Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 9
2.1 Характеристика антигенов трихинелл 16
2.2 Иммунохимический анализ антигенов Trichinella spiralis 20
2.3 Иммунитет при трихинеллезе 23
2.4 Иммунодиагностика трихинеллеза с помощью серологических реакций и методом иммуноблотинга 25
3 Материалы и методы 39
3.1 Антисыворотки 39
3.2 Белковые маркеры 39
3.3 Состав компонентов ИФА 40
3.4 Препаративные методы 41
3.4.1 Получение инвазионного материала 41
3.4.2 Приготовление соматического экстракта личинок трихинелл 41
3.4.3 Получение соматического фракционированного антигена 42
3.4.4 Получение экскреторно-секреторных продуктов личинок трихинелл 42
3.4.5 Получение гипериммунных сывороток 43
3.5 Электрофоретические методы 44
3.5.1 Электрофорез в денатурирующих условиях 44
3.5.2 Электроперенос 47
3.6 Иммунохимические методы 48
3.6.1 Выявление антигенов на фильтре 48
3.6.2 Имму но ферментная реакция 49
3.7 Аналитические методы 51
3.7.1 Определение концентрации белка в пробе 51
3.7.2 Определения концентрации окиси азота по модифицированному методу Грисса 51
4 Результаты исследований 53
4.1 Выделение соматических и экскреторно-секреторного антигеновЗЗ
4.2 Получение гипериммунных сывороток 56
4.3 Определение и сравнение белкового состава антигенов 59
4.4 Изучение иммуногенных свойств выделенных антигенов 65
4.5 Определение диагностической эффективности выделенных антигенов 70
4.5.1 Определение диагностической эффективности выделенных антигенов в ИФР 70
4.5.2 Сравнительный анализ диагностической эффективности ИФР и иммуноблота 71
Заключение 75
Выводы 81
Практические предложения - 83
Список литературы , 84
Приложения ПО
- Иммунохимический анализ антигенов Trichinella spiralis
- Белковые маркеры
- Иммунохимические методы
- Определение и сравнение белкового состава антигенов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Трихинеллез является широко распространенным зоонозом, характеризующимся сложным патологическим проявлением, нередко с тяжелыми последствиями В связи с тгим. проблема борьбы с этим опасным гельминтозом имеет важное медицинское, ветеринарное и социально-экономическое значение.
Ежегодно в Российской Федерации регистрируется до 700 сл\чаев заболевания трихинеллезом людей, причем в 40% они носят групповой характер Стационарно неблагополучными по данном) паразитоз} в настоящее время остаются регионы Северного Кавкаи Восточной Сибири. Дальнего Востока и Кировской области (Т.Н Ашурбекова 2000 1 И Гвердохлебова и др 2000 Б Р Гаркави и др 2001. М А Попов и др 2002 А А Пшеничный А Я Сапунов 2002) Широкий круг восприимчивых животных и многообразие трофических связей способствует передаче возбудителя на нескольких уровнях с вовлечением в циркуляцию как насекомых-трупоедов. так и мелких млекопитающих, птотоядных. всеядных животных и крупных хищников (Б Р Гаркави 2004 НН Макаров 2003. В А Ромашов. Б В Ромашов. 1992, Ф К Скворцова 2002. В А Ромашов и др 1996. Б В Ромашов, М В Рогов 2002) Все э ги условия создают реальную опасность заражения людей трихинеллезом несмотря на меры предосторожности пред>смоїрепные с_\ществ\ющими веіеринарно-санитарньтми требованиями
Диагностика трихинеллеза занимает ведущее место в системе мероприятий, направленных на предупреждение заботевания населения и животных В данном случае, наибольшего внимания заслуживают методы прижизненной диагностики, позволяющие пред\предить распространение инвазии и с\щсственно сниіиіь затраты на содержание зараженных животных
В настоящее время активно продолжается поиск точных методов прижизненной диагностики, которые бы отличались высокой циагностической эффективностью с одной стороны и являлись достаточно экономичными дня широкого использования не только в медицине, но в первую очередь в сфере ветеринарного обслуживания животноводства
Общеизвестно, что успех любой серодиагностики зависит от качества антигенов используемых для выявления того или иного гельминтоза Без предварительного имм}нохимического исследования белковой структуры трихинелл, невозможно направленное применение антигенных компонентов данного гельминта для высокоспецифичной и чувствительной прижизненной зиагносгики
1 '--Ssrj
Цели и задачи исследования. Основной келью настоящих исследований явилось получение соматического фракционированного и экскреторно-секреторных антигенов, проведение их иммунохимического анализа и оценка диагностических свойств в ИФР
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи
-
Получить личинки грихинелл для приготовления разных антигенов.
