Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 10
1.1 Определение и сущность лейкоза крупного рогатого скота 10
1.1.1. Определение лейкоза» этиология и пути передачи вируса лейкоза 10
1.1.2 Стадии течения лейкоза крупного рогатого скота 13
1.1.3 Патологоанатомические изменения при лейкозе крупного рогатого скота 15
1.1.4 Распространенность лейкоза крупного рогатого скота в Российской Федерации 16
1.1.5 Реакция иммунодиффузии и полимеразная цепная реакция в диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота 18
1.2 Генетическая обусловленность устойчивости и восприимчивости крупного рогатого скота к заболеванию лейкозом 20
1.3 Главный комплекс гистосовместимостн крупного рогатого скота 27
1.4 Главный комплекс гистосовместимостн и болезни 32
1.5 Методы изучения главного комплекса гистосовместимостн 39
2 Собственные исследования 49
2.1 Материалы и методы исследования 49
2.2 Результаты собственных исследований 54
2.2.1 Распределение частот аллелей гена BoLA-DRB3 в исследуемых популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой породы 54
2.2.2. Распределение частот аллелей гена BoLA-DRB3 в популяции крупного рогатого скота симментальской породы 64
2.2.3 Изучение ассоциаций аллелей гена BoLA-DRB3 с риском развития лейкоза у крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород 69
2.2.4 Распределение частот генотипов и ассоциаций с восприимчивостью к лейкозу в изученных популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород 72
2.2.5 Экономическая эффективность результатов исследований 80
3 Обсуждение результатов исследований 81
Выводы 87
Практические предложения 90
Библиографический список 91
Приложение 118
- Реакция иммунодиффузии и полимеразная цепная реакция в диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота
- Главный комплекс гистосовместимостн крупного рогатого скота
- Распределение частот аллелей гена BoLA-DRB3 в исследуемых популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой породы
- Распределение частот генотипов и ассоциаций с восприимчивостью к лейкозу в изученных популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород
Введение к работе
Актуальность темы. Многочисленные публикации и данные официальной ветеринарной статистики свидетельствуют о том, что среди инфекционных болезней крупного рогатого скота лейкоз по тяжести поражения органов, тканей, массовости проявления и экономическим последствиям занимает ведущее место. Заболевание наносит значительный экономический ущерб животноводству страны вследствие гибели и вынужденной выбраковки высокопродуктивных племенных животных, утилизации туш и органов с опухолевыми изменениями, расходов, связанных с ограничительными мероприятиями. Заболеваемость лейкозом крупного рогатого скота - одна из наиболее важных проблем не только ветеринарной медицины, животноводства, но и биологии, экологии в целом, имеющая непосредственное отношение к безопасности здоровья человека, так как ВЛКРС имеет близкое морфологическое и эволюционное родство с вирусом Т-клеточного лейкоза человека. Несомненно, одной из важнейших проблем онкологии и лейкозологии является возможная связь между заболеваемостью лейкозами и опухолями животных и человека. Большой интерес представляют проблемы потенциальной опасности для человека продуктов питания от животных из стад, неблагополучных по лейкозу, влияния вредных метаболитов, накапливающихся в организме больных коров, на организм человека, а также использования животных для получения биопрепаратов. Имеются данные об экспериментальном заражении обезьян бычьим лейкозом (FLM.McClure, 1974). В связи с этим актуальным является проблема диагностики лейкоза на ранних стадиях заболевания. С помощью применяемых в настоящее время серологических методов диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота полностью искоренить заболевание невозможно. Поэтому особую значимость для точной диагностики вируса представляют методы молекулярной биологии, в частности, полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая зарекомендовала себя как надежный, специ-
5 фичный, достоверный и чувствительный тест для раннего выявления инфицированных ВЛКРС животных.
* Для борьбы с лейкозной инфекцией и лейкозом в нашей стране в раз
ные годы были разработаны и использованы в ветеринарной практике Ин
струкции о мероприятиях по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота,
утвержденные Главным управлением ветеринарии МСХ СССР в 1969, 1970,
1975, 1984 и 1989 годах, В 1999 году утверждены Правила по профилактике
и борьбе с лейкозом крупного рогатого скота, в которых определены:
а) Сведения о лейкозе,
б) Требования по профилактике лейкоза крупного рогатого скота.
в) Эпизоотический контроль и постановка диагноза на лейкоз.
г) Ограничительные мероприятия в пунктах, неблагополучных по
лейкозу.
д) Оздоровительные мероприятия в неблагополучных по лейкозу жи-
Ч вотноводческих хозяйствах.
е) Оздоровительные мероприятия в племенных хозяйствах,
ж) Требования к транспортировке, приему, предубойному содержа
нию и переработке больных лейкозом и инфицированных вирусом
лейкоза животных.
Подобные Инструкции и программы борьбы с лейкозом крупного рогатого скота разработаны и реализованы практически во всех странах мира, что свидетельствует о том, что проблема лейкоза крупного рогатого скота признана актуальной в мировом масштабе, для решения которой необходим комплекс эффективных мероприятий.
