Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности Филиппова Лариса Вячеславовна

Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности
<
Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Филиппова Лариса Вячеславовна. Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности: диссертация ... кандидата медицинских наук: 03.02.12 / Филиппова Лариса Вячеславовна;[Место защиты: Северо-Западный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова].- Санкт-Петербург, 2014.- 142 с.

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1 Криптококк и криптококкоз 11

1.1 Характеристика комплекса видов

Cryptococcus neoformans / Cryptococcus gattii 11

1.2 Патогенность криптококков 16

1.2.1 Основные факторы патогенности C. neoformans и C. gattii 16

1.2.2 Другие факторы патогенности C. neoformans 20

1.3 Клинические варианты и факторы риска развития криптококкоза 23

ГЛАВА 2 Штаммы C.neoformans и врожденный иммунный ответ 26

2.1 Взаимодействие C. neoformans с макрофагами 26

2.1.1 Паттерн-распознающие рецепторы 26

2.1.1.1 Маннозный рецептор 27

2.1.1.2 Дектин – 1 29

2.1.1.3 Toll-рецепторы 31

2.2 Роль опсонинов в иммунном ответе при криптококкозе 32

2.2.1 Компоненты комплемента 32

2.2.2 Антитела 33

2.3 Факторы микробоцидности макрофагов 34

2.3.1 Кислородзависимые факторы микробоцидности 34

2.3.1.1 Образование активных продуктов кислорода 34

2.3.1.2 Реактивные промежуточные продукты азота 36

2.3.2 Кислороднезависимые факторы микробоцидности 37

2.4 Медиаторы иммунного ответа 38

2.5 Резистентность к антифунгальным препаратам при криптококковой инфекции 42

Экспериментальная часть

ГЛАВА 3 Объекты и методы исследования 46

3.1 Объекты исследования 46

3.1.1 Штаммы Cryptococcus neoformans 46

3.1.2 Экспериментальные животные 47

3.2 Методы исследования 48

3.2.1 Морфология культур C. neoformans 48

3.2.2 Видовая идентификация Cryptococcus neoformans 48

3.2.3 Определение вирулентности криптококков на лабораторных животных 50

3.2.4 Определение фенолоксидазной активности C. neoformans 51

3.2.5 Получение перитонеальных макрофагов и культивирование их in vitro 51

3.2.6 Определение фагоцитарной активности макрофагов 52

3.2.7 Методы определения факторов микробоцидности 53

3.2.7.1 Продукция нитроксид анионов 53

3.2.7.2 Продукция супероксид анионов в тесте с нитросиним тетразолием 54

3.2.8 Определение уровня продукции цитокинов макрофагами 55

3.2.9 Определение цитотоксической активности перитонеальных макрофагов 56

3.2.10 Методы определения чувствительности C. neoformans к антифунгальным агентам различного происхождения 56

3.2.10.1 Определение чувствительности C. neoformans к флуконазолу и вориконазолу (CLSI M44-A) 56

3.2.10.2 Определение чувствительности к протегринам методом серийных разведений 58

3.2.11 Методы статистического анализа полученных данных 59

ГЛАВА 4 Морфо-биологическая характеристика штаммов С. neoformans 61

4.1 Происхождение изолятов С. neoformans 61

4.2 Морфологическая и биологическая характеристика клинических изолятов C. neoformans 64

4.3 Определение патогенности криптококков на экспериментальных животных 68

ГЛАВА 5 Взаимодействие штаммов C.neoformans разной вирулентности с перитонеальными макрофагами in vitro 71

5.1 Фагоцитарная активность макрофагов в отношении C. neoformans 71

5.2 Влияние штаммов C. neoformans разной вирулентности на продукцию факторов микробоцидности перитонеальными макрофагами 77

5.2.1 Влияние штаммов C. neoformans разной вирулентности на способность макрофагов к продукции супероксиданионов in vitro 77

5.2.2 Влияние штаммов C. neoformans на способность макрофагов продуцировать нитроксидные радикалы in vitro 78

5.3 Определение цитотоксической активности макрофагов по отношению к штаммам C. neoformans разной вирулентности 82

5.4 Оценка спектра цитокинов, вырабатываемых макрофагами, при взаимодействии с криптококками in vitro 84