-
Получить полный соматический экстракт. соматический фракционированный и экскреторно-секреторные антигены трихинелл,
-
Получить кроличьи гипериммунные сыворотки,
-
Провести электрофоретическое разделение полученных антигенов в ПААГ.
-
Провести иммунохимический анализ белков-антигенов с помощью иммуноблота с использованием гипериммунных сывороток кроликов'
-
Оценить диагностическую эффективность соматического фракционированного и экскреторно-секреторных антигенов в ИФР.
-
Провести сравнительные испытания диагностической эффективности ИФР и иммуноблота
Научная новизна. В данной работе предложены качественно новые способы получения белковых компонентов Т spiralis Нарабоганные белки-антигены изучены с помошыо иммунохимического анализа, позволившего определить молекулярную масс) основных антигенов Т spiralis, выделенных из сложного набора белков, секретируемых этим гельминтом, а также дать им иммунологическую характеристику Эти исследования помогай получить высокоспецифичные, чувствительные антигены Т spiralis которые можно использовать для точной прижизненной диагностики, а также в качестве протективного препарата у животных
Практическая ценность работы. По результатам исследований по теме диссертации подготовлены и утверждены следующие нормативные документы-
Методика получения экскреторно-секреторных продуктов личинок Т spiralis Автор Курносова О П
Методические рекомендации по получению и анализу иммуногенных белков тканевых гельминтов и клеток генно-инженерных штаммов, продуцирующих антигены (Т spiralis. Е granulosis) Авторы Одоевская ИМ Курносова ОП. Успенский А.В . Бенедиктов И И
Патент Способ получения основных иммуногенных антигенов Т spiralis Входящий номер 006444, регистрационный номер 2005105086 от 25 02 200^ і
Апробация результатов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на
-иа>чной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными бопезнями» (Москва. 2004 і ).
-секции «Инвазионные бозеэни животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (2005 г).
-заседаниях Ученого совета ВИГИС 2003-2005 і г
Основные положення, выносимые на защиту:
-методические основы получения соматического фракционированного и зкекреторно-секреї орного антигенов личинок Т spiralis,
-комплексная оценка бечковот состава антигенов личинок трихинелл на основе градиентного электрофореза в ПААГ
-имм} нохимический анализ белков-антигенов с помощью иммуноблота с использованием гипериммл иных сывороток кроликов
-оценка диагностической эффективности соматического фракционированного и экскреторно-секреторных антигенов в ИФР.