Наряду с ветеринарными мероприятиями, для борьбы с лейкозами разрабатываются селекционно-генетические методы с целью получения здорово-
го, резистентного к лейкозу крупного рогатого скота потомства. Работы мно
гих ученых посвящены изучению механизмов генетической устойчивости жи-
6 вотных к лейкозу (В.М. Нахмансон, 1973, 1986, 1997; Л.К.Эрнст и соавт., 1979; О.КГаврилов, ВЛХШишков, 1983; А.ГЛІезавитин, 1992, 1995 и др.).
Многие годы основу селекции сельскохозяйственных животных составляла, и продолжает оставаться актуальной, оценка генотипов животных по частоте заболеваемости особей, связанных родством и инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота.
Результатами многолетних исследований установлено, что инфицированные животные не всегда болеют лейкозом: частота заболеваемости в значительной степени зависит от генотипа. Данное обстоятельство подтверждает правомочность вирусоиммуногенетической теории этиопатогенс-за гемобластозов, выдвинутой В.П.Шишковым в 1979 году, заключающейся в том, что клиническому и патоморфологическому проявлению болезни способствуют генетическая предрасположенность и иммунологическая недостаточность организма.
Исходя из изложенного, становится очевидной необходимость комплексного подхода в разработке эффективной системы борьбы с лейкозом крупного рогатого скота. Здесь особое значение приобретают методы молекулярной генетики, особенно методы изучения генов главного комплекса гистосовместимости, участвующих в регуляции иммунного ответа организма, в частности, в осуществлении клеточного взаимодействия при трансплантации органов и тканей, а также связанных с развитием многих заболеваний, в первую очередь аутоиммунных, онкологических, инфекционных (Г-Е.Сулимова и др.,1995).
В связи с этим, важным направлением в плане разработки селекционно-генетических подходов к оздоровлению животных от лейкозов является изучение ассоциативных связей между определенными аллелями гена класса II главного комплекса гистосовместимости крупного рогатого скота (BoLA-DRB3) с восприимчивостью и устойчивостью к лейкозам.
7 Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение полиморфизма гена класса II главного комплекса гистосовместимости крупного рогатого скота (BoLA-DRB3) в связи с устойчивостью и восприимчивостью к лейкозу крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород в условиях Республики Башкортостан- Эта цель была достигнута через решение следующих задач:
сформировать банк ДНК изучаемых популяций крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород;
исследовать ДНК-полиморфизм гена BoLA-DRB3 у крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород с различным уровнем инфицированности вирусом лейкоза крупного рогатого скота;
провести анализ распределения частот аллелей и генотипов в группах вирусоноситслей и здоровых животных;
оценить генетическую структуру изучаемых популяций по восприимчивости и устойчивости к лейкозу;
разработать научно-обоснованные рекомендации по ранней оценке уровня устойчивости и восприимчивости ремонтного молодняка крупного рогатого скота к лейкозу и повышению генетической детерминированности устойчивости племенных стад к заболеванию.
определить экономическую эффективность анализа ДНК - по
лиморфизма при профилактике лейкоза крупного рогатого скота.
Научная новизна. Полученные данные представляют интерес для пони
мания молекулярно-генетических механизмов формирования устойчивости и
восприимчивости к лейкозу, а также позволяют предложить новые направления
в разработке подходов для оценки групп риска заболеваемости лейкозом.
Впервые в условиях Республики Башкортостан с использованием современных молекулярно-генетических методов изучен ДНК-полиморфизм гена класса II главного комплекса гистосовместимости крупного рогатого
8 скота (BoLA-DRB3) у племенного крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород. Создан банк ДНК популяций данных пород объемом 300 проб как база для дальнейших исследований в области популя-ционной генетики. Впервые определён относительный риск заболеваемости лейкозом разных генотипов. Проанализирована генетическая структура стад трех племенных хозяйств с установлением в них доли животных, несущих устойчивые и чувствительные к лейкозу генотипы. Подтверждена роль уровня гетерозиготности как неспецифического фактора устойчивости к лейкозу. Предложена и обоснована экономическая эффективность повышения уровня генетической детерминированности устойчивости стад к лейкозу на основе раннего отбора племенного молодняка при помощи ПЦР - тестирования на восприимчивость к заболеванию.
Практическая ценность. На основе изучения полиморфизма гена BoLA DRB3 крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород, генетической структуры популяций, частоты аллелей, ответственных за устойчивость и чувствительность к лейкозу, подтверждена генетическая детерминированность предрасположенности к заболеванию и предложен метод отбора молодняка на основе ПЦР - тестирования на первом месяце жизни. Ранний отбор и использование для ремонта стад устойчивого к заболеванию молодняка одновременно обеспечивает сокращение непроизводительных затрат по выращиванию на племенные цели особей с высоким риском развития лейкоза и повышение уровня резистентности за счет наследственного закрепления признака.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на двух международных научно-практических конференциях: «Пути повышения эффективности АПК в условиях вступления России в ВТО» (г.Уфа, 2003) и «Проблемы и пути интенсификации племенной работы в отраслях животноводства» (г.Уфа, 2004); на республиканских научно-практических конференциях молодых ученых и аспирантов (г.Уфа, 2003, 2004); на ПО0'1 научно-практической конференции преподавателей, сотрудников и аспи-
9 рантов университета «Достижения аграрной науки - производству» (г,Уфа, 2004).