5.5 Чувствительность штаммов C. neoformans разной вирулентности к азоловым препаратам и антимикробным пептидам животного происхождения 89

ГЛАВА 6 Заключение 94

Выводы 108

Практические рекомендации 109

Перспективы дальнейшей разработки темы 109

Список литературы

Другие факторы патогенности C. neoformans

Из ста видов базидиомицетовых дрожжей рода Cryptococcus, признанными патогенами является только комплекс Cryptococcus neoformans / Cryptococcus gattii (рисунок 1) [120]. C. neoformans в качестве патогена для человека был идентифицирован еще в 1890-ых годах (Busse О., 1894; Buschke А., 1895). Комплекс C. neoformans / C. gattii на основании различий в распознавании полисахаридной капсулы антителами, разделен на C. neoformans серотип A (C. neoformans var. grubii), серотип D (C. neoformans var. neoformans), серотип A/D и C. gattii серотипы B и C (прежде C. neoformans var. gattii) [202, 268,255].

В настоящее время другие разновидности криптококков стали относить к потенциальным патогенам для человека. Отличительной особенностью этих грибов является неспособность выживать при температуре человеческого тела, и поэтому они очень редко вызывают развитие заболевания. Насчитывается порядка 15 видов грибов, относящихся к роду Cryptococcus, которые являются клиническими изолятами и представлены C. adeliensis, C. albidosimilis, С. albidus, C. curvatis, C. diffuens, C. flavescens, C. gastricus, C. humicola, C. laurentii, C. liquefaciens, C. luteolis, C. macerans, C. magnus, C. saitoi, C. uzbekistanensis, C. vishniacii [132]. Все указанные виды криптококков с разной частотой вызывают криптококкоз у человека: по данным литературы, сообщается о 20 случаях криптококкоза, вызванного C. laurentii и о 18 случаях С. albidus [167].

В последние годы отмечается развитие методов молекулярно генетическоготипирования, позволяющих быстро идентифицировать возбудителя. Рисунок 1 – Филогенетическое дерево представителей рода Cryptococcus [132]. Широко используются электрофоретическое кариотипирование с использованием полиморфизма длин амплифицированных фрагментов ДНК (AFLP), а также цепная полимеразная реакция (PCR). Однако мультилокусное сиквенирование (MLST) является референтным методом для типирования криптококков [73]. пульс-гель электрофореза, метод случайной амплификации полиморфной ДНК (RAPD), метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (RFLP), метод ДНК- гибридизации, метод Достижения в этой области позволили, в соответствии с имеющейся классификацией, определить девять главных генотипов криптококков: C. neoformans var. grubii молекулярные типы VNI, VNII и VNB; C. neoformans var. neoformans молекулярный тип VNIV; серотип A/D молекулярный тип VNIII и C. gattii (серотипы В и С) с молекулярными типами VGI, VGII, VGIII и VGIV (рисунок 2) [205, 136, 132].

Схема идентификации комплекса видов C. neoformans/C. gattii. [132]. Идентификация криптококков посредством MLST очень надежна, но не всегда доступна в связи с высокой стоимостью и длительностью исполнения исследований. Поэтому требуется внедрение в диагностику дополнительных методов, позволяющих быстро идентифицировать и типировать возбудителя. Одним из таких методов является матрично-активированная лазерная десорбционно-ионизационная времяпролетная масс-спектрометрия (MALDIOF-MS), которая активно внедряется в лабораторную микологию в последнее десятилетие. В 2011 г. L.R. McTaggart с соавторами представили успешный опыт идентификации c использованием MALDIOF-MS C. neoformans var. neoformans, C. neoformans var. grubii и C. gattii. В работе C. Firacative и соавторов показано, что MALDIOF-MS является надежным методом разделения C. neoformans и C. gattii, а также продемонстрирована возможность применения некоторых методов анализа масс-спектров для внутривидового типирования изолятов. В частности, с помощью построения MSP-дендрограммы и псевдогелей изоляты удалось разделить на группы, соответствующие молекулярным типам этих видов по MLST. Аналогичные результаты представлены в сообщении B. Posteraro и соавторов. По-видимому, это одни из первых успешных попыток применения протеомного субтипирования C. neoformans в последние несколько лет [228, 192, 118].