-сравнительные испытания диагностической эффективности ИФР и иммуноблота
Публикации. По теме диссер і ации опубликовано 10 работ
Объем и структура работы. Диссертация изтожена на 110 страницах машинописного текста и сосгоиі иі вветепия. обзора литературы, материалов и методов исследований результатов собственных исс іедований. выводов, практических предложений, списка литературы и приложения Список литературы включает 193 источника, в том чисте 97 отечеивенных авторов и 96 зарубежных авторов Рабога иллюс грирована 6-ю таблицами и 9-ю рис) иками
Иммунохимический анализ антигенов Trichinella spiralis
Роль иммунохимии в гельминтологии заключается в решении вопроса о том, какие вещества в гельминтах являются специфическими антигенами, участвующими в процессах иммуногенеза при данном заболевании, какова природа этих веществ (Г.А. Ермолин 1968). Для такого анализа широко используется электрофоретическое разделение белков, полипиптидов и нуклеиновых кислот. Метод электрофореза, т. е. разделения в электрическом поле молекул, обладающих разным зарядом, широко используется для изучения белкового состава антигенов трихинелл (И. Лефковитс 1981, Г.А. Ермолин 1968, Е.Е. Ефремов 1982, Ю.И. Васерин 2000, Г.А. Козлова 1999, С. Кондратьев, Л. Михов 1974, Л.И. Липатова 1991, R. Arasi 1995, М.А. Dea-Ayugera et al. 2000, J.L. Dela-Rosa et al. 1995, D.D. Despommier 1990, H.R. Gamble 1985, R,R. Leung, R.C.Ro 2000, L. Tyrsecova et al, 1997, Y.A Zhan 2000, D. Zhu, R.G. Bell 1990, R. Hereza-Esparca et al. 1987, Т.О. Alkarmi, G.M. Faubert 1985, D.S. Zarlenga 1990, P. Arasu 1995).
Для иммунохимического анализа сложных белковых смесей в настоящее время применяется электрофоретическое разделение индивидуальных компонентов с последующей обработкой специфическими антителами. Такой метод исследования получил название «иммуноблотинг». Своим происхождением это название обусловлено использованием для иммунохимического анализа «реплики» электрофоретической картины (или иначе «блота» - англ. «blot»), получаемой при переносе полипептидных компонентов из пористого геля. Нитроцеллюлозные мембраны нековалентно и необратимо связывают индивидуальные полипептиды. Полученный «отпечатоюьблот, полностью отражающий картину разделения на геле, становится доступен для дальнейшего взаимодействия с антителами ( Л.А. Остерман 1981, К.В.
Фрезе 2001; Р. Скоупс 1985, Н. Towbin 1979, W.N. Bumette 1981). Иммунохимический анализ антигенов трихинелл позволил изучить и выделить наиболее иммуногенные белковые молекулы личинок трихинелл. Целенаправленное использование таких антигенов в серодиагностике поможет уменьшить случаи ложноположительных реакций, повысит чувствительность и . специфичность различных .диагностических тест-систем.L. Turcekova et al. (1997) исследовали антигены Т. spiralis и Т. pseudospiralis методом иммуноблота. Для исследования авторы использовали соматические антигены и экскреторно-секреторные продукты личинок трихинелл, полученные методом культивирования личинок в среде RPMI 1640 в течение 5-ти суток. Исследователи установили, что антигенный профиль у соматического экстракта состоит из белковых полос с молекулярным весом 18, 43, 47, 65, 80 и 94 кДа, причем белковые полосы 65 и 80 кДа не обнаруживаются у Т. pseudospiralis. После проведения иммуноблота с гипериммунными кроличьими сыворотками авторы установили наличие 6-ти полос от 43 до 70 кДа у Т. spiralis и три белковые полосы (43, 48 и 70 кДа) у Т. pseudospiralis.
После 24 ч культивирования личинок в питательной среде было обнаружено 2 белковые полосы с молекулярным весом 43 и 48 кДа, после 92 ч инкубации - 43, 48, 50 и 80 кДа; после 5-ти дней инкубации антигенный профиль экскреторно-секреторных продуктов личинок трихинелл увеличивался и приближался к профилю соматического антигена Т. spiralis, что, по мнению авторов, связано с лизисом личинок и постепенным выходом антигенов в культуральную жидкость. В экскреторно-секреторных антигенах Т. pseudospiralis белковый профиль схож с экскреторно-секреторными белками Т. spiralis после культивирования в течении 5-ти суток. Эти данные сопоставимы с результатами О.С. Ко и L. Fan (1996).
