Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1. Свободнорадикальное окисление в норме и при патологии 14
1.2. Методы исследования свободнорадикального окисления 18
1.3. Физиологическая антиоксидантная система пародонта и роль нарушений свободнорадикального окисления в патогенезе заболевай пародонта 22
1.4. Современные подходы в коррекции нарушений свободнорадикального окисления при заболеваниях
пародонта 27
1.5. Заключение по обзору литературы 31
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 33
Глава 3. Результаты собственных исследований
3.1. Разработка метода регистрации люминолзависимой хемилюминесценции ротовой жидкости 49
3.1.1. Определение источника активных форм кислорода в ротовой жидкости 50
3.1.2. Железо-индуцированная хемилюминесценция модельной системы, надосадка, оценка антиокислительной активности 51
3.1.3. Исследование хемилюминесценции ротовой жидкости во времени 56
3.2. Влияние некоторых препаратов, применяемых в лечении хронического генерализованного пародонтита, на процессы свободнорадикального окисления в модельных системах и in vitro 58
3.2.1. Воздействие препаратов на генерацию активных форм кислорода 59
3.2.2. Изучение действия препаратов на процессы перекисного окисления липидов в модельной системе 63
3.2.3. Оценка действия препаратов на генерацию свободных радикалов фагоцитами цельной крови 68
3.2.4. Изучение влияния препаратов на хемилюминесценцию клеток ротовой жидкости in vitro 73
3.3. Данные исследования хемилюминесценции ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом 75
3.3.1. Данные клинико-лабораторного обследования больных хроническим генерализованным пародонтитом с пониженными показателями хемилюминесценции ротовой жидкости 76
3.3.2. Данные клинико-лабораторного обследования больных хроническим генерализованным пародонтитом с повышенными показателями хемилюминесценции ротовой жидкости 81
3.4. Анализ эффективности лечения больных хроническим генерализованным пародонтитом с учетом особенностей генерации активных форм кислорода и влияния препаратов на процессы свободнорадикального окисления в ротовой жидкости 86
3.4.1. Лечение больных хроническим генерализованным пародонтитом с пониженными показателями хемилюминесценции
ротовой жидкости 87
3.4.2. Лечение больных хроническим генерализованным пародонтитом с повышенными показателями хемилюминесценции ротовой жидкости 97
Заключение 106
Выводы 118
Практические рекомендации 119
Библиографический список 120
- Методы исследования свободнорадикального окисления
- Физиологическая антиоксидантная система пародонта и роль нарушений свободнорадикального окисления в патогенезе заболевай пародонта
- Разработка метода регистрации люминолзависимой хемилюминесценции ротовой жидкости
- Изучение действия препаратов на процессы перекисного окисления липидов в модельной системе
Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
Воспалительные заболевания пародонта являются одним из наиболее частых патологических состояний полости рта [Горбачева И.А., 2001; Иванов B.C., 1989; Петрович Ю.А., Сухова Т.А., Лемецкая Т.И., 2004]. Несмотря на достигнутые успехи в профилактике и лечении данной патологии, некоторые вопросы, в частности, касающиеся уточнения механизмов развития воспалительного процесса, остаются недостаточно изученными.
В последние годы в патогенезе воспаления повышенное внимание уделяется роли нарушения свободнорадикального окисления - генерации активных форм кислорода и перекисному окислению липидов [Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., 1989; Владимиров Ю.А., 2000; Фархутдинов P.P. и др., 2005]. АФК участвуют в аккумуляции и трансформации энергии, в процессах неспецифической резистентности и иммунорегуляции, в синтезе простагландинов, выработке интерлейкинов и других иммуномедиаторов [Matarasso S., Bozzini V., Vaia Е., 1987; Poli G., Parola M., 1997]; они выполняют также защитные функции - окисление эндо - и экзогенных чужеродных веществ, обеспечение кислородозависимой цитотоксичности [Barja, G., 1993; Roda A. et al., 2000; Zgliczynsky I. et al., 1988; Whiteacre C.A., Cathcart M.K.,1992]. Bf норме скорость СРО поддерживается сложным многоступенчатым механизмом регуляции [Т.В: Моругова, Д.Н. Лазарева,2000; Фархутдинов P.P. и др., 2005; Чучмай Г.С., Шириханова И.Ю., 1993; Dziak R., 1985], при срыве которого нарушение СРО становится причиной и молекулярной основой патогенеза различных заболеваний, в том числе и воспалительных [Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., 1989; Владимиров Ю.А.,1999, 2000; Маянский А.Н., Пикуза О.И., 1993; Lamster LB., Harper D.S. et al., 1987].