Публикация результатов исследований. Основные результаты исследований опубликованы в 6 научных статьях.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, предложений производству, библиографического списка. Она изложена на 120 страницах компьютерного текста, включает 10 таблиц, 13 рисунков. Библиографический список включает 226 наименований, в том числе 90 - иностранных авторов.
Основные положения^ выносимые на защиту:
Генетический полиморфизм гена BoLA - DRB3 у здоровых и инфицированных вирусом лейкоза племенных животных черно-пестрой и симментальской пород.
Ассоциативная связь выявленных ранее молекулярпо-генетичеекпх маркеров предрасположенности и устойчивости с заболеваемостью лейкозом крупного рогатого скота.
Породные особенности аллслофонда по уровню распространения аллелей, ответственных за устойчивость и чувствительность к лейкозу.
Гетерозиготность как неспецифический фактор устойчивости к лейкозу-
Раннее прогнозирование восприимчивости к лейкозу методом типи-рования аллелей и генотипов и его использование для повышения резистентности племенного поголовья к заболеванию.
Исследования проводились в рамках ГНТП РБ но программе №11 «Научное обеспечение устойчивого развития агропромышленного комплекса РЬ, утвержденной Постановлением Кабинета Министров РБ № 285 от 26 сентября 2002 г.
Реакция иммунодиффузии и полимеразная цепная реакция в диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота
Для диагностики вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) в нашей стране с 1985 года используется реакция иммунодиффузии в агаровом геле с гликопротеидным антигеном ВЛКРС (РИД), которая считается сравнительно падежным и доступным диагностическим серологическим методом (В.П.Шишков и соавт., 1986; В.М.Нахмансон и соавт,, 1983, 1997; Н.И.Петров, 1997; М.И.Гулюкин и соавт., 1999, 2000; Ю.П.Смирнов, 1999; Н.С.Мандыгра, 2000). С использованием серологической диагностики разработаны методы оздоровления неблагополучных по лейкозу популяции крупного рогатого скота, основанные на выявлении инфицированных животных в стаде, выращивании здорового молодняка и постепенном вытеснении инфицированных коров здоровыми нетелями (Л.Л.Гусев и соавт., 3987; И.М.Донник, 1995; И.С.Мандыгра, 1995; Ю.П.Смирнов, 1995; В.А.Крикун, 2002). Однако в процессе оздоровления хозяйств от лейкоза с использованием реакции иммунодиффузии в некоторых случаях возникают трудности, связанные: с низкой чувствительностью РИД, с так называемым выпадением реакции, с невозможностью ее использования для телят возраста менее 5...6 месяцев, с явлением иммунной толерантности, когда наблюдают вирусоносительство без антителообразования (Ю.Смирнов, 1999; В.А.Крикун, 2002).
Многие авторы рекомендуют метод прямого обнаружения пропируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью молекулярно-гснетического анализа на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая зарекомендовала себя как надежный, специфичный, достоверный и чувствительный тест для раннего выявления инфицированных ВЛКРС животных. С помощью ПЦР удается обнаруживать даже деградированную ДНК или РНК, оставшуюся после разрушения вирусных частиц, присутствующую в следовых количествах. Установлено, что около 16% молодняка крупного рогатого скота, имеющего отрицательные показатели в РИД, содержат в геномной ДНК провирус ВЛКРС, который может быть выявлен только при помощи ПЦР. Полимеразную цепную реакцию можно с успехом использовать для определения источника инфекции в стадах, при племенной продаже, профилактике, для выявления случаев скрытого вирусоносительства и на заключительных этапах искоренения ретровирусной инфекции (Г.В.Климова, 1995; Р.В-Облап и соавт., 1996; Н.В.Кузнецова и соавт., 1997; Н.И.Петров, 1997; Л.Б.Прохватилова и соавт., 1997; Л.А.Калашникова и соавт., 1999; А.Н.Панин, 1999; БХ.Орляпкип и соавт., 2000; Л.Б.Прохватилова и соавт., 2001; В.В.Дрыгин, 2002; J.Kuzmak et. al., 1999).