Иммуноблотинг антигенов трихинелл также проводил С. Ariaga et al. (1989). Автор обнаружил пять главных белков с молекулярными весами от 43 до 63 кДа. Эти данные сопоставимы с данными, полученными L. Turcekova . По мнению С. Ariaga, эти белки содержат антигенные эпитопы и продуцируются в ходе развития инвазии. О наличии аналогичных белков трихинелл - поверхностных антигенов, также сообщает R.M. Parkhouse et al. (1981).J. Сні et al. (1999) исследовали экскреторно-секреторные продукты личинок трихинелл, полученные методом культивирования in vitro в течении 18 и 30 часов. Полученные белковые продукты исследовали методами электрофореза и иммуноблотинга. Авторы установили, что, несмотря на разные сроки культивирования, белковые компоненты экскреторно-секреторных продуктов мышечных личинок Т. spiralis оказались схожими. Электрофорез показал, что молекулярный вес основных белковых компонентов экскреторных продуктов трихинелл, полученных в разные сроки культивирования составил: 112, ПО, 108, 97, 53, 49, 45, 42, 35, 23 и 16 кДа.
Иммунохимический анализ показал, что, белковые полосы 102, 97, 95 и 53 кДа полученные после 18-ти ч культивирования личинок и белковые полосы с молекулярным весом 53, 49, 45 и 43 к Да, полученные после 30-ти часов культивирования перекрестно реагировали с сыворотками от пациентов, больных парагонимозом, клонорхозом, шистозомозом и цистицеркозом. Белок экскреторно-секреторных продуктов с весом 23 кДа реагировал только с сыворотками от крыс и мышей, зараженных Т. spiralis и с сыворотками от пациентов, больных трихинеллезом, и не взаимодействовал с сыворотками от животных и людей, зараженных другими паразитозами. Таким образом, по мнению этих авторов, белок с молекулярным весом 23 кДа в экскреторно-секреторных продуктах личинок Т. spiralis является специфичным
Белковые маркеры
В качестве стандартов использовали смесь белков фирмы Хеликон (Москва), содержащую белки-маркеры; фосфорилазу b (94 кДа), БСА (67 кДа), овальбумин (45 кДа), карбоангидразу (31 кДа) и ингибитор трипсина из сои (20,1 кДа). Фосфатно-солевые буферы (ФСБ) Для получения 1 литра 0,1 М буфера, рН 7,4, брали 8 г хлористого натрия, 0,2 г хлористого калия, 1,15 г двузамещенного фосфата натрия и 0,2 г однозамещенного фосфата калия. Для получения 1 литра 0,15 М ФСБ (рН 7,2) брали 8 г NaCl, 2,9 г Na2HP04 и 0,2 г Na2HP04. Карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ) Для приготовления карбонатно-бикарбонатного буферного раствора (0,05 М, рН 9,6), в 1 л дистиллированной воды растворяли 21,2 rNa2C03; 16,8 г ШНСОз растворяли в 1 л дистиллированной воды, после чего смешивали 4 мл раствора карбоната и 8,5 мл раствора бикарбоната и доводили объем смеси дистиллированной водой до 50 мл. Цитратный (субстратный) буфер (ЦБ) Для приготовления цитратного буферного раствора (0,15 М; рН 5,0) в 1 литре воды растворяли 35,8 г цитрата натрия (Na3C6H507x2H20); в 1 литре воды растворяли 21,09 г лимонной кислоты (0,1 М), после чего к 5,5 мл раствора цитрата натрия добавляли 5 мл раствора лимонной кислоты и 10млН2О. Субстратная смесь. Субстратная смесь готовилась непосредственно перед использованием. В 10 мл цитратного буфера растворяли 3,4 мг орто-фенилендиамин-дигидрохлорида и добавяли 5 мкл 30%-го раствора перекиси водорода. Стоп-реагент. Для остановки цветной ферментативной реакции использовали 2М раствор H2SO4. Для его приготовления в 177,8 мл воды осторожно вносили 22,2 мл концентрированной серной кислоты. Белых беспородных крыс заражали per os инвазионными личинками Т. spiralis в дозе 10 лич/г живого веса. Через 1,5 месяца животных убивали, снимали шкуру, удаляли внутренние органы. Мышечные ткани измельчали в мясорубке. Примерно 50 г мясного фарша помещали в мешочки (ткань П4180, ГОСТ 4403) и осуществляли переваривание в 3%-ом искусственном желудочном соке при 39С в течение 10-12 часов. Искусственный желудочный сок (ИЖС) готовили по следующей прописи: НС1 - 10,0 мл, пепсин - 3 г, дистиллированная вода - 1 л. Осевших личинок многократно промывали физиологическим раствором. Жизнеспособность личинок оценивали под микроскопом. Выделенных личинок концентрировали и хранили при -20С до использования.