7 Активация процессов СРО при воспалительном процессе в пародонте связана с патогенным воздействием ассоциации микроорганизмов зубной бляшки как экзогенного индуктора цепи радикального окисления и развитием гипоксии смешанного типа, усугубляющей течение воспаления [Воскресенский О.Н., Ткаченко Е.К.,1991]. Доказано, что в условиях гипоксии нарушаются все виды обменных процессов. Происходит аккумуляция продуктов перекисного окисления и свободных радикалов, которые вступают в реакции, приводящие к развитию патологических состояний [Владимиров Ю.А., 2000].
Считается, что избыток свободных радикалов вызывает поражение тканей, поддерживает воспалительный процесс, в то время как недостаток АФК, обеспечивающих микробицидную активность фагоцитов, способствует микробной инвазии [Маянский А.Н., 2005]. В связи с этим, как ускорение СРО и увеличение свободных радикалов, так и уменьшение их содержания, может играть определенную роль в' развитии и прогрессировании воспалительных процессов. Коррекция СРО- во многих случаях, помогает предотвратить прогрессирование различных, заболеваний, предупредить возможные осложнения или облегчить тяжесть их течения [Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., 1989; Владимиров Ю.А.,1999, 2000].
В тоже время результаты изучения состояния СРО в^тканях пародонта нередко противоречивы.. В' большинстве исследований, констатируется* лишь накопление продуктов, окисления; что является предпосылкой дляї назначения-антиоксидантных препаратов [Бобырев В.Н., Розколупа Н.В., Скрипникова Т.П., 1994; Нидзельский М.Я., 1989; Розколупа Н:В., Скрипникова Т.П., Бобырев В.Н., 1996]. Вместе с тем, возможность замедления процессов СРО практически не учитывается клиницистами. Объективная оценка характера и степени изменения данного процесса и его коррекция может открыть новые перспективы лечения и профилактики заболеваний пародонта.
8 Изучение особенностей генерации АФК фагоцитирующими клетками в очаге воспаления, подбор лекарственных препаратов, обладающих способностью влиять на скорость окисления, требуют применения адекватных методов исследования свободнорадикального окисления. Однако сложность многих способов мониторинга состояния СРО делает их малодоступными для практического здравоохранения. Среди существующих методов, позволяющих ex tempore оценить скорость генерации активных форм кислорода, перспективным является регистрация хемилюминесценции - свечения, возникающего при взаимодействии свободных радикалов [Белоцкий СМ., 1986; Владимиров Ю.А., Шерстнев М.П., 1989; Владимиров Ю.А.,1999, 2000, Григорьян А.С., Грудянов А.И., 2004; Журавлев А.И., 1983; Зборовская И.А., Банникова М.В., 1995; Фролова В.М. и др., 1992; Фархутдинов P.P., Тевдорадзе СИ., 2005; Kaul N., Siveski-Iliskovic N., Hill M., 1993]. Данный метод успешно применяется в медицине для изучения СРО в крови при различных заболеваниях, а также для оценки антиокислительной активности препаратов, пищевых добавок и т.д. [Фролова В.М. и др., 1992; Фархутдинов P.P., Тевдорадзе СИ., 2005].
Изучение состояния СРО в ротовой жидкости при различном характере течения воспалительного процесса, при медикаментозных и других воздействиях может дать новые возможности уточнить причины и общие закономерности развития воспалительных заболеваний пародонта, вести целенаправленный поиск эффективных способов лечения. Указанный круг проблем и стал предметом настоящей работы.
Цель исследования: повышение эффективности лечения хронического генерализованного пародонтита с учетом особенностей генерации активных форм кислорода клетками ротовой жидкости при различном характере течения воспалительного процесса и влияния проводимого лечения на состояние свободнорадикального окисления.
