Введение к работе
1.1 Актуальность проблемы. Внедрение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лабораторную диагностику туберкулёза животных в нашей стране показало необходимость дальнейшего совершенствования этого метода с целью исключения возможности получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов и повышения достоверности исследования.
Известно, что наиболее трудоёмким этапом ПЦР–анализа является выделение нуклеиновых кислот. Автоматизация этапа выделения ДНК позволяет сократить количество лабораторных ошибок и повысить эффективность выявления микобактерий туберкулёза из исследуемого материала (В.С. Зайцев с соавт., 2007; M.J. Espy et al., 2001, 2006; P. Hammer et al., 2002; J.H. Knepp et al., 2003; J.R. Stabel et al., 2004; S. Ravas, L.H. Stanker, 2005; D. Herthnek et al., 2006; C.V. Jaravata et al., 2006). Поэтому, дальнейшие совершенствования в области молекулярной диагностики туберкулёза животных должны быть направлены на автоматизацию ПЦР–анализа.
За рубежом проблемам диагностики и профилактики инфекционных болезней диких животных уделяется особое внимание, т.к. места их содержания (зоопарки, цирки и др.) считаются зонами повышенного риска. В зоопарках ряда стран имеются специальные рекомендации по диагностике и профилактике инфекционных болезней диких животных. Однако в РФ подобных рекомендаций не существует, и ветеринарные специалисты вынуждены руководствоваться только рекомендациями, разработанными для домашних и сельскохозяйственных животных. Это создаёт серьёзные проблемы для сохранения здоровья диких животных (Г.И. Блохин, 2006; М.В. Альшинецкий, 2004, 2009; R.J. Montali, S.K. Mikota, L.I. Cheng, 2001; A. Lecu, R. Ball, 2011).
В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» (2002) основным методом прижизненной диагностики туберкулёза животных является внутрикожная туберкулиновая проба. Однако провести туберкулинизацию диких животных в зоопарках и цирках не всегда представляется возможным из-за их агрессивности. Некоторые животные (слоны, бегемоты, носороги) имеют толстую кожу, в которую практически невозможно ввести туберкулин и, поэтому, внутрикожная туберкулиновая проба не может использоваться как основной метод диагностики туберкулёза данных животных. Кроме того, в 2003 г. в статье «Экологический мониторинг при туберкулинодиагностике крупного рогатого скота», опубликованной в издании «Агроекологiчний журнал» №1 В.В. Власенко, А.П. Лысенко с соавт. утверждали, что существующий технологический регламент изготовления ППД–туберкулина для млекопитающих (ФГУП «Курская биофабрика») не обеспечивает стерильность и специфичность препарата. Это, по мнению авторов статьи, способствует поступлению с туберкулином в организм крупного рогатого скота адаптивных форм возбудителя туберкулёза. Для обеспечения общепринятого международного требования безопасности туберкулиновых препаратов разработчик включил в технологический регламент тест на специфическую безвредность ППД–туберкулина для млекопитающих, результаты которого подтверждают отсутствие в готовом препарате живых микобактерий.
Паратуберкулёз крупного рогатого скота был и остаётся одной из сложно контролируемых и диагностируемых хронических инфекций. В последние годы в зарубежной литературе появились сообщения об успешном испытании ПЦР при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота и овец. Авторы оценивают ПЦР как более точный и экспрессный метод идентификации возбудителя паратуберкулёза и рекомендуют его для диагностики и включения в программы борьбы с этой инфекцией (N.G. Jalmes et al., 2008; J. Szteyn et al., 2008; A. Doosti, S. Moshkelani, 2010).
В отечественной литературе данных о возможности применения ПЦР для диагностических исследований на паратуберкулёз крупного рогатого скота нами не обнаружено.
Поэтому, на современном этапе борьбы с туберкулёзом и паратуберкулёзом животных, учитывая недостаточную изученность некоторых важных вопросов диагностики, длительность, трудоёмкость и сравнительно низкую эффективность классических методов прижизненной и лабораторной диагностики, изучение возможности применения метода ПЦР при диагностике микобактериальных инфекций зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных является своевременным и актуальным.
1.2 Цель исследований: оптимизация ПЦР–анализа и изучение возможности применения полимеразной цепной реакции для мониторинга микобактериальных инфекций зоопарковых, цирковых и сельскохозяйственных животных.
1.3 Основные задачи исследований:
1 Провести культуральные и молекулярно–генетические исследования всех трёх аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике при диагностике туберкулёза и паратуберкулёза животных (ППД–туберкулин для млекопитающих, ППД–туберкулин для птиц и КАМ), на наличие микобактерий и ДНК микобактерий.
2 Провести сравнительное изучение эффективности автоматического и «ручного» выделения ДНК из различных видов биоматериала с целью оптимизации ПЦР–анализа для мониторинга микобактериальных инфекций животных.
3 Провести ПЦР–исследование различных видов биоматериалов и объектов внешней среды из вольеров и клеток с разными видами диких животных в ГУК «Московский зоологический парк» и Московском цирке Никулина и определить возможность применения ПЦР для мониторинга благополучия животных по туберкулёзу.
4 Определить диагностическую ценность и возможность применения ПЦР в общем комплексе лабораторных исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота.