Для измельчения личинок растирали в фарфоровой ступке с добавлением битого стекла и замораживали, после чего оттаивали и повторяли процедуру. Эту операцию повторяли 5-6 раз, до получения однородной гомогенной массы. Однородность гомогената проверяли под микроскопом: допускалось наличие единичных, крупных фрагментов гельминтов в редких полях зрения. К полученному объему гомогената добавляли физиологический раствор в пропорции 1:3 и инкубировали в течение 18 ч при температуре 4С на магнитной мешалке. Полученный экстракт центрифугировали при 12000 g и 4С в течение 20 мин, после чего отобранный супернатант помещали в диализную ленту Spectrapor № 1 фирмы Reanal и диализовали против 0,9% NaCl в течении 48 ч при температуре 4 С с 4-х кратной сменой буфера. После диализа антиген концентрировали сухим ПЭГ-6000 при температуре 4 С в течение 4-5 часов. Концентрацию белка определяли по поглощению при длине волны 280 им спектрофотометре 200-20 (фирмы Hitachi, Япония).
Полный соматический экстракт в объеме 5 мл фракционировали на колонке Sephadex G-100, диаметром 2,6 см, высотой 60 см. Колонка была уравновешена 0,9 % NaCl. Белки элюировали тем же раствором, скорость элюции составила 20 мл/ч, объём собираемых фракций - 3 мл. Фракции собирали после того, как через колонку пропускали 100 мл элюирующего расвтора. Содержание белка во фракциях определяли по поглощению при длине волны 280 нм.
Белковые продукты личинок получали по методу Gamble Н. R. (1985) с некоторыми модификациями.
Полученных после переваривания в ИЖС инвазионных личинок трихинелл 5-6 раз отмывали стерильным физиологическим раствором с добавлением антибиотиков: 5 мкг/мл ампициллина, гентамицина, 50 ЕД/мл леворина и 2 мкг/мл доксициклина.
Иммунохимические методы
Иммунное выявление антигенов на фильтре выполняли по методу Towbin et al (1979). Все операции проводили при температуре 37С и легком встряхивании с помощью аппарата для встряхивания АВУ-бс (частота встряхивания 65 раз в мин).
Предварительно фильтр инкубировали в течение 1 ч в растворе А (2% обезжиренного сухого молока, растворённое в 0,15 М ФСБ, содержащем 0,05% Твин-20). Эта процедура необходима для блокирования свободных участков мембраны и в последующем предотвращения неспецифической сорбции антител на эти участки. По окончании инкубации фильтр отмывали 0,15 М ФСБ с 0,05%-ным Твин-20 три раза по 10 мин. Инактивированный фильтр далее инкубировали 1 ч при 37С с первичными антителами в разведёнными в растворе А до необходимого титра. После чего фильтр отмывали от избытка антител 0,15 М ФСБ с 0,05%-ным Твин-20 три раза по 10 мин. Затем фильтр инкубировали в течение 1-го ч со вторичными антителами: в разведении 1:5000 и отмывали от избытка вторичных антител 3 раза по 10 мин ) 0,15 М ФСБ с 0,05%-ным Твин-20. Для окрашивания, отмытый фильтр погружали на 15 мин в 0,05%-ный раствор 4-хлор-1-нафтола в 0,15 М ФСБ, содержащем 0,06% перекиси водорода (20 мкл 30%-ной перекиси водорода на 10 мл). Раствор готовили непосредственно перед использованием. После развития окраски, реакцию останавливали, промывая фильтр дистиллированной водой. Для предотвращения выцветания фильтр хранили в темноте.
