Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди паразитарных болезней по со
циально-экономической и медико-оиологической значимости особое
меото занимает малярия. «
Несмотря на уопехи глобальной кампании ликвидации малярии, заболеваемость этой инфекцией доотигаег 200 млн.олучаев в год. От малярии ежегодно погибает только в странах Африки около I ыдн. детей t weraedorfer, 1983; Лысенко, 1986). В нашей стране иа-ляриологичрская ситуация также оотаетоя напряженной, главным образом в овязи о завозом малярии из-за рубежа (Духанина и оо-авг., 1979; Лыовнко, Гороунова, 1983; Сопрунов, 1984), появления малярийных паразитов, устойчивых к современным противомалярийным препаратам. Преодоление втих трудностей потребовало усиления фундаментальных исследований в облаоти биологии и культивирования малярийных паразитов. Изучение различных аопектов отношений паразит - хозяин при малярии на клеточном и молекулярном уровнях немыслимо без разработки методов культивирования различных стадий возбудителей (Акиншина, Федянина, 1986). Наибольшие успехи в этом отношении достигнуты в ооласги культивирования эритроци-тарных стадий возбудителя тропической малярии, Plasmodium falciparum ( Trager, Jensen, 1976). Несмотря на воспроизведение метода Trager и Jensen в ряде лабораториях мира, он нуждается в дальнейшем усовершенствовании. Непрерывное культивирование эритроцитарных стадий других видов возбудителей малярии человека не разработано. Советским исследователям удавалось поддерживать разк жение ^falciparum в КуЛьгуре в течение нескольких пассажей (Крайнова и соавт., 1981; Оганесян, 1984), но некоторые изоляты этого паразита пооле длительной транспортировки по неизвеотным причинам погибали. Отсутствие в налей стране непрв-
4. равной культуры P.falciparum затрудняло проведение фундаментальных и прикладных исследований по малярии.
До оих пор оотаетоя неизученным механизм возникновения ерит-роцитарных решдивов и оущеотвования "кризисных" форм малярийных паразитов. Исследования указанных вопросов имеет большое научное и практическое значение. Механизмы криоконоервации оотаетоя недостаточно изученными. Способ криоконоервации, рекомендованный ВОВ, позволяет воего лишь оохранить 35-40 паразитов. В СССР исследования по криоконоервации проводились в аспекте видовых различий и стадийности развития паразита (Рахимов,1986). Поэтому новые теоретические подходы по криогенной консервации о учетом физиологического соогояния плазмодиев крайне необходимы. В атом плане паропективан поиск биохимического критерия жизнеспособности малярийных паразитов после криоконоервации и транспортировки с целы) дальнейшего непрерывного культивирования.
Химиотерапия и химиопрофилактика малярии занимают также важное место в борьбе с малярией. Одной из актуальных проблем, современной маляриологии являетоя предотвращение развития и преодоление ухе возникшей лекаротвенной устойчивости малярийных паразитов, что предусматривает поиск новых типов и классов противомалярийных препаратов и биологически активных веществ.
Культура паразитов i-n vitro может быть успешно использована для получения биомаосы - источника антигенного материала для отработки методов иммунодиагноотичеоких теотов, материала для молекулярной гибридизации ДНК и олигонуклеотидных зондов.
Для медицинской науки эти задача конкретизированы постановлением Щ КШС к Совета министров СССР от 27 ноября 1987 г. "Основные направленая развития охраны здоровья населения и перестройки здравоохранения СССР в двенадцатой пятилетке и на пери-
5. од до 2000 года, а также постановлением Президиума АН СССР, в соответствующих документах Минздрава СССР (июль 1984 г.) и принятом в августе 1985 г. постановлении Щ КГОС и Совета Министров СССР о дальнейшем развитии новых направлений"биологии, медицины и биотехнологии (1986-1990 гг.).
Цель и задачи исследования. Целью исследований были разработка и оптимизация методов культивирования и криоконоарваши эри-троштарных форм возбудителей малярии человека и животных для получения бис.лассы паразитов, изучения биологии паразитов и поиока новых противомалярийных соединений, биологически активных веществ.
Были поставлены следующие задачи:
-
Определить физико-химические факторы, влияющие на развитие возбудителей в системе паразит эритроцит in vitro.
-
Разработать методы стимуляции развития паразитов в процессе культивирования и оптимизации условий культивирования для получения биомассы.
-
Разработать модели парсистенции эритрощгарных отадий
in vitro и выяснить механизмы, способствующие переходу плазмодиев в состояние покоя.
4. In vitro изучить особенности развития паразитов и ооо
гояния покоя в эритроцитах здоровых и гетерозиготных носителей
аномальных типов гемоглобина и энзимопагий.
-
Испытать разработанные культуральныа модели развития различных штаммов возбудителя тропической малярии для предварительного отбора противомалярийных препаратов, биологически активных веществ изучения их влияния на эритроцитарный цикл плазмодиев.