C. neoformans вызывает заболевание у лиц с выраженным нарушением иммунитета, хотя в литературе описаны и исключения [84]. Криптококки обнаруживают повсеместно в окружающей среде, но чаще всего в помете голубей или почве. Большинство изолятов C. neoformans относят к серотипу A или к серотипу D. А и D серотипы эволюционно разделились, и их всегда описывали как варианты, а не как отдельные разновидности [173]. Однако недавно предложено описывать эти два серотипа C. neoformans как различные виды [246], потому что они разделились до такой степени, что нормальное спаривание стало невозможным, а при сравнении их геномов доказано отсутствие обмена генетической информации между ними [166]. Необходимы дальнейшие исследования для анализа продолжающегося внутреннего видообразования.

Серотип A - преобладающий серотип C. neoformans, ответственен за возникновение 95% всех случаев криптококкоковой инфекции [135]. По MLST-сиквинированию и AFLP-типированию, классификация на три молекулярных типа (VNI,VNII,VNB) подтверждена данными, полученными при проведении сравнительной геномной гибридизации (CGH) [5, 205,72]. VNI - наиболее общий молекулярный тип, встречающийся у 78% изолятов C. neoformans. Первоначально, VNB штаммы были найдены только в Ботсване [205], но недавно они также были выделены в Руанде, в Португалии, и в Бразилии [246].

Штаммы серотипа D обнаруживают повсеместно, но наиболее они распространены в регионах с умеренным климатом, например, в Европе, где в 30% случаев выделяют серотип D. Это ограниченное распространение может быть обусловлено тем фактом, что штаммы серотипа D более чувствительны к действию высоких температур, чем клетки серотипа A [191]. Клинические проявления инфекции у человека, вызванной серотипом A или D похожи, но некоторые авторы сообщали об их различиях по вирулентности, определяемой на экспериментальных моделях [70, 154].

Серотип AD - результат слияния между штаммами серотипа A и серотипа D, с последующим нарушенным мейозом из-за геномной несовместимости [136, 176]. Поэтому штаммы AD являются диплоидными, содержат два набора хромосом, и несут аллели двух спаривающихся типов. Штаммы серотипа AD обнаруживают сравнительно часто: недавним анализом природных и клинических изолятов C. neoformans в Северной Америке показано, что 7.5% штаммов, изолированных из окружающей среды – AD гибриды. Большинство изолятов серотипа AD обнаружено в Африке [189].

Определение генотипа и изучение эпидемиологии разновидностей C. neoformans привело к выделению C. neoformans var. gattii в отдельную разновидность, которая основана на генетической изменчивости и недостаточной очевидности генетической рекомбинации между C. neoformans и C. gattii [174]. Кроме того, C. gattii отличается от C. neoformans фенотипическими характеристиками, естественной средой обитания, эпидемиологией, клиническими проявлениями болезни, и ответом на антифунгальную терапию. Распространение C. gattii географически ограничено тропическим и субтропическим регионами, за исключением Британской Колумбии. C. gattii вызывает заболевание, главным образом, у иммунокомпетентных лиц, поэтому вспышка криптококкоза у здоровых лиц в Британской Колумбии выдвинула на первый план потенциал C. gattii как этиологического фактора криптококкоза [267, 80]. Подъем уровня заболеваемости на Острове Ванкувер достиг 36 случаев на миллион населения в год в течение 2002-2005 годов [247]. Есть свидетельства, подтверждающие, что вспышка с тех пор распространилась к материку, к Северо-Западу Тихого океана [203, 53, 119, 248, 42, 247].

Bovers и др. предложили рассматривать четыре известных молекулярных типа С. gattii (VGI, VGII, VGIII, VGIV) как различные варианты, точно так же как вариант neoformans и вариант grubii [185, 246]. Большинство клинических изолятов С. gattii относятся к штаммам с сильной вирулентностью и принадлежат генотипу VGII [25]. В настоящее время изоляты этого генотипа разделены на три подтипа: генотип VGIIa гипервирулентных клинических изолятов, генотип VGIIb, характерный, главным образом, природным изолятам, и генотип VGIIc, присущий гипервирулентным изолятам, выделенным в Штате Орегон, США [71, 203, 25].

