток, что отразилось на качественном и количественном показателе проявленных в РИД комплексов АГ-АТ.В белковом спектре соматического экстракта из дирофилярий этими антисыворотками регистрировали не менее 4-5 и 6-7 преципитирующих комплексов, большинство из которых проявлялось в агаровом геле четкими полосами. Что касается гипериммунных сывороток к антигенам соматического экстракта из сетарий, полученных после реиммунизации, то их преципитирующая активность также существенно повысилась, хотя была ниже аналогичных антисывороток к антигенам экстракта из дирофилярий (рис. 8).
При анализе этих сывороток в гомологичной системе РИД было проявлено от 4 до 6 комплексов АГ-АТ в виде четких полос преципитации. Количество проявленных полос преципитации в гетерологичной системе реакции в обоих случаях было на 1-2 меньше (табл.9, 10; рис. 6-10).
Таким образом, проведенный иммунохимический анализ соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий в РИД с гипериммунными сыворотками позволил определить в них соответственно 7 и 6 потенциальных антигенных компонентов, вызывающих синтез антител у кроликов (табл. 9,10; рис. 6-10). Однако, учитывая невысокую разрешающую способность иммунодиффузионного теста, можно предположить, что количество потенциальных антигенов в белковом спектре исследуемых экстрактов значительно больше. Антигены-экстракты из половозрелых дирофилярий и сетарий были подвергнуты аналогичному анализу с сывороткой зараженных D. immitis собак. В обоих "случаях как в гомологичной, -так и в гетерологичнои системе реакции регистрировали одну полосу преципитации диффузного характера (табл. 9, 10, рис. 11). Неочищенные соматические экстракты из половозрелых дирофилярий и сетарий безусловно не отличаются гомогенностью и содержат антигенные компоненты различной молекулярной массы, активности и специфичности. Убедительным подтверждением этого являются результаты электрофоретической характеристики белкового спектра экстрактов из дирофилярий и сетарий, включающего не менее 16-18 компонентов, каждый из которых при оптимальной концентрации мог вызвать выработку антител у иммунизированных кроликов. Введенная нами доза антигена-экстракта в количестве 10,5 мг белка не могла обеспечить для каждого белкового компонента оптимальной концентрации, необходимой для стимуляции иммунного ответа и выработки антител. Тем не менее количество потенциальных антигеноактивных белковых компонентов, стимулирующих синтез антител у иммунизированных кроликов, было значительно больше, чем у естественно зараженных собак, что подтвердилось результатами иммунохимического анализа. Причиной проявления диффузных полос может быть, с одной стороны, наличие в сыворотке антител различной специфичности, а, с другой, не гомогенностью антигенов.