Планшеты сенсибилизировали антигенами из расчета 0,5 мкг на лунку. Непосредственно перед нанесением готовили раствор антигенов в КБК.0,05 М из расчёта 5 мкг/мл, после чего в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл раствора и инкубировали 18 ч в холодильнике при 4С.
После инкубации раствор выливали из лунок планшета и трижды промывали планшет, внося в лунки по 100 мкл дистиллированной воды с0,05% Твин-20 на 5 минут. По окончании промывки планшеты просушивали с помощью фильтровальной бумаги.
Исследуемые и контрольные сыворотки разводили 0,1 М ФСБ с добавлением 0,05% БСА и 0,05% Твин-20 в соотношении 1:100. Разведенные сыворотки вносили по 100 мкл в каждую лунку планшета и инкубировали 30 мин при температуре 37С. По окончании инкубации, растворы выливали из лунок планшета, после чего планшет трижды промывали, внося в лунки по 100 мкл дистиллированной воды с 0,05% Твин-20 на 5 минут. Оставшийся отмывочиый раствор удаляли и просушивали планшеты с помощью фильтровальной бумаги.
Для разведения коныогата, содержимое ампулы растворяли в 200 мкл 0,1 М ФСБ. Этот концентрированный раствор хранили при -20С. Непосредственно перед использованием коныогата, его разводили до рабочего титра (1:12 000), разбавляя концентрированный раствор 0,1 М ФСБ с добавлением 0,05% Твин-20 и 0,5% БСА.
В каждую лунку вносили по 100 мкл коныогата, инкубировали 30 мин при температуре 37С. По окончании инкубации, растворы выливали из лунок планшета, после чего планшет трижды промывали, внося в лунки по 100 мкл дистиллированной воды с 0,05% Твин-20 на 5 минут. Оставшийся отмывочиый раствор удаляли встряхиванием и лунки просушивали с помощью фильтровальной бумаги.
Субстратную смесь готовили непосредственно перед использованием, растворяя 8 мг ОФД в 12 мл цитратного буфера. Полученный раствор был чувствителен к свету, поэтому его помещали в темное место. Перед внесением в лунки планшета к раствору ОФД добавляли 10 мкл стабилизированной перекиси водорода. В каждую лунку вносили по 100 мкл раствора и ставили планшеты в темное место на 10-15 мин для развития окраски.Реакцию останавливали внесением в лунки 50 мкл 2М серной кислоты. Оптическую плотность находящихся в лунках растворов определяли на приборе Titertak.
Концентрацию белка в пробе определяли по оптической плотности при 280 им. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре, модель 200-20, фирмы Hitachi. Коэффициент экстинкции считали равным 1 (мг/мл )/ед. оптич. плотно сти.онцентрацию стабильных метаболитов оксида азота (N02 ) в моче кроликов определяли спектрофотометрическим методом, сочетающим восстановление нитрата с последующим определением образовавшегося нитрита с помощью реактива Грисса.
Для приготовления реактива Грисса использовали следующие растворы;Раствор Ї. 0.5 г сульфаниловой кислоты растворяли в 150 мл 2 М уксусной кислоты.Раствор 2. 0,2 г а-нафтиламина кипятили с 20 мл воды, раствор фильтровали и прибавляли к фильтрату 180 мл 2 М уксусной кислоты.Реактив Грисса готовили непосредственно перед использованием путем смешивания равных объемов растворов 1 и 2.
От каждого животного собирали мочу. Порции мочи объемом 10 мл наливали в колбы объемом 100 мл, добавляли 40 мл сульфата цинка (4,5 г/л), 10 мл 0,1 М NaOH и доливали до 100 мл дистиллированной водой. Содержимое колбы перемешивали, помещали в водяную баню и инкубировали при 100С в течение 7 мин. Раствор остужали до 50С и фильтровали через бумажный фильтр. К полученному прозрачному фильтрату объемом 5 мл прибавляли 1 мл аммиака, 2 мл концентрированной соляной кислоты, 2 мл дистиллированной воды, 5 мл образцового раствора NaN03 (1 мкг/мл) и 15 мл реактива Грисса. Полученную смесь инкубировали 15 мин при комнатной температуре в темноте, после чего измеряли оптическую плотность при длине волны 540 нм и оптическом пути, равном 20 мм. Массовую долю нитритов в мкг/мл определяли согласно значениям оптической плотности градуировочного графика нитритов (ГОСТ 8558.1-78, стр.10-14).