Кислородзависимые факторы микробоцидности

Для природных изолятов криптококков оптимальный температурный режим соответствует 25 С - 28 С, а для патогенных видов, обитающих в организме человека или животных этот диапазон достигает 35 С - 38 С. Эта способность патогенных грибов к росту при 37 С всегда закреплена на генетическом уровне

Уреаза является ферментом класса гидролаз, который катализирует гидролиз мочевины до аммиака и углекислого газа. При сравнении штаммов С. neoformans, различающихся по этому ферменту, выявлена более низкая выживаемость животных, зараженных штаммами с высокой уреазной активностью [262, 3]. Подавляющее большинство штаммов С. neoformans образуют этот внеклеточный фермент, хотя спорадически в литературе сообщается и об уреазо-отрицательных изолятах [43, 243]. Некоторые авторы полагают, что образование аммиака в непосредственной близости от клеток эндотелия может привести к возрастанию адгезии криптококка к эндотелию и способствовать гематогенной диссеминации в ЦНС [263]. Таким образом, накопление криптококков внутри сосудов является важным механизмом, посредством которого экспрессия уреазы способствует инвазии С. neoformans в мозг. Механизм, посредством которого уреаза способствует закупорке сосудов, остается неизвестным. Предполагают, что одним из возможных путей может быть образование аммиака из мочевины и/или других азотистых продуктов, присутствующих в плазме макроорганизма [5]. В последнее десятилетие показано, что экспрессия уреазы приводит к дисбалансу иммунных реакций макроорганизма и их сдвигу в сторону непротективного Th2 иммунного ответа [75].

В результате накопления новых экспериментальных данных постоянно пополняется перечень метаболитов и ферментов C. neoformans, способных выступать в роли факторов патогенности. В настоящее время в качестве возможных факторов вирулентности рассматривают ДНК-азу, аминопептидазу и фосфолипазу, но их вклад в патогенность микроорганизма еще предстоит изучить [134]. Фосфолипазу относят к гетерогенной группе ферментов, способных гидролизовать эфирные связи в глицерофосфолипидах. Показано, что фосфолипаза необходима для индукции первичной инфекции С. neoformans в легких, дальнейшей диссеминации криптококков в лимфатические узлы и кровь, а также для выживания внутри макрофагов [234].

В последние годы особое внимание уделяется вновь открытым факторам патогенности криптококков. Показано, что штаммы С. neoformans способны продуцировать специфические белки, которые непосредственно влияют на взаимодействие с фагоцитарными клетками. Один из этих протеинов был открыт совсем недавно и охарактеризован как антифагоцитарный протеин 1 (Арр1)

Из необработанного цитоплазматического экстракта криптококка был изолирован и очищен белок, названный криптококковым фактором, который специфически ингибирует фагоцитоз. Предполагаемый ген, кодирующий этот белок, был идентифицирован и определена его последовательность как для штаммов С. neoformans серотипа А, так и для штаммов серотипа D. В 2002 году тот же ген был независимо идентифицирован методом ПЦР в лаборатории Медицинского Университета Штата Южная Каролина в США, как ген, чья экспрессия регулируется уровнем инозитол-фосфорил-церамид-синтетазной (Iрс1) активности [240]. App1 представляет собой секретируемый белок, который защищает C. neoformans от поглощения макрофагами независимо от антифагоцитарного действия грибковой капсулы. Этот белок специфически взаимодействует с CD11b на поверхности макрофагов и предотвращает связывание iC3b-опсонированных клеток C. neoformans [37]. Удаление App1 из клеток C. neoformans приводит к изменению его фенотипа. Криптококк становится гиповирулентным мутантом, если попадает в макроорганизм, дефицитный по комплементу, и, напротив, гипервирулентным штаммом в организме Т- и NK-дефицитных мышей. Таким образом, полученные авторами результаты приводят к выводу, что поглощение грибов фагоцитарными клетками играет положительную роль для криптококка в случае отсутствия в макрорганизме Т-клеток [68,137].

