Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1. Циклодекстрины: строение и свойства 13
-
Строение циклодекстринов 13
-
Свойства циклодекстринов 15
1.2. Циклодекстринглюканотрансферазы 17
-
Строение ЦГТ-азы 17
-
Реакции, катализируемые циклодекстринглкжанотрансферазой 18
1.3. Циклодекстриногенные бактерии - продуценты циклодекстринглюкано
трансфераз 22
-
Paenibacillus macerans 22
-
Bacillus circulans 24
-
Алкалофильные бациллы 24
-
Продуценты циклодекстринглюканотрансферазы, развивающиеся при нормальных значениях рН 24
-
Термотолерантные циклодекстриногены 25
1.3.6. Продуценты циклодекстринглюканотрансфераз, не относящиеся к
порядку Bacilales 25
1.4. Выбор продуктивного штамма для процессов получения ЦГТ-азы 26
1.5. Условия культивирования микроорганизмов - продуцентов цикло
декстринглюканотрансфераз 28
-
Идентификация микроорганизмов 50
-
Получение циклодекстринов 53
-
Перспективы практического использования циклодекстринов 54
-
Пищевая промышленность 54
-
Биотехнология и химия 56
-
Косметическая промышленность 58
-
Сельское хозяйство 58
-
Медицина 59
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 62
2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 62
-
Микроорганизмы 62
-
Образцы почвы для скрининга 62
-
Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания и из коллекции культур МГУПП 62
-
Питательные среды 65
-
Методы исследования бактерий 66
-
Подбор оптимальной для хранения культуры питательной среды 68
-
Выращивание культур микроорганизмов в условиях глубинной ферментации 68
-
Метод аддитивно-решетчатого математического описания объекта....69
-
Определение содержания сухих веществ 71
-
Определение величины рН растворов 71
-
Определение восстанавливающих Сахаров 72
-
Определение белка 72
-
Способы выделения циклодекстринглюканотрансферазы из культуралыюй жидкости Bacillus sp. 1АМБ 72
-
Получение лиофилизированных ферментных препаратов 73
-
Определение содержания влаги в препарате 73
2.1.16. Методы определения ферментативных активностей 73
2.1.16.1 Определение альфа-ЦГТ-азной активности штаммов продуцентов,
выращенных на тест-средах 73
2.1.16.2.Количественный метод определения активности альфа-ЦГТ-
азы 74
-
Измерение активности бета-ЦГТ-азы фенолфталеиновым методом 75
-
Метод определения внутриклеточной активности альфа-ЦГТ-азы 78
2.1.16.5. Метод определения декстриназной (крахмалоразжижающей)
активности ЦГТ-аз 78
-
Определение циклодекстринов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 80
-
Метод определения термостабильности альфа-ЦГТ-азы
Bacillus species 1АМБ 81
2.1.19. Метод определения рН-стабилыюсти альфа-ЦГТ-азы
Bacillus species 1АМБ 81
2.1.20. Стимулятор роста микроорганизмов полифенольной природы
Гипоксен 82
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ 84
-
Скрининг ЦГТ-активных микроорганизмов из природных мест обитания и из коллекции культур МГУПП 84
-
Исследование фенотипических признаков и идентификация штамма продуцента Bacillus species 1АМБ 91
-
Морфологические особенности клеток Bacillus species 1АМБ 91
-
Культуральные признаки штамма Bacillus species 1 АМБ 93
-
Физиолого-биохимические признаки продуцента 96
2.2.2.4. Устойчивость продуцента Bacillus species 1АМБ к факторам
внешней среды 101
-
Филогенетические особенности культуры 103
-
Подбор оптимальной для хранения культуры Paenibacillus macerans 1 АМБ питательной среды 105
2.2.3. Выбор предпочтительного варианта питательной среды для получения
альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ с помощью метода
многокритериального выбора 108
2.2.4. Изучение динамики биосинтеза альфа-ЦГТ-азы в процессе
культивирования Paenibacillus macerans 1АМБ на среде с растворимым
крахмалом 116
2.2.5. Оптимизация состава питательной среды с растворимым
крахмалом 118
2.2.6. Исследование влияния физических методов обработки крахмала на
биосинтез ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ 121
-
Исследование влияния обработки крахмала ультразвуком на биосинтез ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ 122
-
Исследование влияния обработки крахмала микроволновым излучением на биосинтез ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ 124
2.2.6.3. Исследование влияния обработки крахмала рентгеновскими лучами
на биосинтез ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ 126
2.2.7.Влияние источников фосфора на биосинтез ЦГТ-азы Paenibacillus