1.4 Научная новизна. Впервые проведено исследование всех трёх аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике для прижизненной диагностики туберкулёза и паратуберкулёза животных на наличие микобактерий и ДНК микобактерий. Исследованием методами: культуральным, ПЦР и секвенирования установлено, что ППД–туберкулин для млекопитающих, ППД–туберкулин для птиц и КАМ не содержат микобактерий, ДНК микобактерий туберкулёза животных и ДНК нетуберкулёзных микобактерий.
Впервые определена эффективность автоматического выделения ДНК микобактерий из различных видов биоматериала в сравнении с «ручным» методом, что позволило оптимизировать ПЦР–анализ микобактериозов животных. Установлено, что при автоматическом выделении ДНК повышается информативность и достоверность метода за счёт увеличения объёма исследуемой пробы до 1,0 мл, сокращается время проведения исследований, исключается возможность контаминации реагентов и проб, снижается вероятность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов ПЦР.
Впервые показана возможность применения ПЦР в целях мониторинга благополучия диких животных по туберкулёзу в зоопарках и цирках при исследовании различных видов биоматериала от данных животных и объектов внешней среды.
Впервые установлена возможность применения ПЦР и определено её место в общем комплексе диагностических исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота.
1.5 Практическая значимость. Результаты исследований включены в сборник «Методические наставления по проведению исследований при микобактериозах животных», рассмотренные и одобренные на заседании учёного совета Всероссийского научно–исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (ВИЭВ) (протокол № 1 от 25.01.2011 г.), на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 27.04.2011 г.), утверждённые Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 03.10.2011 г. Методические наставления награждены Дипломом XIV Российской агропромышленной выставки «Золотая осень» (Москва, 2012 г.)
По результатам научно-исследовательской работы разработаны Методические наставления «Мониторинг благополучия диких животных по туберкулёзу в зоопарках и цирках Российской Федерации», рассмотренные и одобренные на заседании ученого совета Всероссийского научно–исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко (протокол № 4 от 16.04.2012 г.), на секции «Инфекционная патология животных» Отделения ветеринарной медицины РАСХН (протокол № 4 от 21 сентября 2012 г.), утверждённые Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 09.11.2012 г.
1.6 Основные положения, выносимые на защиту:
ППД–туберкулин для млекопитающих, ППД–туберкулин для птиц и КАМ производства ФГУП «Курская биофабрика» не содержат микобактерий, ДНК микобактерий туберкулёза и ДНК нетуберкулёзных микобактерий.
Оптимизация ПЦР–анализа путём автоматического выделения ДНК микобактерий из различных видов биоматериала для мониторинга микобактериозов животных.
Результаты ПЦР–исследований различных видов биоматериала и объектов внешней среды из вольеров и клеток с разными видами диких животных в ГУК «Московский зоологический парк» и Московском цирке Никулина на Цветном бульваре в целях мониторинга благополучия животных по туберкулёзу.
Диагностическая ценность и возможность применения ПЦР в общем комплексе лабораторных исследований при паратуберкулёзе крупного рогатого скота.
1.7 Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» представляет собой область науки, изучающей систематику, структуру, физиологию, биохимию, генетику, экологию патогенных микроорганизмов (бактерий, вирусов, грибов), имеющих ветеринарное значение, эпизоотологические и экологические закономерности возникновения, распространения инфекционных болезней и иммунологию сельскохозяйственных, домашних и диких животных, изучающая и разрабатывающая методы, средства и организационные основы диагностики, лечения, профилактики и ликвидации этих болезней. В диссертационной работе приведены результаты исследований всех аллергенов, используемых для диагностики туберкулёза и паратуберкулёза животных, на наличие микобактерий и их ДНК, сравнительного изучения «ручного» и автоматического выделения ДНК из биоматериалов, ПЦР–исследований различных видов биоматериалов и объектов внешней среды от разных видов диких животных зоопарка и цирка в целях мониторинга благополучия по туберкулёзу, возможности применения ПЦР в общем комплексе лабораторных исследований при диагностике паратуберкулёза крупного рогатого скота.
Результаты научного исследования соответствуют пункту 5 паспорта специальности.
1.8 Личный вклад соискателя. Экспериментальные исследования методом ПЦР и обобщение результатов по теме диссертационной работы выполнены автором самостоятельно. Аллергические исследования проведены совместно с профессором А.Х.Наймановым, культуральные исследования – с ведущим научным сотрудником лаборатории микобактериозов ВИЭВ Н.Г. Толстенко, секвенирование фрагментов ДНК микобактерий – совместно с научными сотрудниками ЦНИИЭ Е.А. Долговой и М.В. Альварес Фигероа.
1.9 Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на: 7-ой Всероссийской научно–практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика–2010» (2010), межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ, Москва (2012). Материалы диссертации используются в учебном процессе при проведении лекционных и практических занятий по дисциплине «Современные проблемы биологии» со студентами (магистры биологии) ветеринарно-биологического факультета Федерального бюджетного государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина».
1.10 Публикации. По материалам диссертационной работы опубликованы четыре научные работы, в том числе три статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Ветеринарная медицина» –2 и «Российский ветеринарный журнал» –1), одна – в сборнике конференции с международным участием.
1.11 Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 149 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы (258 источников, из которых 136 отечественных и 122 иностранных). Работа содержит 8 таблиц, 10 фотографий и 15 графиков.