Определение и сравнение белкового состава антигенов
Для определения белкового состава антигенов проводили электрофоретическое разделение в денатурирующих условиях в полиакриламидном геле.
Полный соматический экстракт анализировали в геле, содержащем 12% акриламида и со сшивкой 2,6 %. Для того, чтобы выявить одинаково хорошо и мажорные и минорные белковые компоненты, препарат полного соматического экстракта нанесли на один гель в трех повторностях, с разной загрузкой дорожки по белку (60, 120 и 240 мкг белка на дорожку).
В составе полного соматического экстракта было обнаружено 29 белковых полос с молекулярными массами от 30 до 160 кДа.
Молекулярные массы выявленных белков, рассчитанные с помощью программы OneD-Scan были равны: 30,1, 31,6, 36,8, 38,3, 41,8, 43,7, 45,2, 47,5, 49,8, 52,2, 56,2, 58,4, 60,1, 62,0, 63,6, 65,2, 66,8, 69,5, 77,6, 91,8, 98,6, 117,0, 122,8, 127,2, 142,5, 148,6, 158,9, 162,6 кДа (Рис. 3). Наиболее заметными были полосы с молекулярными массами от 45 до 55 кДа.
Соматический фракционированный антиген анализировали в геле, содержащем 10% акриламида со сшивкой 1,3 %. На гель нанесли 10, 11, 12, 13 и 14 фракции с колонки (см. «Выделение соматических и экскреторно-секреторного антигенов»). В составе 10 фракции были выявлены белки с молекулярными массами, определенными программой OneD-Scan, равными 25, 28, 35, 38, 45, 49, 53, 57 и 63 кДа. В 11 фракции выявлялись те же полосы, за исключением полосы 45 кДа, причем все белковые полосы были гораздо интенсивнее. Во фракции 12 было выявлено 6 белковых полос с молекулярными массами 25, 28, 49, 53, 57 и63 кДа. Во фракции 13 выявлялись только белки 49, 53, 57 и 63 кДа, а в 14 фракции только белки 49, 53 и 63 кДа (Рис.4).
Наиболее заметными в составе фракций были белки с молекулярными массами 49, 53 и 57 кДа.
Экскреторно-секреторные продукты личинок трихинелл, полученные культивированием личинок в в С02 инкубаторе (10% СО2), анализировали в геле с 10% содержанием акриламида и 1,3 % сшивкой.
После 24 часов культивирования в экскреторно-секреторных продуктах было обнаружено 5 белковых полос с молекулярными массами, определенными программой OneD-Scan, равными 27, 42, 45, 49, 56 кДа; после 48 часов культивирования 7 белковых полос с молекулярными массами 27, 42, 45, 49, 53, 56 и 65 кДа; после 72 часов культивирования 8 белковых полос с молекулярными массами 27, 37, 42, 45, 49, 53, 56 и 65 кДа (Рис. 5). После первых суток культивирования основными белками экскреторно-секреторных продуктов являются белки с молекулярными массами 42 и 44 кДа. После вторых суток культивирования доля белка 42 кДа сильно уменьшается, а доля белка 49 кДа заметно возрастает. После третьих суток единственным мажорным компонентом экскрета становится белок 49 кДа. Кроме того, надо отметить, что со временем культивирования в составе антигенов идет увеличение числа белков за счет высокомолекулярных протеинов.
