Введение к работе
Актуальность проблемы. Генная терапия различных заболеваний является одним из наиболее перспективных путей развития современной медицины и биотехнологии. Большинство одобренных генно-терапевтических протоколов основано на использовании вирусных векторов для доставки "лечебных генов". Перспективно использование ретровирусных векторов, способных встраивать вносимую ДНК в клеточный геном. Встраивание ДНК осуществляется вирусным ферментом интегразой (ИН), которая сиквенс-специфично взаимодействует с вирусной ДНК, но не проявляет сиквенсных предпочтений при связывании клеточной ДНК. В ходе интеграции ИН взаимодействует с рядом клеточных белков, формируя прединтеграционный комплекс (ПИК), белки которого приводят интеграцию в определенные области генома. Так, показано, что ВИЧ-1 склонен интегрироваться в транскрибируемые гены, а вирус лейкемии мышей (MLV) - в участки старта транскрипции. Эти особенности интеграции ретровирусов несут в себе опасность инсерционного мутагенеза: «выключения» генов или активации онкогенов. И действительно, отмечены случаи возникновения онкологических заболеваний у пациентов, которые подвергались генной терапии с использованием ретровирусных векторов. Таким образом, очевидно, что необходима разработка методики, обеспечивающей направленность интеграции таких векторов в безопасные участки генома. Также актуален вопрос, какой именно ретровирус выбрать в качестве основы для создания генно-терапевтических векторов. Основным приемом при разработке систем направленной интеграции является присоединение к ИН белкового домена, обладающего сайт-специфической ДНК-связывающей активностью. Однако до сих пор не было предложено ни одной системы, способной направлять интеграцию ДНК в безопасный сайт в человеческом геноме.
Перспективными векторами для генной терапии считаются спумаретровирусы (СВ). Представители этого подсемейства способны заражать человека, не вызывая патологического эффекта. Векторы на основе СВ размножаются в большом наборе клеточных культур, и, в частности, эффективно вводятся в гематопоэтические линии. Известно, что СВ векторы не демонстрируют опасных предпочтений в интеграции, свойственных для векторов на основе MLV и ВИЧ-1. Тем не менее, ИН СВ еще не использовалась для разработки систем направленной интеграции. Самым хорошо исследованным представителем подсемейства СВ является вирус PFV (prototype foamy virus), в силу чего именно этот вирус целесообразно использовать для первой попытки разработать систему направленной интеграции на основе СВ.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлась разработка системы для направленной интеграции ДНК на основе гибрида ИН PFV и белка, способного
специфично связываться с безопасным участком в геноме человека. В ходе работы необходимо было решить следующие задачи:
охарактеризовать ДНК-связывающую и каталитическую активности ИН PFV;
провести дизайн и конструирование нового белка, способного направить интеграцию в безопасный участок в геноме человека;
создать систему направленной интеграции на основе гибрида ИН PFV и сконструированного белка и оценить способность этой системы направлять интеграцию в сайт узнавания этого белка в плазмидной ДНК in vitro.
Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе впервые изучена роль металла-кофактора в процессе интеграции короткого ДНК-субстрата ИН PFV
2+
в плазмидный вектор и показано, что в присутствии Mg значительно увеличивается выход продукта согласованной интеграции. Изучено влияние модификации ДНК-субстрата ИН PFV на эффективность реакции З'-процессинга и выявлены нуклеотиды, с которыми сближены остатки лизина каталитического домена ИН PFV. Исследовано влияние коротких о дно цепочечных олигонуклеотидов на активность ИН PFV в реакции З'-процессинга, и показано, что для них характерен двухсайтовый механизм связывания, обеспечивающий концентрационно-зависимую активацию, а затем ингибирование ИН.
Впервые предложено направлять интеграцию в участок длиной 18 п.о. в гене лейциновой тРНК. Синтезирован de novo ген белка tRL18, состоящего из шести доменов «цинковые пальцы» и способного специфически связывать выбранный участок. Выделен белок tRL18, сконструирован набор гибридных белков на основе tRL18 и интеграз PFV и ВИЧ-1, проведена характеристика этих белков. Исследована способность гибридных белков направлять интеграцию ДНК в плазмидный вектор, содержащий сайт узнавания iRL18, in vitro и показано, что гибридные белки на основе ИН PFV обеспечивают иной профиль интеграции, чем ИН дикого типа: снижение частоты интеграции в сайт узнавания iRL18 и повышение частоты интеграции в участки, непосредственно прилегающие к сайту.
Систему направленной интеграции, сконструированную и опробованную в данной работе, можно рассматривать как основу для создания генно-терапевтических векторов на основе PFV.
Публикации и апробация работы. По материалам работы опубликовано 4 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах. Результаты работы были доложены на следующих конференциях: международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам «Ломоносов-2006», секция «Биология» (Москва, 12-15 апреля 2006 г.); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая 2008 г.); 14і International Conference "Microbial enzymes in biotechnology and medicine" (Казань, 2009 г.); VIIIth European symposium of Protein society (Цюрих, Швейцария, 14-18 июня 2009 г.); the EMBO Meeting 2010 (Барселона, Испания, 4-7 сентября 2010 г.); Ist International Interdisciplinary Conference "Modern problems in systemic
regulation of physiological functions" (Сафага, Египет, 10-21 декабря 2010 г.); the EMBO Meeting 2011 (Вена, Австрия, 10-13 сентября 2011 г.).
Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 140 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 37 рисунками и 9 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 230 цитированных работ.