В дополнение к факторам вирулентности, описанным выше, в настоящее время рассматриваются вновь открытые белки и ферменты, которые связаны с вирулентностью штаммов криптококка. RIM 1 имеет решающее значение для вирулентности C. neoformans, поскольку он вовлечен в реакции рН и участвует в сборке капсулы. Другим примером является недавно открытый и ассоциированный с вирулентностью штаммов C. neoformans белок DEAD-box (VAD 1). При дефиците этого белка у штамма криптококка, иммунная система макроорганизма быстро элиминирует патоген, однако функция VAD 1 пока еще не выявлена. В дополнение к вышеупомянутому App1, у C. neoformans существуют другие антифагоцитарные механизмы, опосредованные обширной регуляторной сетью. Ключевую роль играет транскрипционный фактор 201 семейства Gata (Gat201), известен Gat204 и Barwin-подобный протеин 1(Blp1). Blp1 был описан как семейство глюканаз и целлюлаз грибов и растений, но их функция у C. neoformans до сих пор не выяснена. В тоже время, Blp1- мутанты C. neoformans никогда не имеют гиповирулентного фенотипа, а Gat201 и Gat204 показывают снижение колонизации криптококков в легких [68].

С 1981 года криптококковая инфекция стала основной причиной заболеваемости и смертности у лиц с угнетенной иммунной системой вследствие эпидемии ВИЧ-инфекции. В настоящее время криптококкоз входит в число трех наиболее опасных для жизни оппортунистических инфекций у больных СПИДом [177, 6]. Распространенность криптококкоза у ВИЧ-инфицированных лиц резко снизилась после внедрения высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ), но несмотря на это, сохраняется сложная эпидемическая ситуация в странах Африки и Юго-Восточной Азии, в которых до 30% пациентов со СПИД больны криптококкозом [90]. Не следует забывать и о том, что криптококкоз у ВИЧ-негативных пациентов с тяжелыми нарушениями иммунной системы также может достигать высокого уровня летальности [77].

Определение вирулентности криптококков на лабораторных животных

Протегрины PG-1, PG-2, PG-3 - антимикробные пептиды лейкоцитов свиньи, близкие изоформы с молекулярной массой 2000 Da, были получены сотрудниками отдела общей патологии Научно-исследовательского института экспериментальной медицины СЗО РАМН Кокряковым В.Н. и Кораблевой Е.С. Для получения использовали метод кислотной экстракции с последующей очисткой с помощью обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии [223].

Чувствительность криптококков к суммарной фракции протегринов определяли методом серийных разведений путем совместной инкубации 1104 кл/мл C. neoformans с различными концентрациями PG-1,2,3 в стерильном растворе фосфатно-солевого буфера (0,5; 1; 2,5; 5; 7,5 мкг/мл) [12]. После 30 мин инкубации при 370 С, 100 мкл взвеси засевали на чашки с агаром Сабуро и инкубировали 72 ч при 370 С. В контрольных образцах, вместо протегринов, использовали аналогичное количество раствора фосфатно-солевого буфера. Антифунгальную активность протегринов оценивали по числу колониеобразующих единиц (КОЕ) с последующим определением минимальной фунгицидной концентрации (MFC50) для каждого штамма C. neoformans. За величину MFC50 принимали наименьшую концентрацию суммарной фракции протегринов, при которой погибало 50% криптококков. Минимальную фунгицидную концентрацию определяли путем построения графиков зависимости фунгицидной активности протегринов от концентрации пептидов по усредненным значениям трех независимых экспериментов

Статистическую обработку полученных в результате экспериментов медико-биологических данных проводили c помощью программной системы STATISTICA for Windows (версия 6.0).

В соответствии с целями и задачами исследования, а также с учетом специфики анализируемых переменных [1, 2, 15, 18] нами выполнялись: построение и визуальный анализ графиков и диаграмм разброса данных; построение гистограмм разброса данных; расчет элементарных статистик (средние значения, ошибки средних, среднеквадратические отклонения, размах разброса данных); построение и визуальный анализ корреляционных полей связи между анализируемыми параметрами; расчет корреляционных матриц на основе линейной корреляции и непараметрических методов. сопоставление частотных характеристик качественных показателей проводилось с помощью непараметрических методов %2. Сравнение количественных характеристик в исследуемых группах осуществлялось с использованием критериев Манна-Уитни с указанием медианных значений показателей с интерквартильным размахом 25%-75%, Ме (Lq - Hq) [1, 18].

Анализ выживаемости животных проводили на основе определения выживаемости по методу Каплана-Мейера.

Для сравнения двух групп использовался многовыборочный критерий, который представляет собой развитие критерия Вилкоксона, обобщенного Геханом [15, 18].