Экскреторно-секреторные продукты личинок трихинелл, полученные культивированием личинок в условиях обычного термостата (с нерегулируемым содержанием углекислоты) анализировали в геле с 12% акриламида и сшивкой 2,6 %.Молекулярные массы белков определяли также программой OneD-Scan. После 24 часов культивирования в составе экскрета определялись 5 белковых полос с молекулярными массами 25, 30, 52, 56 и 60 кДа; после 48 часов культивирования - 7 белковых полос с молекулярными массами 25, 30, 44, 52, 56, 60 и 71 кДа; после 72 часов культивирования обнаружено 8 белковых полос с молекулярными массами 25, ЗО, 44, 52, 56, 60, 71 и 79 кДа (Рис.6). Как видно, наибольшая доля приходится на белки 52, 56 и 60 кДа, причем доля белка с молекулярной массой 52 кДа заметно увеличивается со временем, а доля белков 56 и 60 кДа увеличивается незначительно. Кроме того, также как и в экскреторно-секреторных антигенах, полученных в С02-инкубаторе с увеличением сроков культивирования личинок, в продуктах появляются более высокомолекулярные белки, в данном случае, 71 и 79 кДа.
Иммуногенные свойства выделенных антигенов исследовали методом иммуноблотинга с использованием гипериммунных кроличьих сывороток. В составе фракций 10-14, полученных разделением полного соматического экстракта на колонке Сефадекс G-100, иммуноблот выявил 7 иммуногенных полос, соответствующих белковым полосам с молекулярными массами 93, 71, 60, 57, 53, 49 и 38 кДа (Рис. 7). Наиболее иммуногенным белком в составе 10-14 фракции является белок с молекулярной массой 53 кДа, который одинаково хорошо выявляется антителами во всех фракциях. Заметно слабее выявляются белки 57 и 60 кДа, Белок с молекулярной массой 49 кДа, хорошо заметный на электрофореграмме, в иммуноблоте выявляется только в составе 11 фракции, в которой также выявляются практически все имеющиеся белки. Возможно, это объясняется перегрузкой дорожки по белку. Интересно, что на электрофорезе при окрашивании Кумасси белок с молекулярной массой 60 кДа не виден, так же, как и белки с молекулярными массами 71 и 93 кДа, которые также выявляются методом иммуноблотинга в составе 11 фракции. По-видимому, такие результаты определяются достаточно высокой чувствительностью метода иммуноблота.
В составе экскреторно-секреторных продуктов, полученных в условиях ССЬ-инкубатора (10 % С02) после 24 часов инкубирования методом иммуноблотинга было выявлено 3 иммуногенные полосы: интенсивная полоса, соответствующая белку с молекулярной массой 53 кДа, более слабая полоса 49 кДа и минорная полоса в диапазоне 25-30 кДа. После 48 часов культивирования к этим трем полосам прибавились полосы 56 и 72 кДа. После 72 часов культивирования на блоте выявлялись полосы, соответствующие белкам с молекулярными массами 43, 49, 53, 56 и 72 кДа (Рис. 8). На всех трех дорожках наиболее интенсивно выявлялась антителами полоса 53 кДа. Интересно, что соответсвующая белковая полоса на электрофореграмме видна очень слабо и только в составе продуктов, полученных после 48 и 72 часов культивирования. По-видимому, это говорит о высокой иммуногенности белка 53 кДа.
При получении экскреторно-секреторных продуктов личинок трихинелл в условиях термостата с нерегулируемой концентрацией С02, после 24 часов культивирования выявляется интенсивная полоса, соответствующая белку с молекулярной массой 52 кДа, а также довольно слабые полосы 49, 56 и 60 кДа. После 48 часов культивирования антителами распознаются те же самые полосы. После 72 часов культивирования личинок в экскреторно-секреторных продуктах иммуноблот выявлял 5 иммуногеиных полос с молекулярными массами49, 52, 56, 60 и 71 к Да (Рис. 9). На всех дорожках наиболее интенсивно окрашивалась полоса 52 кДа, также достаточно заметными были полосы 56 и 60 кДа. Полоса 49 кДа было минорной и после 72 часов инкубирования сливалась с полосой 52 кДа.
