Содержание к диссертации
стр.
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1 Этиопатогенез смешанных респираторных заболеваний
молодняка крупного рогатого скота 12
1.2. Роль отдельных бактериальных агентов в респираторной патологии
молодняка крупного рогатого скота 15
Таксономия и структура P.multocida, клинико-эпидемиологические собенности инфекции 15
Таксономия и структура M.haemolytica, клинико-эпидемиологические особенности инфекции 24
Таксономия и структура СЫ.ресогит, клинико-эпидемиологические особенности инфекции 30
Таксономия и структура М. bovis, клинико-эпидемиологические особенности инфекции 36
1.3. Диагностика смешанных инфекций респираторного тракта
молодняка крупного рогатого скота 41
Диагностика пастереллёза, вызываемого P.multocida 41
Диагностика маннхеймиоза, вызываемого M.haemolytica 45
Диагностика хламидиоза, вызываемого СЫ.ресогит 49
Диагностика микоплазмоза, вызываемого M.bovis 53
1.4. Заключение по обзору литературы 56
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 60
2.1. Материалы 60
Биологические материалы 60
Химические реагенты 61
Растворы, буферные смеси и ферменты 62
Праймеры 63
Оборудование 63
2.2. Методы 64
2.2.1. Выделение суммарной ДНК 64
Мультиплексная ПЦР для индикации и дифференциации серогрупп А, В, D, Е и F P.multocida, рекомендованная МЭБ....65
Очистка продуктов ПЦР и секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК 66
Компьютерный анализ и сравнение первичных
структур нуклеиновых кислот 67
Формирование выборки 67
Методы анализа данных 69
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И
ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 71
3.1. Разработка метода идентификации и дифференциации геномов
M.haemolytica и P.multocida с помощью ПЦР и
нуклеотидного секвенирования 71
Выбор генетических мишеней и первичной структуры праймеров 71
Оптимизация условий постановки метода 80
Определение специфичности и аналитической чувствительности метода 83
Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей фрагментов генов sodA и IktD М. haemolytica
выявленных на территории РФ в 2006-2009 гг 86
3.2. Разработка метода индикации генома СМ. ресогит с
использованием ПЦР 88
Выбор генетической мишени и первичной структуры праймеров 88
Генетический анализ и определение видовой принадлежности изолятов микроорганизмов семейства Chlamydiaceae 90
Оптимизация условий постановки и оценка специфичности метода 92
Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей фрагмента гена отрА Chl.pecorum, выявленных на территории РФ в 2006-2009 гг 95
3.3. Разработка метода индикации генома M.bovis с
использованием ПЦР 99
3.3.1. Выбор генетической мишени и первичной структуры
праймеров 99
Оптимизация условий постановки метода 101
Определение специфичности и относительной аналитической чувствительности метода 102
Выявление генома М. bovis в патологическом материале от КРС на территории РФ в 2008-2009 гг 105
Индивидуальная и стадная превалентность M.haemolytica, P.multocida, Chl.pecorum и M.bovis в популяции КРС ЦФО РФ 106
Оценка ассоциации результатов диагностического теста с клиническими признаками поражения респираторного
тракта телят 108
Оценка ассоциации инфицированности M.haemolytica с признаками поражения респираторного тракта телят 109
Оценка ассоциации инфицированности Chl.pecorum с признаками поражения респираторного тракта телят 110
Оценка ассоциации инфицированности M.bovis с признаками поражения респираторного тракта телят 111
Оценка ассоциации инфицированности P.multocida с признаками поражения респираторного тракта телят ..113
Ретроспективная оценка эффективности вакцинации против пастереллёза КРС по обследованному поголовью телят 114
3.6. Модель факторного взаимодействия P.multocida, M.haemolytica,
Chl.pecorum и M.bovis 116
Оценка взаимосвязи клинических проявлений заболевания и инфицирования телят P. multocida, М. haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis 121
Факторные взаимодействия в группе животных позитивных
по М. haemolytica, P. multocida, Chl.pecorum и М. bovis 123
3.6.3. Количественная оценка вклада факторов и взаимодействий
в группе клинически больных животных 126
3.6.4. Построение общей модели респираторной патологии телят ... 128 -
ВЫВОДЫ 131
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 132
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 133
ПРИЛОЖЕНИЯ 162
Введение к работе
Актуальность темы. В последние годы в РФ стала актуальной проблема интенсивного производства животноводческой продукции и снижения её себестоимости. Решение данного вопроса неразрывно связано со специализацией, концентрацией поголовья и внедрением новых индустриальных технологий в скотоводческих хозяйствах. Однако, изменения технологии содержания существенно изменило среду обитания животных и ограничило многие естественные жизненные потребности, что сказалось на их устойчивости к различным инфекциям. В данных условиях существенное влияние на эпизоотическую ситуацию оказывают, прежде всего, ассоциативные и смешанные инфекции респираторного тракта крупного рогатого скота, обусловленные возбудителями с невысокой вирулентностью, которые занимают основную часть в патологии молодняка, и являются одной из сложных и актуальных проблем ветеринарной науки [3,8,22,23,109].