macerans 1АМБ 127
2.2.8. Оптимизация состава питательной среды для биосинтеза ЦГТ-азы
Paenibacillus macerans 1АМБ методом аддитивно-решетчатого
математического описания объекта 130
2.2.9. Изучение влияния рН исходной ферментационной среды на биосинтез
альфа-ЦГТ-азы бактериями Paenibacillus macerans 1 АМБ 132
-
Разработка способов получения посевного материала Paenibacillus macerans 1АМБ 132
-
Изучение влияния микроэлементов и стимулятора роста Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы Paenibacillus macerans 1АМБ 136
-
Влияние микроэлементов на биосинтез альфа-ЦГТ-аз Paenibacillus macerans 1АМБ 136
-
Влияния стимулятора роста Гипоксена на биосинтез альфа-ЦГТ-аз Paenibacillus macerans 1АМБ 140
2.2.12. Изучение динамики биосинтеза фермента альфа-ЦГТ-азы бактериями
Paenibacillus macerans 1АМБ на оптимизированной по составу питательной
среде 141
2.2.13. Осаждение ферментов из культуральной жидкости Paenibacillus
macerans 1АМБ 144
2.2.14. Наработка опытных партий препарата альфа-ЦГТ-азы различной
Paenibacillus macerans 1АМБ степени очистки 148
2.2.15. Анализ полученных препаратов альфа-циклодекстринглюкано-
трансфераз методом ВЭЖХ 151
2.2.16. Исследование физико-химических характеристик препаратов альфа-
ЦГТ-азы ГЗХ и П ОХ 152
-
Определение рН-оптимума ферментных препаратов альфа-ЦГТ-азы 152
-
Определение рН-стабильности ферментных препаратов альфа-ЦГТ-азы 153
-
Определение температурного оптимума ферментных препаратов альфа-ЦГТ-азы 155
-
Определение термостабильноти препаратов альфа-ЦГТ-азы Г10Х
и ГЗХ 156
ГЛАВА 3. ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ 158
-
Характеристика конечного продукта производства 158
-
Изложение технологического процесса производства 160
3.2.1. Характеристика сырья и материалов 160
3.2.2. Изложение стадий вспомогательных работ (ВР) и основного
технологического процесса (ТП) 161
-
Расчет материального баланса для получения ферментного препарата ЦГТ Г10Х из 1 м культуральной жидкости 184
-
Контроль производства и управление технологическим процессом 190
-
Переработка и обезвреживание отходов производства 193
ВЫВОДЫ 195
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 197
ПРИЛОЖЕНИЯ 218
Введение к работе
(ЦД).
Синтезируемые ЦГТ - азами ЦД, вследствие уникального строения (гидрофильная поверхность и гидрофобная внутримолекулярная полость), способны образовывать комплексы - включения с различными органическими и неорганическими молекулами, изменяя их физико-химические свойства, за счет чего можно достичь таких эффектов, как увеличение в десятки и сотни раз растворимости в воде неполярных соединений, увеличение стабильности различных веществ к воздействию кислорода, воздуха, света, температуры. Благодаря этому ЦД широко используются в медицинской, фармацевтической, косметической, пищевой промышленности, сельском хозяйстве и других областях.
В промышленных масштабах ЦД можно получать лишь ферментативным путем, так как синтез этих соединений химическими методами очень дорог. В целом процесс получения ЦД сводится к следующим основным этапам: 1) культивирование микроорганизма -продуцента ЦГТ-аз, 2) выделение ферментного препарата из культуральной жидкости, 3) получение ЦД с помощью препарата ЦГТ-аз. В настоящее время выпуском ЦД заняты фирмы в различных странах мира. Стоимость бета - ЦД, промышленного производства, достигает 25 долларов США за килограмм, альфа - и гамма- ЦД имеют себестоимость в десятки раз более высокую.
Биохимические реакции, катализируемые ЦГТ - азами, очень сложны. При гидролизе субстрата (крахмала) с помощью ЦГТ - аз, может образовываться смесь альфа -, бета - и гамма - ЦД, линейных и разветвленных ЦД, моно -, ди - и три - сахаридов. В соответствии с преобладанием определенного вида ЦД в реакционной смеси ЦГТ - азы подразделяют на альфа -, бета - и гамма - специфичные.
В настоящее время в России производство ЦГТ-аз и ЦД отсутствует. В 80-е годы прошлого века в МГУПП под руководством профессора И.М.Грачевой были разработаны основы лабораторного культивирования продуцентов ЦГТ-аз. В связи с изменениями социального, политического и экономического характера в начале 90-х годов эти исследования были приостановлены. Однако во всех высокоразвитых странах интерес к комплексам включений на основе ЦД только возрастает. Поэтому разработка новых научно-обоснованных биотехнологий производства ЦГТ-аз и ЦД актуальна и перспективна.