Для визуализации структуры полученных результатов, использовали графические возможности системы Statstica for Windows, включая построение кривых выживаемости по методу Каплана-Мейера, и модуль построения диаграмм Microsoft Office. Количественные показатели в исследуемых подгруппах были представлены в форме «Box & Whisker Plot» с отражением среднего значения, ошибки среднего и стандартного отклонения для указанного параметра [15,18].

Используемые в работе методы статистического анализа не требуют специального контроля достаточности количества наблюдений, все допустимые оценки и заключения делаются при автоматическом учете фактически имеющихся данных [2, 18].

Критерием статистической достоверности полученных результатов считали общепринятую в медико-биологических исследованиях величину р 0,05 [1, 2, 15, 18]. ГЛАВА 4 Морфо-биологическая характеристика штаммов С. neoformans Криптококкоз относится к оппортунистическим инфекциям и важную роль в развитии заболевания играют, как известно, иммунные факторы. Учитывая ингаляционный путь заражения, взаимодействие патогена с макрофагами, которые являются первой линией защиты, определяет в значительной мере возникновение криптококкоза. Из клинических наблюдений известно, что криптококкоз может развиваться как стремительно, так и иметь хроническое течение. Для изучения факторов, влияющих на тяжесть течения криптококкоза от факторов вирулентности С. neoformans, была выбрана модель экспериментального криптококкоза на животных. Классическая триада факторов вирулентности С. neoformans представлена способностью к росту при 37 С, способностью к капсуло – и меланино-образованию. Для изучения взаимодействия С. neoformans разной вирулентности с макрофагами, патогенность была охарактеризована по этим показателям. С помощью проведенных экспериментов мы моделировали ранний этап иммунного ответа, который является ключевым в развитии криптококковой инфекции и дальнейшего исхода заболевания.

Среди больных криптококкозом было 9 мужчин и 3 женщины. Медиана возраста больных составила 35,5 ± 2, 66 года (от 20 до 50 лет), у больных ВИЧ-инфекцией средний возраст составил 34,89 ± 2,47 года (от 24 до 43 лет).

Использованные в работе штаммы криптококков характеризовали по морфо-биологическим свойствам. Штаммы образовывали слизистые блестящие колонии светло-кремового или кремового цвета при температуре инкубации 37 С на агаре Сабуро в течение 3-х суток. При микроскопическом исследовании нативных препаратов, клетки всех исследуемых штаммов были округлыми, одиночными или почкующимися, образовывали полисахаридную капсулу, что соответствовало описанию грибов рода Cryptococcus в определителе дрожжей [172].

Средний диаметр клеток штаммов C. neoformans определяли в пределах от 7,20 ± 0,06 мкм до 14,33 ± 0,51 мкм. При микроскопии у всех штаммов криптококка выявляли капсулу, размер которой также значительно варьировал от 1,66 ± 0,07 мкм до 8,70 ± 0,54 мкм (таблица 6).

Влияние штаммов C. neoformans разной вирулентности на способность макрофагов к продукции супероксиданионов in vitro

Следует заметить, что данные о влиянии вирулентности штаммов C. neoformans на особенности иммунного ответа при взаимодействии с клетками врожденного иммунитета ограничены. Одни авторы считают, что это связано с состоянием иммунной системы макроорганизма, другие придерживаются мнения о необходимости учитывать факторы вирулентности патогена [29, 5]. Полученные экспериментальные данные указывают, что выявленные различия в иммунном ответе при взаимодействии с криптококками связаны со степенью вирулентности штаммов.

Нами установлено, что все исследованные штаммы соответствовали классической триаде факторов вирулентности С. neoformans: способности к росту при температуре макроорганизма (37 С), способности к капсулообразованию и меланинообразованию. Способность исследованных С. neoformans к росту при физиологических температурах тела не менее важна, чем любые другие факторы патогенности. При сравнении C. neoformans с другими представителями рода Cryptococcus было выявлено, что многие криптококки обладают факторами вирулентности, такими как капсула и лакказа, но при этом они не являются патогенными только потому, что они не способны к росту при температуре тела млекопитающих [26]. Одним из важных факторов патогенности криптококков является их способность к капсулообразованию [255]. В проведенном нами исследовании при микроскопии у всех штаммов С. neoformans выявляли полисахаридную капсулу, размер которой варьировал от 1,66 ± 0,07 мкм до 8,70 ± 0,54 мкм. Полученные результаты согласуются с данными зарубежной литературы о роли капсулы как одного из основных факторов патогенности [92, 180, 284]. В окружающей среде капсула также играет важную роль в защите организма против неблагоприятных условий, таких, как обезвоживание [255], поэтому существующая гипотеза отечественных ученых об общебиологической роли капсулы С. neoformans сохраняет свою актуальность [7].