Задачи исследования:
Разработать способ оценки состояния свободнорадикального окисления в ротовой жидкости и определения антиокислительной активности надосадочнои части слюны.
Изучить антиокислительную активность и генерацию активных форм кислорода в ротовой жидкости у лиц с интактным пародонтом и больных хроническим генерализованным пародонтитом.
Оценить влияние лекарственных средств, применяемых для лечения хронического генерализованного пародонтита, на процессы свободнорадикального окисления: генерацию активных форм кислорода и перекисное окисление липидов в модельных системах и в ротовой жидкости in vitro. Определить препараты, обладающие про - и антиоксидантной активностью.
Разработать тактику лечения больных хроническим генерализованным пародонтитом с учетом особенностей генерации активных форм кислорода в очаге воспаления в зависимости от характера течения заболевания и влияния лекарственных препаратов на процессы свободнорадикального окисления.
5. Определить эффективность предложенного подхода лечения хронического
генерализованного пародонтита.
Научная новизна
Впервые разработан метод регистрации хемилюминесценции ротовой жидкости, позволяющий оценить генерацию активных форм кислорода и антиокислительную активность слюны (патент № 2140633 от 27.10. 1999 г).
Впервые изучена хемилюминесценция ротовой жидкости у лиц с интактным пародонтом и у больных воспалительными заболеваниями пародонта. Полученные результаты дали возможность уточнить механизмы
10
развития различных форм пародонтита и состояние свободнорадикального
окисления в ротовой жидкости. Впервые установлено, что у больных
хроническим генерализованным пародонтитом показатели
хемилюминесценции ротовой жидкости понижены, при обострении хронического генерализованного пародонтита - повышены.
Впервые дана оценка влияния ряда лекарственных средств, используемых при лечении хронического генерализованного пародонтита: ротокана, хлорофиллипта, настойки календулы, настойки эхинацеи пурпурной, метрогила, гипохлорита натрия на процессы свободнорадикального окисления in vitro. Впервые выявлены новые свойства данных препаратов, расширяющие их фармакологическую характеристику, заключающиеся в анти - или прооксидантном действии.
На основании исследования хемилюмиесценции клеток ротовой жидкости разработан способ подбора лекарственных препаратов для лечения воспалительных заболеваний пародонта с учетом состояния свободнорадикального окисления.
Практическая значимость
Внедрена в практику методика исследования хемилюминесценции ротовой жидкости, позволяющая, оценить .генерацию активных форм кислорода клетками слюны и её антиокислительную активность. Выявлены особенности! состояния свободнорадикального окисления в ротовой жидкости при различном характере течения воспалительного процесса в тканях пародонта, давшие возможность наметить патогенетически обоснованные подходы к лечению данной патологии. В частности, разработан способ подбора лекарственных средств для местного лечения хронического генерализованного пародонтита с учетом их влияния на скорость генерации активных форм кислорода фагоцитирующими клетками слюны.
Рациональный выбор используемых средств, с учетом их влияния на свободнорадикальное окисление в ротовой жидкости, снизил частоту рецидивов заболевания. Внедрение практических рекомендаций в клиническую практику позволило повысить эффективность лечебно-диагностических
мероприятий.
Положения, выносимые на защиту
1. Предложенная методика исследования хемилюминесценции ротовой
жидкости, позволяет оценить генерацию активных форм кислорода клетками
слюны и её антиокислительную активность.
2. Интенсивность генерации активных форм кислорода клетками ротовой
жидкости зависит от характера течения воспалительного процесса в тканях
пародонта: при хроническом генерализованном пародонтите скорость
генерации активных форм кислорода понижена, при обострении хронического
генерализованного пародонтита - повышена.
Лекарственные средства, применяемые для местного лечения хронического генерализованного пародонтита, оказывают как антиоксидантное свойство (ротокан, хлорофиллипт, настойка календулы, настойка эхинацеи пурпурной, метрогил), так и прооксидантное действие (гипохлорит натрия).
Применение лекарственных препаратов, влияющих на генерацию активных форм кислорода клеток ротовой жидкости, позволяет повысить «эффективность лечения пародонтита, снизить частоту рецидивов заболевания.
