Введение к работе
Актуальность темы. Синдром приобретенного иммунодефицита человека (СПИД), вызываемый вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), впервые был зарегистрирован в 1981 г. [Gottlieb, 1981]. Высокая скорость и пандемическое распространение заболевания, а также взрывной характер манифестации ВИЧ-инфекции заставляют искать способы ее лечения и профилактики.
Современная высокоактивная антиретровирусная терапия, включающая комплекс противовирусных препаратов, позволяет увеличить продолжительность жизни ВИЧ-инфицированного, но не обеспечивает его полного выздоровления. В связи с этим, актуальным является создание эффективной вакцины, которая позволила бы ограничить циркуляцию и накопление ВИЧ-1 в популяции.
Одним из наиболее перспективных направлений при создании вакцины против ВИЧ-инфекции является дизайн искусственных полиэпитопных иммуногенов, которые включают иммунологически значимые консервативные эпитопы из разных вирусных белков [Eroshkin et al., 1995]. При этом исключение из списка эпитопов антигенных детерминант, обладающих иммунопатогенным действием, позволяет значительно увеличить безопасность полиэпитопных вакцин. В настоящее время разработаны иммуногены данного типа как для индуцирования антител [Cai et al., 2007; Eroshkin et al., 1995; Kumar et al., 1994], так и ответа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) [Alexander et al., 2002; Bazhan et al., 2004; Gomez et al., 2004; Karpenko et al., 2004].
В ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" (р.п. Кольцово, Новосибирская обл.) были получены две полиэпитопные конструкции, направленные на формирование гуморального (TBI) и клеточного (TCI) иммунного ответа. Первый из них, TBI (Т and В cell immunogene), содержит пять В-клеточных и четыре Т-хелперных эпитопов из белков env и gag ВИЧ-1 [Eroshkin et al. 1995] и способен индуцировать у животных гуморальный ответ против антигенов ВИЧ-1 [Karpenko et al., 2003; Loktev et al., 1996]. Другой полиэпитопный белок, TCI (T cell immunogene), был разработан Бажаном СИ. с соавт. в качестве поли-ЦТЛ-вакцины [Bazhan et al., 2004]. В структуру белка (длина 392 а.о.) были включены более 80 перекрывающихся CD8+ ЦТЛ- и CD4+- Т-хелперных эпитопов из Gag, Env, Pol и Nef [Bazhan et al., 2004]. При иммунизации ДНК-вакциной pcDNA-TCI наблюдалось появление у мышей клонов специфических Т-лимфоцитов, отвечающих продукцией ИФНгамма при их рестимуляции специфическими пептидами [Karpenko et al., 2004].
Для доставки TBI- и ТСІ-иммуногенов были предложены искусственные вирусоподобные частицы (ВПЧ), полученные Лебедевым Л.Р. с соавт. [Lebedev et al.,
2000]. Поверхность ВПЧ содержит поверхностный белок TBI, что обеспечивает его эффективную презентацию В-клеткам. Кроме того, полиглюкиновая оболочка ВПЧ способна защищать ДНК, включенные в состав частиц, от действия окружающих нуклеаз, в результате чего доставка ДНК-вакцин с ВПЧ к антиген-представляющим клеткам (АПК) является более эффективной [Lebedev et al., 2000; Karpenko et al., 2003].
Ранее на основе технологии искусственных ВПЧ нами была получена кандидатная полиэпитопная вакцина против ВИЧ-инфекции, содержащая рекомбинантный белок TBI и ДНК-вакцину pcDNA-TCI и названная комбинированной анти-ВИЧ-вакциной (КомбиВИЧвак) [Karpenko et al., 2007]. Было показано, что двукратная иммунизация КомбиВИЧвак вызывает образование нейтрализующих антител и ВИЧ-специфических Т-лимфоцитов у мышей [Karpenko et al., 2007].
