Введение к работе
Актуальность темы Несмотря на то, что грипп известен в мире с XIX века он остается одной из наиболее важных проблем в плане эпидемиологии, эпизоотологии болезней животных и человека, периодически вызывая опустошительные эпизоотии, эпидемии и пандемии.
Грипп птиц - острая вирусная высококонтагиозная болезнь, поражающая многие виды сельскохозяйственной, домашней, синантропной и дикой птицы. Возбудителем гриппа является РНК-содержащий вирус семейства Ortomixoviridae. Из трёх существующих типов вируса гриппа А, В и С, тип А является наиболее распространенным. Вирус гриппа птиц относится к типу А.
Схема диагностики гриппа птиц включает комплекс методов, направленных на выделение вируса и его идентификацию с использованием реакций диффузионной преципитации (РДП), связывания комплемента (РСК), нейтрализации (РН), торможения гемагглютинации (РТГА) и иммунофер-ментного анализа (ИФА), методов ПЦР-диагностики.
Классификация гриппа типа А основывается на антигенных различиях поверхностных гликопротеинов - гемагглютинина и нейраминидазы. В настоящее время установлено 16 подтипов вируса гриппа птиц по гемагглюти-нину и 9 подтипов по нейраминидазе. Наиболее патогенными считаются 5 и 7 подтипы, вызывающие опустошительные эпизоотии, хотя не все штаммы этих подтипов являются высоковирулентными для птиц. С 1996 г. отмечена межвидовая передача «птичьих» штаммов гриппа людям: H7N7 (Великобритания, 1996), H7N3 (Чили, Канада, 2004), H5N1 (Гонконг, 1997).
Определение подтиповой принадлежности вируса гриппа проводят в РДП, РТГА и реакции ингибирования нейраминидазной активности. В последние годы разработаны и применяются тест-системы определения подтипа на основе анализа нуклеотидной последовательности гена НА и NA (ПЦР, ОТ-ГЩР, ПЦР в реальном времени).
В настоящее время для диагностики большинства инфекционных болезней широкое применение нашли различные методы иммуноферментного анализа (ИФА). В основе принципиальных достоинств ИФА лежат строгая специфичность взаимодействия антител с антигеном и мощное усиление хи-
мических реакций ферментами. Основными достоинствами метода твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) являются высокая чувствительность, минимальные затраты антигенов и антител, исключение субъективизма и возможность количественной оценки в интерпретации результатов, автоматизация рабочего процесса, а следовательно, большая производительность метода.
Методы ИФА основаны на применении в качестве реагента как поли-так и моноклональных антител, выбор между которыми осуществляется в зависимости от соответствия специфичности антител требованиям теста.
Разработанный в 1975 г. Kohler и Milstein метод получения моноклональных антител (МКА) заданной специфичности открыл новую эру в биологической науке. С тех пор МКА завоевали прочные позиции в качестве мощного инструмента исследований в ветеринарии, медицине, молекулярной биологии и генетике. Являясь реагентами направленного действия, МКА позволяют идентифицировать отдельные эпитопы в сложных композициях антигенных структур.
В связи с вышеизложенным разработка вариантов иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител, специфичных к подтиповым антигенным детерминантам гемагглютинина, является актуальной и представляет значительную ценность для создания новых высокоэффективных методов как непосредственного выявления и типирования антигенов вируса, так и мониторинга гриппа птиц.
Поэтому представляется целесообразным проведение работы по получению МКА, специфичных к антигенным детерминантам гемагглютинина высокопатогенных подтипов вируса гриппа птиц (Н5 и Н7) и разработке на их основе средств, методов диагностики и субтипирования вируса.
Цель и задачи исследования Целью наших исследований являлась разработка и усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики гриппа птиц на основе моноклональных антител, специфичных к антигенным детерминантам гемагглютинина 5 и 7 подтипов.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
L Получить моноклональные антитела, специфичные к гемагглютини-нам 5 и 7 подтипов вируса гриппа птиц.
Изучить основные иммунохимические свойства полученных моно-клональных антител, специфичных к гемагглютининам 5 и 7 подтипов вируса гриппа птиц.
Разработать и испытать различные варианты иммуноферментного анализа на основе полученных моноклональных антител для обнаружения и дифференциации гемагглютининов 5 и 7 подтипов и антител к ним.
Изучить циркуляцию антител к гемагглютининам 5 и 7 подтипов у различных видов дикой и синантропной птицы на территории РФ.
Научная новизна исследований Получены клоны гибридных клеток, которые секретируют МКА, специфичные к гемагглютинину Н5 и Н7 вируса гриппа птиц.
Установлено, что антигенные детерминанты вируса гриппа птиц, распознаваемые моноклональными антителами, специфичными к гемагглютинину 5 и 7 подтипов вируса гриппа птиц, являются подтипоспецифическими и позволяют определять подтип Н5, Н7 или смесь подтипов в экстраэмбриональных, культуральных жидкостях и суспензии проб органов птиц, зараженных вирусами гриппа птиц подтипов Н5 и Н7. На основе полученных моноклональных антител разработаны прямой гистохимический метод ИФА и «сэндвич»-вариант ТФ ИФА для обнаружения, идентификации и субтипиро-вания вируса гриппа птиц.
Практическая значимость результатов Депонированы в коллекции гибридом ГНУ ВНИИВВиМ 2 клона гибридом (4А6 и ЗВЗ) синтезирующие моноклональные антитела к гемагглютинину Н5 и 2 клона (1D3 и 2Н7) к гемагглютинину Н7 вируса гриппа птиц.
Разработан метод выявления гемагглютининов вируса гриппа А птиц 5 и 7 подтипов в пробах органов больной и павшей птицы, экстраэмбриональной жидкости инфицированных эмбрионов кур, при выделении вируса на этой модели, прямым «сэндвич» - вариантом ТФ ИФА.
Разработан метод выявления гемагглютининов вируса гриппа птиц 5 и 7 подтипов в пробах органов больной и подозреваемой в заражении птицы
иммуногистохимическим (ИГХ) методом на монослое перевиваемой линии клеток ПСГК.
Разработаны Методические рекомендации по выявлению антигенов вируса гриппа птиц 5 и 7 подтипов прямым «сэндвич» - вариантом ТФ ИФА на основе моноклональных антител.
Апробация и публикация результатов Результаты исследований, выполненных по теме диссертационной работы, доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ (2005-2007 г.г.), научно-практической конференции (Улан-Удэ, 2008г.), международных научно-практических конференциях (Щелково, 2006; ГНУ ВНИИВВиМ, 2008г.).
По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 1 статья в журнале «Ветеринария».
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту
L Характеристика новых клонов гибридом, стабильно секретирующих моноклональные антитела к антигенным детерминантам гемагглютинина 5 и 7 подтипа вируса гриппа птиц.
Результаты разработки различных вариантов твердофазного имму-ноферментного анализа на основе полученных моноклональных антител для выявления гемагглютинина 5 и 7 подтипов вируса гриппа птиц.
Результаты серологического мониторинга гриппа птиц в популяциях дикой и синантропной птицы в различных субъектах РФ.
Личный вклад соискателя Представленные в диссертационной работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выполнении работы по отдельным этапам работы оказывали практическую и консультативную помощь сотрудники ГНУ ВНИИВВиМ: к.б.н. Е.Г. Анохина, к.в.н. О.В Капустина.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 158 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение, выводы, дополнена
приложением. Список литературы включает 212 источников. Работа иллюстрирована 16 рисунками, 23 таблицами и 2 схемами.
