Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Пастереллёзы сельскохозяйственных животных 10
1.2. Бактериальные вакцины 12
1.3. Изготовление противопастереллёзных вакцин 16
1.4. Основные методы контроля качества инактивированных бактериальных вакцин 21
1.5. Заключение по обзору литературы 29
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 30
2.1. Материалы 30
2.1.1. Штаммы микроорганизмов 30
2.1.2. Питательные среды 30
2.1.3. Подопытные животные 30
2.1.4. Бактериологические краски 31
2.1.5. Растворы и реактивы 31
2.1.6. Оборудование 32
2.2. Методы 33
2.2.1. Методы изучения биологических свойств пастерелл 33
2.2.2. Определение количества живых микробных клеток 34
2.2.3. Световая микроскопия 35
2.2.4. Определение реактогенности масляного адъюванта 35
2.2.5. Изготовление опытных образцов вакцины 35
2.2.6. Определение физических и иммунобиологических свойств опытных образцов вакцины 36
2.2.7. Статистическая обработка результатов 38
3. Результаты собственных исследований 38
3.1. Основные биологические свойства контрольно - производственных штаммов пастерелл 38
3.2. Подбор режима глубинного культивирования пастерелл 43
3.3. Изучение инактивации P.multocida и P.haemolylica аминоэтилэтиленимином и формалином 45
3.4. Изготовление опытных образцов вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней и изучение их физических и иммунобиологических свойств 48
3.4.1. Физические свойства опытных образцов вакцины 48
3.4.2. Иммунобиологические свойства опытных образцов вакцины 50
3.4.2.1. Безвредность 50
3.4.2.2. Реактогенность 52
3.4.2.3. Изучение антигенных и иммуногенных свойств вакцины на лабораторных животных 53
3.4.2.4. Изучение антигенных и иммуногенных свойств вакцины на овцах 55
3.4.2.5. Изучение антигенных и иммуногенных свойств вакцины на свиньях 58
3.4.2.6. Изучение антигенных и иммуногенных свойств вакцины на крупном
рогатом скоте 60
3.5. Изготовление экспериментальных серий вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней инактивированной эмульсионной 63
3.6. Контроль качества вакцины 64
3.6.1. Определение основных физических и иммунобиологических свойств экспериментальных серий вакцины 66
3.7. Определение активности антигенов P.multocida и P.haemolylica в составе вакцины в процессе её хранения 67
3.8. Изучение эффективности применения вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней в условиях хозяйств 68
4. Обсуждение результатов исследований 69
5. Выводы 75
- Бактериальные вакцины
- Определение физических и иммунобиологических свойств опытных образцов вакцины
- Изучение инактивации P.multocida и P.haemolylica аминоэтилэтиленимином и формалином
Введение к работе
Актуальность темы. Пастереллёзы — различные по локализации и характеру течения инфекционные болезни сельскохозяйственных, домашних и диких животных, вызываемые бактериями рода Pasteurella (7).
Ведущее этиологическое значение в инфекционной патологии животных принадлежит двум видам: Pasteurella multocida и Pasteurella haemolytica (Mannheimia haemolytica) (29, 46, 59, 65, 125, 155).
P.multocida является возбудителем геморрагической септицемии животных, а также легочных пастереллезов, осложняющих респираторные инфекции вирусной и микоплазменной этиологии (120, 163).
P.haemolytica вызывает у крупного рогатого скота и овец всех возрастов пневмонии, а также септицемию новорожденных ягнят.
Эти два вида пастерелл могут выделяться у коров и свиноматок при абортах, у овец и коров - при артритах, у телят и ягнят - при артритах и других локальных патологических процессах (83, 187).
Одним из основных звеньев в системе мер борьбы с пастереллёзами является иммунопрофилактика.
В настоящее время ветеринария располагает значительным арсеналом вакцинных препаратов, различающихся по составу, технологии производства, способу применения и эффективности (13, 20, 31, 38, 42, 51, 116, 147).
Большинство противопастереллёзных вакцин выпускается в виде инактивированных формалином, сорбированных или эмульсионных препаратов.