Внедрения
Материалы исследования внедрены в работу пародонтологического кабинета Клинической стоматологической поликлиники БГМУ г. Уфы, ГУЗ Республиканской стоматологической поликлиники г. Уфы, стоматологической
поликлиники № 2 г. Уфы, стоматологической поликлиники № 4 г. Уфы,
г,
12 стоматологической поликлиники № 5 г. Уфы, в учебный процесс на кафедре терапевтической стоматологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», на кафедре терапевтической стоматологии ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».
Получен патент на изобретение «Способ оценки состояния свободнорадикального окисления ротовой жидкости при воспалительных заболеваниях пародонта» № 2140633 от 27.10. 1999 г.
Материалы диссертации вошли в информационно - методическое письмо для врачей - стоматологов «Нарушения свободнорадикального окисления в ротовой жидкости при воспалительных заболеваниях пародонта: диагностика, профилактика, возможность коррекции» (утвержденное в МЗРБ, г.Уфа, 2007г.).
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на: 74 Студенческой научной конференции, посвященной столетию Р.А. Вяселева - Казань, 2000 год; Национальной научно-практической конференции с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека»1 Смоленск, 2001 год; Республиканской конференции' стоматологов «Профилактика и лечение стоматологических заболеваний у детей», «Актуальные проблемы стоматологии» - Уфа, 2006 год; Всероссийском конгрессе и республиканской конференции стоматологов РБ «Внедрение новых технологий при лечении стоматологических заболеваний» - Уфа, 2007 год.
Диссертация обсуждена на совместном заседании научно-технического совета, Центральной научно-исследовательской лаборатории и кафедры терапевтической стоматологии ГОУ ВПО «Башкирский государственный
13 медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (протокол № 10 от 29.06.2007г.).
Апробация диссертации проведена на расширенном заседании предметно - проблемной комиссии ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и ГОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по специальности «Стоматология» (протокол № 7 от 12.09.2007г.).
Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации публиковано 8 печатных работ, в том числе 1 в* центральной печати, в ведущем рецензируемом научном журнале, определенном Высшей аттестационной комиссией для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата и доктора наук (Казанский медицинский журнал).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 141 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы «Обзор литературы», главы «Материалы и методы исследования», главы результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 25 рисунками. Библиографический список содержит 196 источников литературы, в том числе 117 работ отечественных и 79 зарубежных авторов.
Методы исследования свободнорадикального окисления
В лечебной практике применение лекарственных препаратов с про — и антиоксидантным действием требует постоянного контроля над изменением скорости свободнорадикального окисления в биологических материалах. Все существующие методы регистрации АФК можно разделить на косвенные, к которым относятся методы анализа продуктов радикальных реакций и ингибиторный анализ, а также прямые, к которым относятся метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и метод хемилюминесценции-[24,110].
Методы, основанные на определении концентрации-продуктов,- субстратов и-регуляторов «СРО, не всегда дают возможность судить о скорости- окисления,, кроме-того, невозможно точно утверждать, участвуют ли СР в протекающих реакциях. Это1 объясняется тем, что количество перекисных продуктов зависит от соотношения интенсивности образования и распада этих веществ. К тому же, что при наличии эффективных механизмов регуляции СРО, в частности ПОЛ, концентрация конечных продуктов в тканях может оставаться низкой и начинает возрастать только после истощения защитных сил, когда ускорение СРО становится доминирующим в картине поражения [106, 109]. Определение спектра ферментов АО защиты также не дает полной картины о произошедших реакциях СРО, так как существует множество факторов, влияющих как на содержание ферментов и низкомолекулярных веществ, так и на их антиокислительную активность [69]. Наибольшее распространение среди вышеизложенных методов получил НСТ - тест [106, 117, 145, 170], сущность которого состоит в способности фагоцитов поглощать кислород с образованием свободных радикалов, что позволяет рассматривать его как цитохимический критерий готовности к завершенному фагоцитозу. Однако из-за длительной подготовки материала к исследованию и из-за неспецифичности, данный тест не всегда позволяет в полном объеме оценить функциональную активность фагоцитов [106, 170].