Между тем, оставалось неизученным, способны ли два полиэпитопных иммуногена взаимно влиять друг на друга при индукции иммунного ответа. В настоящее время существует ряд примеров комбинированных вакцин - вакцина против столбняка, дифтерии и коклюша [Mawas et al., 2006], вакцина против краснухи, паротита, кори и ветряной оспы [Ovsyannikova et al., 2007] и ряд других. Взаимное влияние между антигенами при их комбинировании было показано для вакцин, полученных на основе как различных патогенов, так и одного и того же вирусного агента [Clemens et al., 1995; Zeng et al., 2009]. При этом заранее предсказать характер взаимодействия (синергизм, антагонизм, нейтральное взаимодействие) между отдельными компонентами в комбинированной вакцине практически невозможно. В этой связи, актуальной задачей является оценка взаимного влияния белка TBI и ДНК-вакцины pcDNA-TCI в составе вакцины КомбиВИЧвак, чтобы исключить ингибирующее действие компонентов вакцины на индуцируемый ими иммунный ответ.
Кроме того, до настоящего времени было неизвестно, на протяжении какого времени плазмидная ДНК, доставляемая вместе с КомбиВИЧвак, присутствует в органах иммунизированных животных. Ранее в ходе доклинических испытаний не было обнаружено долговременных биохимических, физиологических и морфологических изменений, что позволило сделать первичные выводы о безопасности КомбиВИЧвак [Karpenko et al., 2007]. Задача, касающаяся исследования времени элиминации плазмидной ДНК из организма, является актуальной, т.к. проблема безопасности генетической иммунизации остается одним из критических вопросов при переходе от доклинических к клиническим испытаниям.
Целью данной работы было изучение взаимного влияния полиэпитопных иммуногенов TBI и TCI на индукцию иммунного ответа в составе комбинированной
бивалентной ДНК-белковой вакцины КомбиВИЧвак, а также оценка распределения плазмиды pcDNA-TCI, компонента КомбиВИЧвак, в органах иммунизированных животных.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Изучить характер взаимного влияния (синергизм, антагонизм, нейтралитет) между компонентами комбинированной вакцины в отношении индукции гуморального и клеточного ответов.
Разработать протокол для определения плазмиды pcDNA-TCI в органах иммунизированных животных.
Исследовать кинетику распределения плазмиды pcDNA-TCI, компонента КомбиВИЧвак, в органах иммунизированных животных.
Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые было показано, что иммунный ответ, вызываемый комбинированием двух полиэпитопных иммуногенов (рекомбинантным белком TBI и ДНК-вакциной TCI) обусловлен их взаимным влиянием, а именно: TCI вызывает увеличение TBI-индуцируемого гуморального ответа и усиливает дифференцировку ТЪ2-лимфоцитов.
Доставка ДНК-вакцины pcDNA-TCI с помощью КомбиВИЧвак сопровождается первоначальным накоплением плазмидной ДНК в большинстве исследованных нами органах (до 14 сут.), но далее наблюдается градиентное снижение концентрации pcDNA-TCI вплоть до уровня ниже достоверной детекции во всех изученных органах.
Разработан высокочувствительный метод для определения с помощью РТ-ПЦР ДНК-плазмиды pcDNA-TCI в органах мышей, иммунизированных вакциной КомбиВИЧвак. Протокол включен в состав научно-технической документации на вакцину КомбиВИЧвак.
Основные положения, выносимые на защиту.
ДНК-вакцина pcDNA-TCI, компонент КомбиВИЧвак, усиливает гуморальный ответ, вызываемый рекомбинантным белком TBI, белковым компонентом КомбиВИЧвак.
ДНК-вакцина pcDNA-TCI в составе КомбиВИЧвак обладает иммуномодулирующим действием и вызывает пролиферацию Th2-лимфоцитов.
Содержание ДНК-вакцины pcDNA-TCI в тканях иммунизированных животных градиентно снижается после одно- и двукратной иммунизации КомбиВИЧвак вплоть до полной элиминации из тканей к 60 сут. после последнего введения. Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 6
статей. Материалы диссертации были представлены на четырех Международных
конференциях: "Биотехнология и медицина" (Москва, Россия, 2006), 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology: Immunology and viral infections (Moscow, Russia, 2007), "Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития" (Алматы, Казахстан, 2008), 1st International FEBS Summer School on "Pathogen-Host Interplay" (Berlin-Potsdam, Germany, 2008); и двух российских конференциях: III Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), XI Всероссийский научный форум с международным участием им. В.И. Иоффе "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, Россия, 2007).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, включая 17 рисунков и 1 таблицу, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (198 наименований).