Цель и задач» исследования. Основная цель диссертационной работы состояла в поиске активного продуцента альфа-ЦГТ-азы, оптимизации условий его культивирования для биосинтеза фермента и в получении очищенного ферментного препарата альфа-ЦГТ-зы ПОХ.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: скрининг микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз, выделенных из природных мест обитания, и коллекционных культур, с целью отбора штамма, обладающего преимущественно альфа-ЦГТ-азной активностью; идентификация штамма-продуцента альфа-ЦГТ-азы на основании изучения совокупности сто морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик; подбор оптимального состава питательной среды и условий культивирования на основе изучения физиолого-биохимических особенностей штамма-продуцента; установление влияния микроэлементов и стимулятора роста микроорганизмов Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы штамма-продуцента; разработка технологии полумения ферментного препарата альфа-ЦГТ-азыПОХ.
Работа выполнялась в рамках государственного контракта с Федеральным Агентством по науке и инновациям от 28 марта 2005 г № 02.434.11.3007 по теме: ЖС-12.4/004 «Ферментные системы и технологии получения циклодекстринов».
Научная новизна работы. На основе анализа экспериментальных данных и выявленных зависимостей накопления бациллярным штаммом альфа-ЦГТ-азной активности от условий культивирования и выхода фермента, от параметров выделения и очистки, разработана биотехнология ферментного препарата альфа-ЦГТ-зы. Для создания основ биотехнологии альфа-ЦГТ-зы было произведено следующее:
Проведен экспресс-скрининг микроорганизмов, выделенных из различных видов почв и коллекций культур. Получен новый штамм-продуцент с высокой альфа-ЦГТ-азной активностью, одним из уникальных свойств которого является устойчивость к высоким концентрациям солей натрия.
На основании изучения совокупности морфологических, культуральных, физиолого-биохимических и филогенетических характеристик исследуемой культуры, новый галофильный штамм, продуцирующий альфа-ЦГТ-азу, идентифицирован как Paenibacillus тасегат 1АМБ.
В результате изучения физиолого-биохимических особенностей нового продуцента подобраны: оптимальный состав питательной среды и условия культивирования.
Установлено влияние микроэлементов и стимулятора роста полифенольной природы Гипоксена на накопление и активность альфа-ЦГТ-азы штамма Paenibacillus macerans 1АМБ, определены параметры его внесения в процессе культивирования.
На основании выявленных зависимостей накопления альфа-ЦГТ-азы в культуральной жидкости Paenibacillus macerans от условий культивирования и сохранения ее активности при концентрировании и очистке разработана технологическая схема получения ферментного препарата альфа-ЦГТ-азы ГЮХ.
Практическая значимость и реализация результатов работы.
В результате скрининга почвенных ЦГТ-активных изолятов бактерий создана лабораторная коллекция микроорганизмов, секретирующих альфа-специфичные ЦГТ-азы. На основе наиболее перспективного штамма коллекции Paenibacillus macerans IAMB разработана биотехнология получения препарата альфа-ЦГТ-азы ГЮХ. Разработаны паспорт штамма Paenibacillus macerans IAMB и Технические условия на ферментный препарат альфа-циклодекстринглюканотрансфераза ГЮХ. С учетом выявленных в лабораторных исследованиях зависимостей выхода ЦГТ-азы от условий выделения, концентрирования и сушки, разработан Лабораторный регламент по производству ферментного препарата альфа-циклодекстринглюканотрансферазы ГЮХ. Проведена наработка препаратов альфа- ЦГТ-азы различных степеней очистки (ГЗХ, ГЮХ) в условиях опытного производства. Полученные результаты подтверждены актом ОАО "Биохиммаш". Изучены термо- и рН стабильность экспериментальных партий препарата альфа- ЦГТ-азы, показавшие перспективность его использования для получения ЦД.
Подана заявка на выдачу патента РФ на штамм бактерий Paenibacillus macerans 1 АМВ- продуцент альфа-ЦГТ-зы.
Апробация работы. Основные положения работы докладывались на Российских и международных конференциях и симпозиумах: Всероссийской научно-технической выставке-конференции «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва 2005); На Третьем международном симпозиуме «Микробные биокатализаторы и перспективы развития ферментных технологий в перерабатывающих отраслях АПК» (Москва 2006).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, библиографического списка, включающего 205 источников, и 7 приложений. Работа изложена на 218 страницах машинописного текста, включает 51 таблицу и 21 рисунок.