Метод ЭПР применим для исследования биологических систем с использованием спиновых ловушек, то есть молекул (фенилбутилнитрои), которые при взаимодействии с радикалами образуют стабильные нитроксильные спиновые аддукты, по сигналам неспаренных электронов которых оценивается качественный и количественный состав СР в биосубстрате [24].
К эффективным приемам изучения реакций, протекающих - с участием радикалов, относится метод регистрации хемилюминесценции биологических субстратов, основанный на регистрации спонтанного свечения, возникающего в результате ферментативных и неферментативных окислительных реакций, протекающих с образованием свободных радикалов органического- и неорганического происхождения, с помощью фотоэлектронного умножителя. Достоинствами данного способа являются: измерение свечения ведется в естественных условиях, не требуется специальной подготовки материала к исследованию, метод высокочувствителен (с его помощью удается выявить короткоживущие свободные радикалы, не регистрируемые другими методами (определяется 10 5 М радикалов)) [8, 22, 35, 51, 54, 106, 107, 133, 136, 150, 160, 183]. ХЛ широко применяется в различных сферах фундаментальных и прикладных наук: биотехнологии, иммуноанализе, фармакологии, молекулярной биологии, клинической, экологической химии и др. [126], используется как индикатор образования СР в клетках, целых органах, что позволило изучить ряд патофизиологических состояний, связанных с окислительным стрессом в научных лабораториях и "у постели больного".
Интенсивность свечения биоматериала может быть искусственно увеличена с помощью индукторов. В зависимости от механизмов повышения интенсивности свечения выделяют индукторы, не влияющие на скорость реакций, сопровождающихся свечением, а увеличивающие квантовый выход этих реакций (хемилюминесцентные зонды, флюоресцирующие соединения) [31, 54, 89, 106, 137, 138, 169]. Другой их тип повышает интенсивность излучения биоматериала за счет ускорения в нем реакций СРО (физические воздействия, добавление биологически активных веществ, инициаторов окисления) [8, 20, 83, 106, 111, 146, 158].
Установлено, что ионы железа, при добавлении к биологическому материалу, содержащему липиды (гомогенаты органов и тканей, суспензии митохондрий и микросом, сыворотка крови и т.д.) участвуют одновременно в реакциях инициирования; разветвления и обрыва цепей свободнорадикального окисления. Прежде всего, взаимодействие ионов железа с кислородом-ведет к появлению активных форм кислорода (реакция Гебера-Вайса).
При наличии гидроперекисей- липидов- ионы железаг реагируют с ними с образованием перекисных радикалов. В ходе этих реакций появляются различные свободные радикалы, способные инициировать и разветвлять цепи неферментативного свободнорадикального перекисного окисления липидов в биологическом материале. В то же время, высокие концентрации ионов железа обрывают цепи окисления [109].
Физиологическая антиоксидантная система пародонта и роль нарушений свободнорадикального окисления в патогенезе заболевай пародонта
Современные исследования свидетельствуют о существенной роли нарушений СРО, как инициатора развития воспаления в пародонте [15, 32, 38, 81,86, 95,100,101,102].
Активация процессов СРО при воспалительном процессе в пародонте, по мнению ряда исследователей, связана с патогенным действием ассоциации микроорганизмов.зубной бляшки, выступающих в роли экзогенного индуктора цепи радикального окисления и развитием гипоксии смешанного типа, усугубляющей течение воспаления [33] . Доказано, что в условиях гипоксии нарушаются все виды обменных процессов, в том числе и тканевое дыхание. Происходит аккумуляция продуктов перекисного окисления и свободных радикалов, которые вступают в реакции, приводящие к- развитию патологических состояний [26]. Механизм негативного воздействия свободнорадикальных процессов на клеточном уровне состоит из нарушения структурных и барьерных свойств липидного слоя биомембран, что является одной из причин болезней и осложняет течение других [23].
Демченко Т.В. [42] в серии наблюдений экспериментального пародонтита. доказана активация ПОЛ и ферментов антирадикальной защиты. Последнее рассматривается автором как проявление компенсаторно-приспособительной реакции, направленной на ингибирование образования и накопления в тканях пародонта продуктов СРО, и свидетельствует о мобилизации естественных антиоксидантов для сохранения метаболического гомеостаза.