Эмульсионные вакцины, используемые в животноводстве, превосходят по иммуногенности сорбированные, однако высокая вязкость и реактогеппость таких препаратов являются основной причиной, препятствующей их широкому применению на практике (3, 24, 32, 35, 71, 90, 94).
7 Исходя из вышеизложенного, достаточно актуален вопрос разработки новой инактивированнои эмульсионной вакцины против пастереллеза рогатого скота, лошадей и свиней, лишенной вышеуказанных недостатков.
Цель и задачи исследований. Основная цель данной работы состояла в разработке эффективной и удобной в применении вакцины против пастереллеза рогатого скота, лошадей и свиней инактивированнои эмульсионной.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- изучить биологические свойства штаммов Pasteurella multocida и
Pasteurella haemolytica;
- приготовить образцы антигенов пастерелл, инактивированных
аминоэтилэтиленимином;
- изготовить экспериментальные образцы вакцины против пастереллеза
рогатого скота, лошадей и свиней;
количественно охарактеризовать на лабораторных животных зависимость между дозой антигена в составе вакцины и защитой от летальной дозы возбудителя;
определить оптимальную иммунизирующую дозу, напряженность и
продолжительность иммунитета после применения вакцины на крупном
рогатом скоте и овцах. ".'
Научная новизна работы. В результате проведённых исследований:
- установлена высокая антигенная и иммуногенная активность антигенов
P.multocida и P.haemolytica, инактивированных аминоэтилэтелепимпном, в
составе вакцины против пастереллеза рогатого скота, лошадей и свиней;
на лабораторных животных количественно охарактеризована зависимость между дозами антигенов в составе вакцины, титрами антител и защитным эффектом препарата;
- установлена оптимальная концентрация антигенов P.mulloeida и
P.haemolytica в прививной дозе вакцины против пастереллёза рогатого скота,
лошадей и свиней;
- обоснована целесообразность использования белых мышей в качестве
модели для оценки иммуногенности вакцины против пастереллёза рогаюго
скота, лошадей и свиней;
разработаны методы контроля и применения вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней.
Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований использованы при разработке нормативно-технической документации на получение и применение «Вакцины против пастереллёза рогатого" скота, лошадей и свиней инактивированнои эмульсионной» (Утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 7 апреля 2004
г.).
Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ ВНИИЗЖ 30 сентября.2004 г. "Методические рекомендации по глубинному культивированию бактерий Pasteurella haemolytica" и «Методические рекомендации по инактивации бактерий Pasteurella haemolytica аминоэтилэтиленимином».
Основные положения, выносимые на защиту:
инактивированная эмульсионная вакцина против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;
оптимальная иммунизирующая доза антигена в вакцине против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;
результаты изучения физических свойств вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;
9 - результаты изучения иммунобиологических свойств вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней.
Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на:
Международной научной конференции молодых ученых "Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных", Владимир, 24-26 марта 2004 г.
Международной научно-практической конференции «Болезни диких животных», Покров, 28-30 сентября 2004 г.
Публикации. По материалом диссертации опубликовано 4 научные работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и приложения. Список использованной литературы включает 190 источников, в том числе 106 работ зарубежных исследователей. Работа иллюстрирована 1 рисунком и 19 таблицами. В приложении представлены копии документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 2002 - 2004 г.г. в ФГУ Федеральный центр охраны здоровья животных (ФГУ ВНИИЗЖ).
Бактериальные вакцины
Великий французский ученый Луи Пастер по праву является основоположником иммунологии, так как он впервые обосновал принцип вакцинации и способы создания вакцин. Основываясь на принципах Пастера и базируясь на достижениях теоретической и практической микробиологии, создано огромное количество бактериальных вакцин, которые широко используются в ветеринарии и без которых немыслим прогресс в борьбе с инфекционными болезнями животных (16). Вакцины активно и специфично воздействуют на иммунную систему, стимулируя развитие противоинфекционного или антитоксическою иммунитета (166).
Вакцинные препараты за последние сто с небольшим лет претерпели огромные изменения, пройдя путь от аттенуированных и убитых вакцин времен Пастера до современных генноинженерных и синтетических вакцин.