В работах многих исследователей в области генетики и селекции уде лено особое внимание изучению наследственной устойчивости животных к различным заболеваниям и поиску генетических маркеров резистентности (В.М.Нахмансон, 1972; Л.К.Эрнст и соавт., 1979; Д,В.Карликов, 1984; В.М.Апатенко, 1992; Э.К.Бороздин, 1992; Н.С.Уфимцсва, Е.В.Терентьева, 1992; Н.И.Коростелева, 1996; В.П.Петухов и соавт., 1996; Г.Н.Сердюк и со авт., 1996; Н.Н.Кочнев и соавт., 1998, 2001), Наследственные аспекты при лейкозе крупного рогатого скота давно привлекают ученых-лейкозологов, которыми накоплены данные, подтверждающие влияние генетических и иммунобиологических факторов на возникновение и распространение лейкоза, разработаны методы оценки животных по устойчивости к данному заболеванию (А.И.Васюков, 1979; ТлМ.Вилль, 1980; И.Н.Никитченко, 1983; Н.М.Костомахин, 1987; А.С.Шинкаренко, 1987). Установлено, что инфици рование животного еще не равнозначно развитию лейкоза. Более того, оп ределенная часть животных, несмотря на развитие инфекционного процес са, в течение длительного времени, а иногда и всей жизни, остается клини чески здоровой, сохраняет свою продуктивность. Таким образом, инфици рованность животных вирусом лейкоза не связана с генетическими факторами и при определенных условиях все животные могут быть инфицированы вирусом, а частота заболевания лейкозом в значительной степени зависит от генотипа животных и иммунобиологического состояния организма (А.М.Лактионов, В.М.Нахмансон, 1972; В.М.Нахмансон, 1972, 1973, 1986; Л.Г.Бурба, 1979; А.И.Васюков, 1979; Т.М.Вилль и соавт,, 1980; Р.А.Кукайн, 1983; В.П.Шишков, 1983; Л.К.Эрнст, В.П.Шишков, 1984; Э.К,Бороздин, 1985; В.Л.Петухов и соавт., 1988; А.ГНезавитин, 1995). По результатам серологических, клинико-гематологических, патолого-анатомических и гистологических исследований крупного рогатого скота установлены определенные особенности распространения лейкоза среди разных пород крупного рогатого скота. Следует отметить, что породная принадлежность крупного рогатого скота не всегда влияет на частоту инфи-цированности животных вирусом лейкоза крупного рогатого скота. В то время как частоту заболевания животных лейкозом, подавляющее число авторов связывают с породной принадлежностью скота. При анализе заболеваемости лейкозом Д.В. Карликов с соавторами (1978) выявили, что в группах коров-дочерей от быков красной датской породы заболеваемость лейкозом была выше, чем в потомстве от быков бурой латвийской породы. Анализ заболеваемости пород, проведенный В.М.Нахмансоном (1986) показал, что гематологическое распространение лейкоза отмечается главным образом среди красных (бурая, латвийская, красная эстонская, красная литовская, красная степная, красная датская) и черно-пестрых пород круп ного рогатого скота. Среди пород скота швидкого происхождения (бурая карпатская, костромская, Лебединская, алатауская, бурая кавказская) лейкоз встречается редко, Клинико-гематологическое проявление лейкоза среди животных симментальской породы носит зональный характер. Вместе с тем удается диагностировать лейкоз у помесных животных, полученных путем скрещивания коров литовской пород с быками швицкой породы.
Главный комплекс гистосовместимостн крупного рогатого скота
В последние годы исследователями в области генетики и селекции в тесном контакте с иммунологами изучается степень генетической детерминированности основных компонентов, обусловливающих возникновение различных болезней, в том числе и лейкоза крупного рогатого скота. Особенно актуальными являются исследования роли главного комплекса гистосовместимости. В настоящее время накоплены многочисленные данные, свидетельствующие о том, что антигены гистосовместимости несут генетическую информацию о степени чувствительности организма к этиологическим факторам патологий, свойственных популяции. Положительные связи распространяются не только на сам факт восприимчивости к патологическому процессу, но и на особенности патогенеза, (W.F.Bodmer, 198 і; s D.H.Sachs et. al., 1981; В.П.Шабалин, Л.Д.Серова, 1988).
Главный комплекс гистосовместимости (ГКГ - МНС - Major Histocompatibility Complex) обнаружен у различных видов позвоночных и наиболее хорошо изучен у мыши (Н-2) и человека (HLA) (А.Р.Слепченко, 1994; И.Г.Удина, 1994), В настоящее время интенсивно идут исследования ГКГ у различных видов животных, в том числе у домашних видов: кур (G.Kroemer r et, al., 1990; R.Zoorob et- al., 1991), лошадей (J.A.Alexander et- ah, 1987), овец (P.S.Scott et, alM 1991; E.V.Deverson et aL, 1991), крупного рогатого скота (I Joosten et. al.,1990, 1991), коз (P.U.Cameron et. ah, 1990), собак (U.M.Sarmiento el. ah, 1990), кошек (Ch.Winkler et. al., 1989), свиней (F.Hirsch et. al., 1990) и у других.
Первоначально ГКГ изучали на уровне антигенов, используя серологи-ческие методы. В настоящее время структуру генов Главного комплекса гистосовместимости исследуют с привлечением различных молекулярно-генетических методов: гибридизации in situ, клонирования, рестрикционпо-го анализа, секвснирования ДНК и других методов (M.Cohn, R.T.Epstein, 1986; H.AXewin et al., 1988).