-
Апробировать методы кратковременного культивнроъаиия эритроцигарннх стадий возбудителя трехдневной малярии человека
6.
p.vlvax и малярийных паразигов грызунов P.berghel.
-
Изучить физико-химические факторы, влияющие на жизне-опоообнооть, ияфактивность и сохранность зритропигарных стадий малярийных паразигов при различных режимах замораживания.
-
Определить биологичеокие критерии для оценки шзнводо-ообности паразитов в культуре и отбора кропротекторов.
Научная новизна. Впервые в Советском Союзе разработаны и оптимизированы методы культивирования бесполых форм зритропи-тарных стадий малярийных паразитов. Получена непрерывная культура ХЛОрОХИНЧуВОТВИГеЛЬНЫХ И ХЛОрОХИНуОГОЙЧИВЫХ ШТаММОВ Р'*»1"
oiparua, кратковременная культура P.vivax и возбуди-
теля малярии грызунов P.berghel. Вое вновь подученные культуры плазмодиев были использованы для изучения развития паразитов в эритроцитах здоровых и гетерозиготных носителей аномальных гемоглобинов и энзиыопатий, для биологических биохимических, иммунохвшчеоких, биотехнологических, криобиологических исследований, для предварительного отбора противомалярийных препаратов и биологически активных веществ.
Выявлен ряд физико-хишчеоких и биологичеоких факторов, влияющих на внутриаритроцитарное развитие возбудителя тропической малярии (рН, ооотав, газовые фазы и др.), определены параметры адаптации и стабилизации различных штаммов in vitro.
Впервые в мире описано ооотояяиа покоя на ранних стадиях развития в цикле аритроцитарной шизогонии P.falciparum, что раоцевяваетоя как защитная реакция паразита на неблагоприятные условия. Изучены механизмы возникновения состояния покоя у плазмодиев, разработаны способы его моделирования и определены биохимические показатели (окорость гликолиза, синтеза балка, ДНК, стадийность развитая паразита). Экспериментально доказано ааивд-
7.
ление или прекращение развития p.falciparum о появлением атипичных форм плазмодиев, которое наблюдается при изменении биохимического типа клеток хозяина, а именно в эритроцитах о нъас, нъаэ и бета-талаооемией.
Разработаны и реализованы способы отимуляшш, стабилиза
ции и получения биомаооы P.falciparum о использованием колон
ки-капилляра, сокультивирования p.falciparum 0 клетками пече
ни грызунов M.nataiensis или сокультивирования о клетками
печени мышьй линии balB/c на микроносителях отечественного
производства на основе желатина.
Разработаны физиологические способы синхронизации отадийно-го развития p.faiclparum в культуре.
Оптимизированы макро- и микрометоды определения чувствительности плазмодиев к противомалярийным препаратам и биологичео-ки активным веществам с учетом исходного физиологического ооогоя-ния плазмодиев.
На моделях хлорохинчувствительных и хлорохинуотойчивых штаммов P.falciparum выявлена противомалярийная октивнооть отечественных препаратов и ранее неиспытанных на противомалярийную активность биологически активных веществ.
Впервые осуществлена криоконсервапия плазмодиев с учетом фи-зиологичеокого оостояния бесполых форм эритроцитарных стадий малярийных паразитов и показано, что при этом сохранность плазмодии ев зависит не только от режима охлаждения и огадийности плазмодиев, но также от их физиологического состояния.
Впервые в криобиологии рекомендовано применять измерение скорости гликолиза в малярийных паразитах в качестве биохякичвс-кого критерия для выбора криопротокторов, опенки жизнеспособности плазмодиев в процессе культивирования и после размораживания.
8.
Теоретическая значимость работы заключается в установлений ооо-тояния покоя в пикла эритроцитарной шизогонии p.falciparum, обеспечивающее длительное сохранение жизнаопособнооти плазмодиев в еритроцитах. Обнаружена их устойчивость к противомалярийным препаратам и действию криогенных факторов, что расширяет современные представления о биологии возбудителей малярии человека и имеет большое практическое значение для культивирования, криобиологии, диагностики, эпидемиологии и химиотерапии.
Практическая значимость результатов. Полученные сведения по разработке и оптимизации методов культивирования и криокон-оврвации эритроцитарных стадий малярийных паразитов человека и яивотных явились основой создания моделей непрерывного развития возбудителя тропичеокой малярии p. falciparum в сиогема паразит-эритроцит и создания экопзримзнтальной базы для накопления биомаооы возбудителя с целью изучения биологии, биохимии, ЦИТОХИМИИ паразитов, получения антигенного материала, предварительного отбора противомалярийных препаратов и биологически активных веществ, криобиологических исследований, изучения внутриклеточного развития плазмодиев в мутантних эритроцитах.