Живые вакцины - это те, которые содержат микроорганизмы с пониженной вирулентностью, способные размножаться в организме животного, не вызывая явных признаков болезни и не передаваясь при контакте (70, 180). При этом индуцируется иммунитет, напряженность которого ниже, чем при естественном переболевании (150, 151).
Инактивированные (убитые) вакцины целесообразно разделить на корпускулярные (цельноклеточные и субклеточные) и молекулярные. Корпускулярные вакцины являются более "древними" и традиционными для ветеринарии вакцинами. Для их получения используют инактивированные физическим или химическим способом цельные микробные клетки, а также извлеченные из них надмолекулярные структуры, содержащие протективные антигены. Иногда вакцины из надмолекулярных комплексов микробной клетки называют "химическими" вакцинами, что конечно является условным.
Корпускулярные вакцины, несмотря на наличие в их составе балластных веществ микробной клетки, которые могут вызывать побочные реакции, широко используются в ветеринарной практике при иммунизации против пастереллёза, лептоспироза, сальмонеллеза, эшерихиоза и других инфекций.
Молекулярные вакцины содержат антиген в молекулярном виде. Такие вакцины получают тремя способами (21): 1. Путём выращивания природных штаммов микробной клетки, в том случае когда в процессе культивирования синтезируется специфический антиген в молекулярном виде (таким способом биосинтеза получают столбнячный и ботулиновый токсины, которые затем превращаются путём обезвреживания формалином и теплом в анатоксины 14 молекулярные растворимые антингены; 2. Химическим синтезом антигенов, то есть специфических пептидов бактерий, аналогичных по своей структуре и свойством природным антигенам микробов; 3. Биосинтезом молекул целевого антигена при культивировании искусственно созданных генно-инженерным способом рекомбинантных штаммов микробов.
На основе молекулярных антигенов возможно конструирование вакцин с повышенной иммуногенностью, лишенных балластных веществ микробной клетки. В качестве реципиента генов при создании рекомбинантных штаммов в последние годы стали использовать вакцинные штаммы сальмонелл (21).
Бактериальные вакцины хорошего качества должны удовлетворять следующим требованиям: предотвращать появление заболевания у вакцинированных животных; блокировать или снижать репликацию возбудителя инфекции в организме; стимулировать удаление из организма возбудителя инфекции и выздоровление; препятствовать или снижать персистенцию возбудителя; предотвращать развитие или уменьшать тяжесть осложнений после инфекции, предупреждая или снижая экономический ущерб; предотвращать распространение возбудителя в окружающей среде; предупреждать передачу инфекции невакцинированным (вакцинированным) контактным животным; у маток защищать потомство через колостральные антитела в течение первых недель жизни; продолжительность иммунитета после вакцинации должна быть по меньшей мере полгода (181).
Живые и инактивированные вакцины создают активный иммунитет против содержащихся в них антигенов. В то же время они имеют ряд недостатков. У живых вакцин они следующие: процесс аттенуации инфекционного агента длительный и трудоёмкий, к его окончанию можно не добиться длительного серийного размножения или полного понижения вирулентности; существует опасность реверсии к "дикому типу"; необходимо контролировать, что аттенуация полная и вакцина не содержит вирулентный агент; живые вакцины могут вызывать латентную инфекцию с бактерионосительством до 6-8 мес, а отсутствие у вакцинных штаммов надежных генетических маркеров затрудняет диагностику соответствующей болезни; необходимо хранить вакцины при температуре, близкой к нулю.
Инактивированным вакцинам присущи следующие недостатки: использование в производстве этих препаратов вирулентных штаммов требует постоянного и строгого контроля за полнотой инактивации, чтобы воспрепятствовать попаданию в вакцину живых микроорганизмов; инактивированные вакцины стимулируют обычно гуморальный иммунитет; короткая продолжительность иммунитета; необходимость использования адъювантов, которые не всегда безвредны для животного; некоторые инактивирующие агенты могут быть токсичны для организма, а вакцины иногда индуцируют анафилактические реакции (70).
Живые вакцины создают более напряжённый и продолжительный иммунитет, чем убитые. Однако последние после нескольких ревакцинаций также могут индуцировать напряженный и продолжительный иммунитет.