Продукты ГКГ идентифицировали по их способности вызывать оттор жение трансплантата, но они выполняют в организме и другие биологически важные функции. Гены ГКГ служат в роли поверхностных клеточных маркеров, распознаваемых цитотоксическими Т- лимфоцитами и Т- хелпе-рами в комплексе антигенов, а также вовлечены в процессы дифференци-ровки у эмбриона и в плаценте (R.W.BuII et al., 1989).
Существование ГКГ у крупного рогатого скота (BoLA- Bovine leukocyte antigen) было доказано работами ряда авторов (R.L.Spooncr ct al., 1978; J.Caldwell et al., 1979; B.Amorena, W.H.Stone, 1980). Так же как и ГКГ у дру 29 гих видов, система BoLA подразделяется на гены классов I, II, III и локализована на коротком плече 23 хромосомы. Это было установлено методом гибридизации in situ при использовании клонов ДНК класса I свиней (R.Fries et ah, 1988), Композиция BoLA- системы представлена двумя типами антигенов: I- серологически определяемые, II- определяемые в реакции смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ) и ПЦР-ПДРФ.
К 1978 году было накоплено достаточно серологических и генетических данных, что позволило установить существование серологически определяемого локуса (SD- serologically determined) у крупного рогатого скота, что было доложено на первом Международном Рабочем Совещании в Эдинбурге. На втором Совещании было установлено 17 специфичностен, на третьем- 30, на котором также было показано, что серологически определяемые антигены относятся к классу I. Продукты генов класса І ГКГ представляют собой трансплантационные антигены, локализованные на поверх-ности всех соматических клеток, за исключением клеток миокарда її нескольких типов клеток слюнных желез» В гепатоцитах антигены класса I синтезируются слабо либо не синтезируются совсем.
Антигены класса I ГКГ состоят из двух нековалентно связанных единиц: интегрального мембранного гликопротеида (тяжелой субъединицы) с молекулярным весом в 45 kD и микроглобулина. Только тяжелая субъеди ница кодируется ГКГ, в то время как ген микроглобулина кодируется на другой хромосоме. Так называемые неклассические гены класса I кодируют ряд антигенов, гомологичных по структуре трансплантационным антигенам. Неклассические антигены значительно менее изучены в связи с ограниченным распространением в тканях, а также с тем, что их синтез происходит лишь па определенных стадиях развития организма. Биологическая роль их состоит в опознавании чужеродных антигенов и представлении их Т киллерам (E.M.Halleman et. al,, 1988). Гены, определяющие антигены класса, кодированы мембранными гликопротеидами, содержащими одну полипептидную цепь с двумя карбогидратными боковыми цепями. В 1990 году было установлено 43 SD- факторов класса I BoLA- системы, а в 1992 году было показано 50специфичностей (D.Bernoco, 1991; C.J-Davies et а!., 1992).
Реагенты или гипирующие сыворотки для идентификации антигенов класса I были получены разными методами. Прежде всего, от многотельных коров. Исследователями показано, что у 14-15% коров, начиная с 15-месячного возраста, наблюдается образование цитотоксических антител. При этом слабые антитела обнаруживают за 10 дней до отела, но уже через 4-12 дней их титр повышается в пределах от 1:16 до 1:64 (D.R.McGary, W.H.Stone, 1970; LCaldwcll ct ah, 1977)- Также известны другие способы получения антилимфоцитарных сывороток крупного рогатого скота: внут-рикожное введение суспензии лейкоцитов и имплантация кожи (R.L.Spooner et ah, 1978; B.Amorena, W.H. Stone, 1980), Основное преимущество метода трансплантации кожных лоскутов заключается в получении более сильного иммунного ответа антител, направленных к антигенам главного комплекса гистосовместимости.
Исследования антигенов класса II были начаты в 1966 году (W.Usinger et ah, 1977), В экспериментах этих авторов было установлено, что дизигот-ные химеры- близнецы у крупного рогатого скота стимулируют друг друга и являются толерантными по приживлению кожных лоскутов.
Антигены класса II преимущественно экспрессируются на поверхности иммунных клеток: В - лимфоцитов, субпопуляций Т- клеток и макрофагов (R.N. Germain et al., 1985; R.C.Giles, LD.Capra, 1985). Это гликоли-зированные трансмембранные полипептиды, состоящие из тяжелой альфа-цепи, нековалентно связанной с меньшей бета - цепью. Гены класса II ГКГ иначе называют генами иммунного ответа и служат сигналом для узнавания чужеродных антигенов Т-хелперами. Генетический полиморфизм її молекулярное строение BoLA- антигенов класса II является предметом ин тенсивного изучения многими учеными (Г.Е.Сулимова и дрм 1990; S.Sigurdardettir, L.Anderssen, 1988; L.G.Teodore et al., 1988), Показано, что у крупного рогатого скота присутствуют DQ- и DR- регионы, сходные с таковыми у человека- В классе II главного комплекса гистосовместимости крупного рогатого скота установлено существование тесно сцепленных локусов DQa , DQt3 DRp и неравновесное сцепление между DR- и DQ- ге нами. Сцепление между классами I и II было доказано на 6 семьях крупно щ го рогатого скота, исследованных индивидуально по SD- локусу (класс I) и попарно по D- локусу (класс II), Обнаружено 13 пар серологически идентичных сибсов, являющихся ареактивными в смешивании культур лимфоцитов (W.Usinger et al., 1977).