Способность криптококков к меланинообразованию оценивали при выращивании на среде с L-ДОФА при t 28 С и 37 С. Все исследуемые культуры уже на 1-е сутки инкубации при t 28 С проявляли фенолоксидазную активность. Активность фермента при температуре инкубации 28 С была значительно выше, чем при 37 С

В нашей работе установлено, что штаммы C. neoformans проявляли разную фенолоксидазную активность, их способность к меланинообразованию in vitro не коррелировала со степенью вирулентности. С одной стороны, полученные результаты не вполне согласуются с данными о том, что меланин-продуцирующие штаммы C. neoformans являются более вирулентными [59]. С другой стороны, они совпадают с аналогичными результатами в других исследованиях, в том числе с теми, в которых криптококки, не относящиеся к патогенным, способны образовывать меланин [26]. Это можно объяснить штаммными различиями C. neoformans в сочетании факторов патогенности и выраженности их действия.

Это не вполне согласуется с данными отечественной и зарубежной литературы, согласно которым меланин рассматривается как один из основных факторов патогенности [185, 60].

С течением времени грибы приобрели различные способы уклонения от защитных механизмов иммунной системы макроорганизма. Выбор способа выживания зависит от продукции специфических факторов патогенности и/или от условий, которые эти патогены находят в организме-хозяине. Однако механизмы, посредством которых криптококки уклоняются от поглощения фагоцитами и разрушения внутри фаголизосом клетки, остаются мало изученными [30].

Можно предположить, что исход взаимодействия между грибами и макрофагами зависит от состояния иммунной системы макроорганизма и степени вирулентности грибов. В этом отношении, фагоцитоз грибов макрофагами можно рассматривать как главный механизм врожденной иммунной системы, контролирующий возникновение инфекции, и ее исход. Для выявления механизмов взаимодействия С. neoformans с фагоцитарными клетками in vitro, оценивали влияние криптококков разной вирулентности на поглотительную активность макрофагов, “респираторный взрыв”, продукцию оксида азота, выработку широкого спектра провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и киллинг криптококков макрофагами.

При проведении серии экспериментов нами было показано, что интактные макрофаги мышей обладали слабой поглотительной активностью по отношению ко всем исследованным штаммам С. neoformans. Но при этом макрофаги более эффективно фагоцитировали клетки C. neoformans слабовирулентных штаммов по сравнению с сильновирулентными (р 0,05). Нами также выявлена обратно-пропорциональная зависимость между шириной капсулы C. neoformans и фагоцитарным индексом макрофагов (r=-0,42; р 0,05). Полученные данные согласуются с результатами других исследователей, которые установили, что генетически модифицированные штаммы криптококков, у которых отсутствует капсула, успешно поглощаются макрофагами, тогда как криптококки с выраженной капсулой более резистентны к фагоцитозу [279, 92, 165]. Наши результаты также подтверждают мнение других ученых о том, что капсула оказывает влияние на процесс поглощения С. neoformans, и представлять собой барьер, предотвращающий контакт между лигандами клеточной стенки гриба, такими как маннаны или -гликаны, и их рецепторами на фагоцитах [69, 169].

Входящий в состав клеточной стенки большинства микромицетов и расположенный непосредственно под капсулой гриба -гликан взаимодействует с рецепторами макрофагов, в основном с dectin-1, и стимулирует микробицидную активность фагоцитов [74]. Использованный в нашей работе ламинарин представляет собой (1,3)-гликан с (1,6)-связями – полисахарид, выделенный из бурых водорослей Laminaria digitata и обладает сродством к рецептору на макрофагах. В проведенном исследовании выявлено, что ламинарин снижал способность макрофагов поглощать клетки грибов как слабовирулентных, так и сильновирулентных штаммов (р 0,05).

Похожие диссертации на Особенности иммунного ответа на штаммы Cryptococcus neoformans разной вирулентности