Другим представляющим практический интерес фактом послужили данные автора об изменении у экспериментальных животных гомеостаза ПОЛ, катал азы, СОД крови и ткани печени [42]. Подобный системный феномен, вероятно, объясняется способностью эндогенных продуктов ПОЛ циркулировать в крови и инициировать свободнорадикальные реакции в органах и тканях, не подвергшихся действию повреждающего фактора [33].
Активация ПОЛ может иметь место при недостаточности липидных антиоксидантов разного происхождения, в частности, при длительном экзогенном введении окисленных жиров [30]. Так, введение раствора окисленного подсолнечного масла способствовало развитию атрофии альвеолярного отростка [59].
Другой нередкой причиной экспрессии этого механизма является прием і лекарственных препаратов, обладающий прооксидантными свойствами. В результате срыва системы ингибирования СРО и развития синдрома к пероксидации [9, 81] помимо системных (повышение интенсивности 5 перекисного гемолиза эритроцитов, уровня ацилгидроперекисей липопротеидов4 / сыворотки крови) отмечалось снижение содержания кальция и фосфора в костной ткани. Морфологически обнаруживались увеличение степени обнажения корней моляров, артериолосклероз сосудов десны, деструктивные клеточно-инфильтративные и дистрофические процессы мягких и твердых тканей пародонта [33].
Потенцирование негативных эффектов перекисей в тканях пародонта отмечено при недостаточности в организме витаминов с антиоксидантным з действием [14, 19]. Ряд авторов придает большое значение дефициту і токоферола и аскорбата как факторам прогрессирования патологии пародонта [33]. Клиническими наблюдениями доказана патогенетическая связь I недостаточности поступления витамина С и симптома кровоточивости на ранней стадии гингивита [40]. Дефицит филлохинона (витамина К) сопровождается доминированием проявлений геморрагического диатеза в клинике пародонтита [53]. Ключевая роль в данном аспекте принадлежит, по мнению большинства исследователей, токоферолу (витамину Е). Моделирование алиментарного Е-гиповитаминоза в течение 6 месяцев у крыс приводило к формированию пародонтопатии, весьма сходной в клиническом и морфологическом плане с пародонтитом у людей [40].
Формирование различной глубины карманов при дефиците токоферола сопровождалось отеком и десквамацией эпителия, лейкоцитарной инфильтрацией и деструкцией клеток соединительной ткани десны, резорбцией альвеолярного отростка [33].
Сходство морфологических нарушений в тканях в условиях возрастной инволюции и хронической антиоксидантнои недостаточности позволило обосновать тезис о важной роли последней в процессе старения пародонта [9, 103].
Одной из особенностей ПОЛ при воспалительной патологии пародонта необходимо считать стадийность нарушений: активация аутоокисления при. гингивите сменялась его торможением при прогрессировании воспаления и формировании пародонтита. Это обстоятельство связывается с накоплением в кости насыщенных липидов, резистентных к липопероксидации [59].
Существенным фактором согласно ряду исследований является физическая активность. Ограничение движений нижней челюсти в течение 40г суток приводило к нарастанию дистрофических изменений в альвеолярном отростке у экспериментальных животных. При этом наблюдались следующие изменения: образование пародонтальных карманов, усиление резорбции межальвеолярных и межкорневых перегородок моляров [2].
Изучение роли ПОЛ в происхождении заболеваний пародонта в свете ранее существовавших теорий развития и прогрессирования пародонтита стало предпосылкой формирования концепции перекисных механизмов их патогенеза [12,13,14,33].
Разработка метода регистрации люминолзависимой хемилюминесценции ротовой жидкости
Данный этап исследования производился под руководством заведующего отделом биофизики Центральной научно-исследовательской лаборатории ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Фархутдинова P.P. автор выражает огромную благодарность за помощь в проведении исследования.
Для разработки оптимальной тактики исследования ХЛ ротовой жидкости было важно выяснить, как влияют на показатели свечения изменение объема и длительность хранения исследуемого материала. Отдельно проводилась оценка суммарной АОА надосадочной части, степень которой оценивали по способности подавлять свечение модельной системы.