Распределение частот аллелей гена BoLA-DRB3 в исследуемых популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой породы
Объектами исследования явились 100 коров черно-пестрой и 100 -симментальской породы, принадлежавшие ФГУП СПО «Стерлитамакский совхоз-техникум», 100 коров черно-пестрой породы из ККХ «Заря» Стерли-тамакского района Республики Башкортостан, В выборку включали коров в возрасте 5-7 лет, так как к этому возрасту происходит развитие персистент-ного лимфоцитоза у инфицированных животных. На основе серологического исследования (РИД в геле агара) популяции черно-пестрого и симментальского скота подразделили на две группы; здоровые и вирусоносители.
В хозяйствах Стерлитамакского района сосредоточен ценный племенной генофонд крупного рогатого скота, который представлен черно-пестрой и симментальской породами. Проведенные серологические исследования показали, что в районе сложилась сложная эпизоотическая ситуация по лейкозпой инфекции. По результатам серологических исследований в 2003 году на мо-лочно-товарных фермах, выявлено 944 головы крупного рогатого скота (81%), пораженных лейкозной инфекцией. Среди симментальского скота выявлено вирусоносителей - 68,6% и черпо-пестрого скота - 85,2%. В ККХ «Заря», которое является племенным хозяйством по черно-пестрой породе крупного рогатого скота, процент инфицированных животных составил 41,2.
В данных хозяйствах лейкоз крупного рогатого скота впервые официально зарегистрирован в 1970 году, неблагополучие установили в 1974 году. Появление болезни в изучаемых хозяйствах связывают с завозом племенного скота черно-пестрой породы из Калининградской, Ленинградской областей и Белоруссии, симментальской породы из Вологодской области - в ФГУП СПО «Стерлитамакский совхоз-техникум», черно-пестрого скота из Западной Украины - в ККХ «Заря». Клинически выраженных случаев в хозяйствах не отмечали.
Кровь для исследований брали но общепринятой методике. После фиксации животных прокалывали левую яремную вену и собирали венозную кровь в количестве 10 мл в пробирки с антикоагулянтом, в качестве которого применяли стерильный раствор «Глюгицир» в соотношении препарата и крови 1:4, Транспортировка и хранение стабилизированной крови осуществлялось при температуре -18...-20 С. ДНК выделяли из лейкоцитов крови по стандартной методике с использованием протеиназы К, фенол-хлороформенной очистки с последующим осаждением этанолом (В.Н.Горбунова, 1999).
На первом этапе выделения ДНК 8 мл крови смешивали с 30 мл холодного лизирующего буфера (в его состав входят «Тритон Х-100», MgClj, сахароза и tris НС1 с рН=7,6), производили быстрый лизис клеток. Путем мягкого центрифугирования в течение 20 мин (4000 об/мин) осаждали ядра клеток на дно пробирки и сливали надосадочную жидкость. Добавляли 10 мл холодного лизирующего буфера, перемешивали с осадком и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин. Вновь осторожно сливали супернатант и ре-суспензировали ядерный осадок в 400 мкл буфера для протеиназы К (Soline EDTA). Затем переносили осадок с Soline EDTA в эппендорф на 1,5 мл, добавляли 30 мкл 10% SDS и 20 мкл протеиназы К. Для лучшего процесса про-теолиза эппендорф со смесью осажденных элементов крови и буфера с про-теиназой К помещали в термостат при 37С на 12 часов.
Экстрагирование и удаление из раствора фрагментов белков, углеводов, липидов производили с помощью фенольной, фенол-хлороформной, а затем хлороформной очистки. Для этого добавляли 500 мкл забуференного фенола, перемешивали и центрифугировали при 6000 об/мин, в течение 10 минут, Супернатант переносили в другой эппендорф, добавляли 250 мкл забуференного фенола и 250 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта. Переме 51 шивали в течение 10 минут до однородной массы и центрифугировали при 6000 об/мин — 10 минут. Затем супернатант переносили в другой эппендорф, добавляли 500 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта, перемешивали и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 5 минут. При необходимости процедуру очистки повторяли, так как для успешного использования и хранения ДНК белки должны быть полностью удалены. В дальнейшем супернатант переносили в новый эппендорф, добавляли последовательно 40 мкл З М ацетата Na и 800 мкл охлажденного 96% этанола и перемешивали.