Открытие ооогояяия покоя в эритроцитарной шизогонии малярийных паразигов имеет важное практическое значение для эпидемиологии, химиотерапии, криоконсервавди, транспортировки и выделения штаммов от больного, а также при поддержании непрерывной культуры эритроцитарных стадий малярийных паразитов.
Установление ряда физико-хишчвоких факторов позволило на жх оонове разработать и усовершенствовать опоообы культивирования в транспортировки малярийных паразитов. Б атом отношении имеет также большое значение предложенное нами полуавтоматическое устройство, которое позволяет предварительно оценивать при-
9.
'годнооть эритроцитов к заражении и одновременно поддерживать культуры в нескольких камерах. Предложенный опоооб уменьшает угрозу потери культуры, позволяет значительно экономить рабочее время и питательные среды. Разработаны различные^ опоообы отиму-ляпии развития паразитов: пропускание культуры через колонку-капилляр, сокулыивирование p.falciparum о клетками печени крыс M.nataiensis, применение культуры гепатоцитов на микроносителях, что позволяет стабилизировать непрерывное поддержа-ние культуры P.falciparum, увеличить выход биомасоы. Рекомендованный способ проверки целостности мембранных фильтров, позволил отказатьоя от закупки зарубежных доргоогоящих устройств. Установлена пригодность отечественной питательной ореды rpmi-1640 для культивирования малярийных паразитов, в итоге получена возможность вести культуры целиком на отечественных средах и оборудовании, что открывает пути широкого практического использования непрерывной культуры плазмодиев в СССР. Доказана принципиальная возможность внедрения моделей плазмодиев для окрининга противомалярийных препаратов и биологически активных веществ в относительно короткие ороки.
Использование культуры для предварительного отбора противомалярийных препаратов и биологически вктивных веществ позволили, впервые выявить противомалярийную вктивносгь отечественных питоА отатиков - рубомипина, брунеомивдна, фторафура, фторурапида и препарата растительного происхождения - артемизинина, а также биологически активных веществ: антител к csp- пептиду, ангятвд к эритроштарной стадии плазмодиев и моноклональных антител против белков эритроцитов.
Исследование по криоконсервапии малярийных паразитов также имеет большое практическое значение. В результате проведения яа-
10.
правленного скрининга криопрогекторов (интра-, экограцеллвляр-ного и смешанного механизмов действия), одноступенчатого и программного замораживания плазмодиев о учегом их $изиологичаокого оооюяния были предложены оптимальные, экономически более выгодные варианты криоконсервации плазмодиев.
Измерение окорооги гликолиза в малярийных паразитах как биохимического критерия позволяет быстро выбирать криопротекто-ры на основе их дейогвия на метаболизм плазмодиев и определить жизнаспоообнооть плазмодиев в процеоое культивирования.
Положения, выносимые на защиту
Оптимизация методов непрерывного культивирования может быть обеспечена за счет стабилизации различных штаммов плазмодиев и параметров их адаптации, применения омашанной кулыуральной орвды, газовой смеои определенного состава и оовобовдения от нежизнеспособных эритроцитов.
Стимуляция развития паразитов в культуре достигается путем оокультивирования с клетками печени грызунов, что расширяет возможность исследования взаимоотношений малярийных паразитов и клеток печени.
Возможность p.falciparum в ходе зритроцитарной шизогонии In vitro ПервХОДИТЬ В ОООТОЯНИв ПОКОЯ без ПОТерИ ЖИ8-
неопоообнооти, что обусловливает потенциальную опаонооть изменения вирулентнооти и антигенных овойотв штамма, его чувотштель-нооти к лекарственным препаратам.
Апробация работы. Ооновные положения диооертации доложены на заседании Московского отделения БОПР (14 ноября 1985)( на заседании Ученого совета ИМИ в ТЫ им. С.М.Кирова (1985, 1966) и Шюгнтуга епидемиодогаи, гигиены и профзаболеваний КЗ Азерб.СОР Ш80); Боеооюзном оьезде протозоологов (Ленинград, 1987); на
ІІ.
' международном оемияаре ло малярии и лейшаниоэу Мооява,1987); на оовмаотном межлабораторном оовещании ИШ и ТМ им. В.И.Мар-циновского и Института биоорганичвокой химии им. М.М.Шемякина (Москва, І9ИЗ); на симпозиуме "Структура, биооивгев и функции молекулярных элементов иммунной сиотамын (2-4 июля 1987 г., ц.Пущино), на конференции молодых ученых социалистических отран по биоорганичвокой химии 21-28 августа I9S8 г., на коллоквиумах лаборагории молекулярной биологии паразитов ИМЛ и ТМ им.Б.И.Ыар-циновокого.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 24 работы.
Объем и структура работы. Диооертация изложена на
страницах машинопиои, состоит из введения, обзора литературы я
6 глав собственных исследований, указателя литературы и прило
жения. Работа иллюотрирована 23 таблицами и 52 риоунками.
Библиографический указатель содержит отечественных и