С целью выработки нормативных показателей ЛЗХЛ ротовой жидкости были обследованы пациенты контрольной группы. На первом этапе проводили исследование ЛЗХЛ нативной слюны. При добавлении в 2 мл нативной слюны 0,05 мл 5 х Ю-5 М люминола было выявлено свечение, типичная запись которого представлена на рисунке 1. во
В ней можно выделить спонтанное свечение, медленную вспышку, переходящую в стационарное свечение. Величина спонтанного свечения слюны здоровых людей колеблется от 0,07 до 1,9 усл. ед., в среднем составляет 0,95 усл. ед., светосумма свечения от 1, 71 до 3,19 усл. единиц, в среднем 2, 57 усл. ед. Наличие ХЛ в ротовой жидкости свидетельствует о том, что в ней происходят реакции образования АФК, которые регистрируются в присутствии люминола, избирательно усиливающего свечение, связанное с радикалами кислорода.
Значимым моментом исследования явилось определение основного источника АФК в ротовой жидкости. С этой целью проводилось разделение ротовой жидкости на осадок и надосадочную часть.
Возможными источниками АФК ротовой жидкости являются клеточные элементы осадка, в основном фагоциты. Для исследования использовали 0,1 мл осадка, полученного в результате центрифугирования 1 мл слюны при 1500g в течение 10 минут. Каждый образец помещали в физиологический раствор с добавлением люминола в конечной концентрации 10"5 М, вели запись по специально разработанному протоколу.
На рисунке 2 изображены типичные примеры записей ЛЗХЛ слюны пациента контрольной группы, отражающие общие тенденции. Свечение надосадочной части приближалось к нулевым значениям, максимальная активность ХЛ была в осадке, состоящем из клеток слюны. Средние значения показателей ЛЗХЛ клеток и надосадочной части слюны представлены в таблице 4.
Следующим этапом исследования было изучение влияния надосадочной части слюны на X Л модельной системы и оценка ее суммарной АО А, степень которой оценивали по способности подавлять свечение модельной системы, широко применяемой в исследовании антиокислительных свойств биологических объектов [111]. Модельная система, в которой вызывается; образование АФК, состоит из 20 мл фосфатного буфера с добавлением цитрата и люминола. Образование АФК. инициируется введением 1 мл 50мМ раствора сернокислого железа при постоянном перемешивании. Основным преимуществом данной системы является ее стабильность, что существенно повышает точность исследования и достоверность получаемых результатов.
Кривая Fe- индуцированной ХЛ модельной системы имеет свои характерные особенности (рис. 3). При оценке Ре?+-индуцированной ХЛ определяли- величину спонтанного, свечения (GnC), продолжительности латентного: периода от момента введения- ионов; железаг до начала развития, медленной вспышки. Также оценивали амплитуды быстрой и медленной, светосумму свечения за время измерения.
Изучение действия препаратов на процессы перекисного окисления липидов в модельной системе
Для оценки влияния препаратов, применяемых для местного лечения хронического генерализованного пародонтита, на процессы перекисного окисления липидов была использована модельная система, предложенная Г.И. Клебановым [56]. В данной системе используются липосомы, полученные из куриного желтка, содержащего липо протейно вые комплексы, сходные с липидами крови. При введении в реакционную среду активатора окисления -ионов двухвалентного железа (10 мМ) развиваются процессы окисления полиненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов, при этом регистрируется сверхслабое свечение.
Запись свечения в ходе перекисного окисления желточных липопротеидов представлена на рис. 11. Уровень спонтанного свечения характеризует интенсивность перекисного окисления липидов до введения катализатора; амплитуда быстрой вспышки отражает скорость окисления ионов Fe2+ и образования АФК и гидроперекисей липидов; длительность латентного периода коррелирует с антиокислительной активностью изучаемого образца.