В растворе, содержащем 96% спирт, ДНК выпадает в осадок в виде аморфного образования. В таком состоянии ДНК может длительно храниться при минусовых температурах- При необходимости использования образца ДНК её осаждают с помощью высокоскоростного центрифугирования, сливают спирт, сушат и растворяют в буферном растворе. Реактивы для полимеразной цепной реакции и рестрикционного анализа были получены из фирмы «СибЭнзим», г, Новосибирск- Олигонуклео-тидные праймеры HL030 (S -ATCCTCTCTCTGCAGCACATTTCC-S1) и HL032 (5 CGCCGCTGCACAGTGAAACTCTC-3 ) были синтезированы в ЗАО «Синтол», г. Москва, Полимеразную цепную реакцию проводили в апмлификаторе ТП4-ПЦР-01-«Терцик» (Россия). Полимеразную цепную реакцию проводили по методике Г.Е.Сулимопой (2002) в один этап в следующем режиме: денатурация - 0,8 мин при 94С, отжиг - 0,8 мин при 68С, синтез — 0?8 мин при 72С, всего 30 циклов. Смесь для ПЦР содержала по 1 мкл препарата ДНК, по 1 мкл каждого праймера (HL030 и HL032), 2,5 мкл 10х буфера для амплификации, 18,5 мкл дистиллированной воды, 1 мкл суммарного dNTP и 1 мкл Taq-полимеразы под слоем вазелинового масла, Рестрикционный анализ амплифицированных ДНК проводили эндоиук-леазами Rsa 1,Нае III и Xho II. Для рестрикции отбирали 8,5 мкл амплифи-ката, добавляли 2,5 мкл смеси одной из эндонуклеаз с буфером. Реакционную смесь инкубировали при 37С в течение 16 часов. В качестве маркера молекулярных масс использовали ДНК плазмид pUC19 или pBR322, обработанных рестриктазой Mspl. Продукты рестрикции разделяли электрофоретически в 7,5% полиакри-ламидном геле и тестировали в ультрафиолетовом свете после прокрашивания бромистым этидием. Присутствие того или иного аллсля гена DRB 3 определяли по наличию или отсутствию сайтов рестрикции (Т.Е. Сулимова и соавт., 2002; MJXVan Eijk et. ah, 1992). Изображения гелей фиксировали с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» и прилагаемого к ней программного обеспечения «Cel-Imager» и «Gel-Analysis» в версии 1.0. Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием программного обеспечения MS Excel 2000 (Microsoft) и компьютерной программы RxC (Rows х Columns) (Roff, Bentzen, 1989).
Распределение частот генотипов и ассоциаций с восприимчивостью к лейкозу в изученных популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород
На основании изученных материалов можно сделать вывод, что лейкоз является мультифакторным заболеванием опухолевой природы, в развитии которого существенная роль принадлежит наследственной предрасположенности, В связи с данными обстоятельствами установление генетических маркеров предрасположенности к развитию лейкоза крупного рогатого скота и выявление на основе этого генетически устойчивых или предрасположенных генотипов имеет большое значение в совершенствовании проти вол ей коз ных мероприятий. Актуальность исследований определяется еще и тем, что к настоящему времени вопросы о генетических факторах и механизмах предрасположенности и / или резистентности к лейкозу крупного рогатого скота еще не нашли окончательного решения.
Успешное внедрение методов молекулярной генетики в развитие генетической и селекционной работы в значительной мере расширили диапазон исследований. Появилась возможность изучения характера полиморфизма ДНК — локусов, ассоциированных с наследственно предрасположенными заболеваниями. В развитии лейкоза крупного рогатого скота, по мнению многих исследователей, несомненной является роль генов главного комплекса гистосовме-стимости - системы BoLA, являющейся наиболее полиморфной и полифунк-циональной из всех генетических систем (II.C.Hines et. al., 1991; M.LT.Van Eijk et, al,, 1991; 1993). Участие в контроле иммунного ответа, распознавании антигенов, регуляции взаимодействия иммунокомпетентных клеток организма - вот далеко не полный перечень функций главного комплекса гис-тосовместимости. Внедрение полимеразной цепной реакции в ДНК - генотипи-рование аллелей генов главного комплекса гистосовместимости позволит повысить эффективность изучения генетической предрасположенности к заболеванию лейкозом, что выражается в возможности установления наиболее высокого относительного риска развития патологии, быстрого и объективного обследования значительного количества животных. При помощи полимеразной цепной реакции с последующим рестрикци-онным анализом (ПЦР - ПДРФ) в системе BoLA - DRB3 типировано более 30 аллелей, впервые у черно-пестрого скота выявлены аллели, ответственные за устойчивость (DRB3. 2 11, 23, 28) и предрасположенность к лейкозу (DRB3. 2 8, 16, 22, 24), Подтвержден доминантный тип наследования устойчивости к этому заболеванию (MJ.T.Van Eijk et. al., 1991; 1993; A.Xu et, ah, 1993).
В нашей стране подобные исследования проводились на черно-пестрой и айрширской породах крупного рогатого скота, у которых выявили достоверные различия по распределению частот аллелей BoLA — DRB3 (Г.Е.Сулимова и соавт., 1992; 1995; С.О.Туркова и соавт., 1996; И.Г.Удина и соавт., 2003). По полученным данным наших исследований, типированные ранее аллели гена DRB3.2 подтвердились для изученных популяций крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород.