По широте распространения и летальности респираторные болезни у телят превалируют над всеми остальными заболеваниями молодняка [60,61].
Массовые респираторные заболевания молодняка КРС являются комлексными многофакторными синдромами, возникающими на фоне взаимодействия различных инфекционных агентов, изменения иммунного статуса животных, физических и экологических факторов" [32,88,129,240]. Общепризнано, что основная роль в развитии смешанных респираторных инфекций телят принадлежит вирусам (парагриппа-3 КРС, инфекционного ринотрахеита КРС, респираторно-синцитиальной инфекции КРС, вирусной диареи КРС, коронавирусу КРС и др.) и бактериям (прежде всего Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica,), а так же Chlamydophila pecorum и i^ccp/as/nabovw.[6,14,16,18,20,23,29,32,43,l 17,124,175,191,218].
Характерным для респираторных инфекций КРС является сходство характеристик эпизоотического процесса, малая специфичность клинических
7 и патологоанатомических признаков заболевания, а также наличие латентной и персистентной формы инфекционного процесса [111]. В таких случаях для точного анализа сложившейся эпизоотической ситуации, выяснения этиологических причин заболевания и успешного проведения противоэпизоотических, профилактических и лечебных мероприятий необходимо применение специфичных методов лабораторной диагностики данных заболеваний. Ранее разработанные методы прямой и ретроспективной диагностики заболеваний, вызываемых M.haemolytica, P.multocida, Chl.pecorum и M.bovis не всегда позволяют надёжно идентифицировать инфекционные агенты. Решение проблемы может быть найдено в использовании методов молекулярной биологии, в частности, полимеразной цепной реакции и нуклеотидного секвенирования. Кроме этого, разработка и применение этих методов для диагностики бактериальных инфекций стало важным в связи с изменениями классификации и таксономического положения M.haemolytica и Chl.pecorum, в основу которых положены принципы и подходы современной геносистематики [122,241].
Таким образом, в соответствии с эпизоотологической важностью и необходимостью усовершенствования методов лабораторной диагностики P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis представляется актуальным разработка молекулярно-биологических методов их идентификации и дифференциации.
Несмотря на то, что P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis широко распространены в стадах КРС многих стран мира, исследования, посвященные изучению распространённости данных возбудителей в РФ до сих пор немногочисленны. Поэтому актуальны исследования, направленные на уточнение распростанённости вышеуказанных возбудителей на территории РФ, путём проведения скрининговых и мониторинговых исследований.
Выяснение этиологической структуры респираторных заболеваний молодняка КРС и количественная оценка вклада отдельных возбудителей невозможна в рамках описательной эпизоотологии, учитывая высокую вероятность участия нескольких болезнетворных агентов, поэтому требует применения методов аналитической эпизоотологии [4,7,12,13,17,40,131,253]. Цель и задачи исследования. Цель исследований заключалась в разработке методов выявления генома P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis методом ПЦР и нуклеотидного секвенирования и оценке с их помощью превалентности данных возбудителей в популяции телят 0,5-7 месячного возраста в хозяйствах ЦФО РФ.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
разработать метод выявления генома P.multocida и M.haemolytica на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования;
разработать метод выявления генома Chl.pecorum на основе ПЦР;
разработать метод для выявления генома M.bovis на основе ПЦР;
с использованием разработанных методов оценить превалентность P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis в популяции телят 0,5 — 7 месячного возраста в хозяйствах ЦФО РФ;
оценить связь выявления P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis с респираторной патологией телят, используя метод факторного анализа по Ротману [K.J. Rothman, 1976].
Научная новизна исследования. С помощью метода мультиплексной ПЦР и секвенирования разработан способ идентификации геномов M.haemolytica и P.multocida с последующей их дифференциацией в соответствии с современной таксономией Pasteurettaceae.
Сконструированы системы праймеров и разработаны методы идентификации Chl.pecorum и M.bovis на основе метода ПЦР.
Определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов sodA и IktD изолятов M.haemolytica, выявленных в пробах патологического материала на территории РФ в течение 2006-2009гг.