Определение физических и иммунобиологических свойств опытных образцов вакцины
При изучении культурально-морфологических свойств контрольно-производственных штаммов пастерелл определяли типичность роста, морфологию, подвижность, способность к капсулообразованию.
Установлено, что рост в жидкой питательной среде в первые 16-18 ч культивирования при 37С сопровождался слабым помутнением среды. Через 36 ч происходило просветление среды и выпадение осадка на дно пробирки, поднимающегося при встряхивании в виде косички.
На сывороточном агаре пастереллы росли в виде прозрачных, средней величины, округлых с ровными краями колоний слизистой консистенции, серого цвета, а на кровяном агаре в виде мелких, выпуклых колоний, круглой формы. P.multocida гемолиза не вызывала, тогда как P.haemolytica формировала колонии с зоной гемолиза, которая лучше просматривалась после снятия колоний с кровяного агара.
На МППА рост наблюдали по уколу иглы в виде беловатого стержня. Окружающая среда при этом оставалась прозрачной.
В мазках из культур при окраске по Граму пастереллы имели виді грамотринательных овоидов или коккобактерий, расположенных одиночно или попарно. В мазках - отпечатках из паренхиматозных органов павших или вынужденно убитых животных бактерии имели вид биполяров (концевые участки микробных клеток интенсивно окрашены).
Все штаммы пастерелл формировали капсулу, выявляемую при окрашивании по Бури - Гинсу.
Изучение ферментативных свойств показало, что все штаммы пастерелл не свертывают молоко, не разжижают желатин, редуцируют нитраты, ферментируют глюкозу, маннозу, сахарозу с образованием кислоты без выделения газа.
Серовариантную принадлежность P.multocida определяли по капсульному антигену в РНГА и соматическому антигену в РА.
Патогенность пастерелл оценивали в опытах на лабораторных и естественно восприимчивых животных, определяя минимальные дозы микробных клеток, вызывающих гибель или заболевание 50% животных в опыте (таблица 1.).
Из данных таблицы видно, что использованные в опытах штаммы пастерелл патогенны для лабораторных животных.
Течение экспериментального пастереллёза у мышей, и кроликов зараженных P.multocida штамм №1231 серогруппа А и штамм №656 серогруппа В характеризовалось отсутствием клинических признаков заболевания. Животные погибали в течение 12-72 ч.
Изучение инактивации P.multocida и P.haemolylica аминоэтилэтиленимином и формалином
Основным звеном при разработке и производстве инактивированных вакцин является инактивация инфекционной активности микроорганизмов при сохранении их иммуногенных характеристик. Целью данного этапа исследований было изучение инактивации P.multocida на модели штамма №1231 и P.haemolytica на модели штамма №169 аминоэтилэтиленимином и формалином. Эксперименты начаты с определения концентрации инактиванта, обеспечивающего гибель 50% пастерелл (79).
Для определения К5о инактиванты вносили в концентрациях 0,0625%; 0,125%; 0,25%; 0,5%; 1%; 2% и 4%. Концентрация микробных клеток в бактериальной суспензии составляла 10 млрд.м.к./см по стандарту мутности. Через 1, 3, 6, 12 и 24 ч экспозиции в термостате исследуемые образцы в дозе 0,1 см высевали на пенициллиновые флаконы с 1 см кровяного агара. Результаты инактивации оценивали через 48 ч инкубирования посевов при 37С по отсутствию характерного для пастерелл роста. Полученные данные представлены в таблицах 6, 7. Проведённые исследования показали, что инактивация пастерелл формалином идёт быстрее, чем аминоэтилэтиленимином.
Как видно из таблицы 6, инактивация P.haemolytica происходила при концентрации аминоэтилэтиленимина не ниже 0,25%, а при 0,125% наблюдался характерный рост P.haemolytica.
Аналогичные результаты получены и для P.multocida штамм № 1231. Формалин вызывал гибель бактерий при концентрации 0,0625% в течение 1-3 ч (таблица 7).
Исходя из полученных данных (табл. 6, 7), с учетом времени инактивации рассчитали концентрации инактивантов (К5о), обеспечивающие 50%-ную гибель бактерий P.multocida штамм №1231 и P.haemolytica штамм №169 по формуле Кербера - Ашмарина (6).