В наших исследованиях методом ПЦР - ПДРФ в популяции черно-пестрого скота, принадлежавшей ФГУП СПО «Стерлитамакский совхоз-техникум», выявлено 17 аллельных вариантов, в популяции, принадлежавшей ККХ «Заря», выявлено 19 аллельных вариантов, в популяции симментальской породы - 18 аллелей гена BoLA-DRB3, из 30 аллелей, тестируемых этим методом. По данным Г.Е.Сулимовой (1998) в исследуемых выборках черно-пестрого скота чаще встречались аллели: DRB3.2 11, 16, 18, 22, 24 с частотами от 0,094 до 0,181- В исследованной популяции черно-пестрого скота, по данным А.Р.Орловой с соавторами, (1996) наиболее частыми аллелями явились: DRB3.2 16, 18, 22, 24, частоты которых составляли от ОД 17 до 0,206. По результатам наших исследований наиболее частыми являются аллели: DRB3.2 16, 18, 22, 23, 24 с частотами 0,085, 0,07, 0,14, 0,11, 0,16 соответственно - в популяции черно-пестрого скота, принадлежавшей ФГУП СПО «Стерлитамакский совхоз-техникум»; DRB3.2 16, 18, 22, 23, 24, 28 с частотами 0,11, 0,13, 0,125, 0,09, 0,11, 0,095 соответственно-в популяции чсрно-псстрого скота, принадлежавшей ККХ «Заря»; DRB3.2 8, 1 [, !6, 18, 22, 23, 24, 25, 28 с частотами 0,055, 0,08, 0,072, 0,055, 0,065, 0,11, 0,06, 0,1, 0,095 соответственно- в популяции симментальского скота. Как видно по распределению частот аллелей в симментальской породе наблюдается некоторое отличие от черно-пестрой породы: в число частых аллелей включены все, ответственные за устойчивость и восприимчивость к лейкозу. В популяциях черно-пестрой породы, по сравнению с симментальской, более представлены следующие аллели, ответственные за предрасположенность к лейкозу; DRB3.2 22 - 14% и 12,5%, в популяции симментальского скота -6,5%; DRB3.2 24- 16% и 11% в популяциях черно-пестрого скота, 6% - в популяции симментальского скота. Аллели, ответственные за устойчивость к лейкозу, в обеих породах представлены примерно с одинаковой частотой, кроме аллеля ОКВЗ І 1, который в симментальской породе встречался с частотой 8%, в черно-пестрой породе 3,5% и 2,5%. Нейтральный аллель 25, встречавшийся в популяциях черно-пестрого скота с незначительными частотами - 4,5% и 3,5% соответственно - в симментальской породе относится к частым (10%),
Распределение аллелей в подвыборках инфицированных и здоровых животных во всех изученных популяциях было различным, У черно-пестрого скота аллель DRB3.2 11, который считается основным аллелем, обеспечивающим устойчивость к лейкозу поданным H.A.Lewin (1994) встречается только в под-выборке здоровых животных, В изученных нами популяциях черно-пестрого скота данное обстоятельство подтвердилось: аллель 11 выявляли в группах здоровых животных с частотами 0,08 и 0,046, тогда как в популяции симментальского скота данный аллель вывили и в группе инфицированных животных с незначительной частотой — 0,04, в группе здоровых животных частота составила — 0,12. Два других аллеля, ответственных за устойчивость к лейкозу 23 и 28 встречались с разной частотой не только среди здоровых животных, но и у инфицированных животных всех изученных популяций. В симментальской породе отмечена наиболее высокая частота встречаемости для аллеля 23 (0,11). Данный аллель в айрширской породе встречался с низкой частотой (Г.Е.Сулимова, 1998), Для всех аллелей, ответственных за устойчивость к лей 84 козу в изученных популяциях крупного рогатого скота черно-пестрой и симментальской пород отмечено низкое значение показателя соотношения шансов (odds ratio, OR) при сравнении инфицированных со здоровыми животными, что подтверждает ассоциацию этих аллелей с устойчивостью.
По результатам исследований, проведенным Г.Е.Сулимовой (1998) у анрширского скота устойчивость к лейкозу может быть связана с другими аллелями BoLA — DRB3, в качестве аллелей - кандидатов рассматриваются аллели DRB3.2 2 и DRB3,2 7. В голштино-фризской породе аллель DRB3.2 3 ассоциируется с устойчивостью к лейкозу, а в айрширской породе - с чувствительностью к лейкозу, в черно-пестрой породе аллель DRB3.2 7 встречался только у здоровых животных, и авторы рассматривают его как аллель, влияющий на устойчивость к лейкозу (ИХ.Удина и соавт., 2003), В популяции черно-пестрого скота, изученной автором, аллели, влияющие на устойчивость к лейкозу - BoLA — DRB3.2 11 и 23, выявлены только у здоровых животных, в то время как аллель 28 являлся редким и встретился у двух больных лейкозом коров в гетерозиготном состоянии с аллелем, влияющим на чувствительность к лейкозу: BoLA - DRB3.2 8 и 16.