Величина светосуммы свечения определяет способность липидов подвергаться окислению [107, 109]. Внесение в модельную систему желточных липопротеидов антиоксиданта мексидола сопровождалось уменьшением амплитуды быстрой и медленной вспышек, увеличением длительности латентного периода, снижением значения максимальной светимости. Вследствие этого общая светосумма хемилюминесценции уменьшалась. Таким образом, изученные препараты, используемые в лечении хронического генерализованного пародонтита, в различной степени влияли на процессы свободнорадикального окисления в модельных системах. В наибольшей степени угнетал процессы СРО (более чем на 75 %) ротокан. Настойка эхинацеи пурпурной, настойка календулы, хорофиллипт подавляли генерацию АФК более чем на 50 %. Менее чем на 50 % угнетал СРО метрогил. Гипохлорит натрия во всех модельных системах усиливал процессы СРО, выступая в роли прооксиданта.
Для проведения эксперимента по изучению влияния лекарственных средств, применяемых при лечении заболеваний пародонта, на хемилюминесценцию клеток ротовой жидкости in vitro, регистрировали хемилюминесценцию непосредственно после взятия смыва с полости рта, при добавлении лекарственных препаратов, в лунки иммунологического планшета помещали по 0,1 мл смыва с полости рта и добавляли 0,1 мл лекарственного препарата, затем исследовали хемилюминесценцию и определяли изменение ее показателей относительно первоначальных значений. Данные приведены в таблице 10.
При анализе хемилюминограмм отмечалась кривая с плавным подъемом и высокой амплитудой. Кривые варьировали по амплитуде, но были однородными по форме.
Показатели хемилюминесценции клеток ротовой жидкости были неоднородными. Значения светосуммы варьировались в пределах от 1,5 до 497,24 условных единиц. В связи с этим показатели были проанализированы с точки зрения нормального ожидаемого распределения и классифицированы по максимальному количеству значений.
Показатели светосуммы хемилюминесценции, свидетельствующие о функциональной активности клеток, находящихся в ротовой жидкости, значительно отличались друг от друга в зависимости от характера течения воспалительного процесса в пародонте. Была выявлена четкая связь между интенсивностью ХЛ ротовой жидкости и фазой хронического генерализованного пародонтита. То обстоятельство, что больные хроническим генерализованным пародонтитом средней и тяжелой степени тяжести были во всех трех группах, говорит о том, что показатели хемилюминесцентного метода исследования не всегда коррелируют с тяжестью процесса. Была установлена взаимосвязь между показателями хемилюминесценции ротовой жидкости и стадией процесса: при хроническом генерализованном пародонтите отмечалось понижение показателей ХЛ РЖ, данную группу составили 51 человек с показателями светосуммы ХЛ менее 37 усл. единиц, при обострении же процесса - значительное повышение значений, в группу вошло 60 больных с показателями светосуммы ХЛ более 60 усл. единиц, у 7 больных показатели ХЛ РЖ находились в пределах нормы (от 37 до 60 усл. единиц), что было связано с тем, что в данную группу составили лица, ранее получавшие медикаментозное лечение по поводу хронического генерализованного пародонтита.
В группу больных ХГП с пониженными показателями ХЛ ротовой жидкости вошли лица со значениями светосуммы ХЛ клеток ротовой жидкости менее 37 усл. единиц. Количество их составило 51 человек, из них 30 с диагнозом хронический генерализованный пародонтит средней степени тяжести, 21- хронический генерализованный пародонтит тяжелого течения). У больных данной группы пониженные показатели ХЛ клеток ротовой жидкости свидетельствовали о замедлении скорости свободнорадикального окисления в ротовой жидкости.
Основные жалобы пациентов с ХГП средней и тяжелой степеней были на кровоточивость десен, их болезненность при чистке зубов и при приеме жесткой пищи, оголение корней зубов и их повышенную чувствительность,; на подвижность зубов, изменение их положения в зубном ряду, на наличие зубных отложений, на неприятный запах изо рта.
При объективном обследовании у всех пациентов определялась отечность, гиперемия слизистой оболочки десневого края, кровоточивость его при зондировании, наличие над - и поддесневых зубных отложений, подвижность зубов варьировалась от I до II степени в зависимости от тяжести процесса, определялись пародонтальные карманы от 4,0 до 6,5 мм, рецессия десневого края от 1/3 до 1/2 длины корня, наличие блоков травматической окклюзии.