Впервые в популяции КРС в хозяйствах РФ выявлена циркуляция Chi. pecorum. Определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена отрА изолятов Chl.pecorum, выявленных в пробах патологического материала от КРС на территории РФ в течение 2006-2009 гг. Изучены вероятные филогенетические отношения между изолятами, выявленными на территории РФ, и изолятами Chl.pecorum, имеющимися в базе данных GenBank.
Впервые определены показатели стадной и индивидуальной превалентности P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis на репрезентативной выборке КРС в возрасте 0,5 - 7 месяцев в хозяйствах ЦФО РФ.
Впервые с использованием факторного анализа и общей модели факторного взаимодействия установлена достоверность различий в частоте выявления P.multocida, M.haemolytica, Chl.pecorum и M.bovis у здоровых телят и телят с респираторной патологией в хозяйствах РФ.
Практическая значимость исследования. В результате проведённых исследований разработаны:
«Методические рекомендации по нуклеотидному секвенированию генома бактерий рода Mannheimia с целью определения их видовой принадлежности». Данная методика позволяет выявлять и дифференцировать M.haemolytica и P.multocida в патологических и культу ральных бактериосодержащих материалах (2007г.).
«Методические рекомендации по индикации генома Chlamydophila pecorum методом полимеразной цепной реакции» (2009г.).
- «Методические рекомендации по индикации генома Mycoplasma bovis
методом полимеразной цепной реакции» (2009г.).Данные методические рекомендации прошли комиссионные испытания, рассмотрены и одобрены учёным советом, утверждены директором ФГУ «ВНИИЗЖ» и рекомендованы для использования в лабораториях при проведении диагностических исследований.
Результаты изучения превалентности и оценки связи выявления P.multocida, M.haemolytica, ChLpecorum и M.bovis с респираторной патологией в изучаемой популяции КРС с использованием факторного анализа и общей модели факторного взаимодействия имеют как теоретическую, так и практическую значимость, поскольку дают возможность расширить знания о роли изучаемых возбудителей в респираторной патологии молодняка КРС, и в дальнейшем могут быть использованы при разработке комплекса научно-обоснованных мер борьбы и профилактики смешанных респираторных инфекций КРС.
Основные положения, выносимые на защиту:
- метод идентификации и дифференциации M.haemolytica и P.multocida
методом мультиплексной ПЦР и нуклеотидного секвенирования;- метод выявления генома ChLpecorum на основе амплификации
фрагмента гена отрА;- метод выявления генома М. bovis на основе амплификации фрагмента
гена uvrC;-результаты филогенетического анализа нуклеотидных
последовательностей фрагмента гена отрА изолятов ChLpecorum, выявленных в РФ в 2006-2009гг.;
-результаты исследования по оценке превалентности P.multocida, M.haemolytica, ChLpecorum и M.bovis в популяции телят 0,5 - 7 месячного возраста в ЦФО РФ;
-результаты факторного анализа по Ротману и анализа общей модели факторного взаимодействия P.multocida, M.haemolytica, ChLpecorum, M.bovis и их ассоциаций у телят с респираторной патологией в хозяйствах ЦФО РФ.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Нуклеотидное секвенирование осуществлялось сотрудниками лаборатории диагностики вирусных болезней птиц ФГУ «ВНИИЗЖ». Исследования по диссертационной работе выполнены в 2006-2009гг. в ФГУ «ВНИИЗЖ».
Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены и опубликованы в материалах научных конференций: «Диагностика профилактика и лечение болезней животных» (г. Новосибирск, 2008г.), «Достижения молодых учёных в ветеринарную практику», посвященная 50-летию создания ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 2008г.), «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» посвященная 70-летию со дня рождения члена-корреспондента РАСХН Вишнякова И.Ф. (г. Покров, 2009г.), а также на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2006- 2010гг.
Публикация научных исследований. По теме научных исследований опубликовано 5 научных работ в журналах и материалах научных конференций, три из них - в журнале «Ветеринарная патология», рекомендованном ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 165 страницах компьютерного текста и содержит разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 262 источника, в том числе 222 зарубежных. Работа иллюстрирована 14 рисунками и 22 таблицами.
Благодарность: Автор выражает искреннюю благодарность кандидату биологических наук Прохватиловой Ларисе Борисовне, кандидату ветеринарных наук Дудникову Сергею Андреевичу, кандидату биологических наук Колосову Сергею Николаевичу за помощь и консультации при проведении исследований и оформлении диссертации.
Похожие диссертации на Разработка и применение методов молекулярной биологии для выявления возбудителей бактериальных респираторных инфекций крупного рогатого скота
