Введение к работе
Актуальность проблемы.
Использование бактерий в промышленном производстве биологически активных веществ (витаминов, антибиотиков, гормонов, аминокислот), органических кислот и биокатализаторов насчитывает более чем 50-ти летнюю историю, и в настоящее время объем микробных биотехнологических производств продолжает расти (Demain A.L., Adrio J.L., 2008). При этом, перед современной биотехнологией стоят такие задачи как расширение спектра производимых веществ и используемых субстратов, создание более рентабельных и экологичных технологий производства. Решение этих задач требует не только улучшения свойств существующих продуцентов, но и поиск новых микроорганизмов, обладающих определенными преимуществами и биотехнологическим потенциалом. Более того, относительная доступность секвенирования бактериального генома и наличие целого пакета компьютерных программ, позволяющих реконструировать метаболические пути, опираясь только на нуклеотидную последовательность генома, обеспечивает достаточно большой объем начальной информации о метаболизме вновь отобранного организма. С другой стороны, накопленный опыт, а также данные, полученные на базе современных экспериментальных и аналитических методов исследования метаболизма (анализ распределения и контроля потоков, анализ уровня экспрессии генов, компьютерное моделирование и т.д.) однозначно указывают на необходимость тонкой настройки метаболизма для обеспечения высокоэффективного синтеза интересующего продукта бактериальными клетками. Успех в создании высокоэффективного штамма зависит не только от физиологических особенностей организма, но и от возможности быстро конструировать необходимые генетические модификации. Для решения этой задачи необходим удобный генно-инженерный инструментарий, позволяющий создавать бесплазмидные, безмаркерные штаммы, штаммы, несущие множественные мутации, модулировать уровень экспрессии целевого гена и интегрировать протяженные фрагменты ДНК в хромосому. Наиболее подробно подходы для подобных генетических манипуляций ранее были разработаны для Escherichia coli {Peredelchuk M.Y., Bennett G.N., 1997; Каташкина Ж. И., 2003; Meynial-Salles I. et al, 2005; Каташкина Ж.И. и dp, 2005; MinaevaN.I. et al, 2008). Основу этих методов составляет использование систем гомологичной (Red) и сайт-специфической рекомбинации фага L Однако, несмотря на кажущуюся простоту Red-системы, включающей всего 3 фаговых гена, и подробное изучение механизма Red-зависимой рекомбинации, до сих пор этот чрезвычайно эффективный метод генной инженерии, первоначально разработанный для Е. coli К12, удавалось использовать только в ряде патогенных штаммах Е. coli и некоторых штаммах Salmonella, Erwinia, Yersinia и Pseudomonas. Поэтому расширение
рамок применимости известных методов генной инженерии для манипулирования геномами новых потенциальных продуцентов является актуальной и практически значимой задачей.
Цели и задачи работы.
Целью данной диссертационной работы является адаптация высокоэффективного генно-инженерного инструментария, разработанного в настоящее время для Е. coli, для использования в клетках близкородственного организма Pantoea ananatis. В ходе работы решались следующие задачи:
адаптация Red-зависимой системы гомологичной рекомбинации фага X для создания целенаправленных модификаций (делеций, замен регуляторных областей, точечных мутаций) в хромосоме P. ananatis;
разработка инструментария для конструирования штаммов Р. ananatis, содержащих множественные модификации хромосомы;
создание охарактеризованной библиотеки промоторов для обеспечения плавного изменения уровня экспрессии целевых генов в Р. ananatis;
Научная новизна и практическая значимость работы.
В ходе адаптации X Red-зависимой системы рекомбинации фага X Е. coli для целенаправленной модификации хромосомы близко родственного организма P. ananatis была выявлена токсичность одновременной экспрессии X Red-генов для клеток данной бактерии. В ходе работы был отобран мутантный штамм P. ananatis, устойчивых к экспрессии генов X Red-системы. Использование данного штамма в качестве реципиента позволяет интегрировать линейные двуцепочечныые фрагменты ДНК в хромосому Р. ananatis с частотой не меньшей, чем в Е. coli К12. Было показано, что одновременная экспрессия X gam и bet генов не приводит к токсическому эффекту, что позволяет использовать данные гены для модификации хромосомы штамма дикого типа с помощью олигонуклеотидов.
Для P. ananatis были адаптированы процедура переноса маркированных мутаций с помощью электропорации геномной ДНК и X Int/Xis-зависимая система сайт-специфицеской рекомбинации для вырезания селективного маркера после его использования, что позволяет конструировать штаммы со множественными модификациями. Была разработана двухстадийная методика создания целенаправленных точечных мутаций в хромосоме P. ananatis с использованием гена sacB Bacillus subtilis в качестве контр-селективного маркера. Данная методика находит применение в решение задач белковой инженерии. Была получена и охарактеризована библиотека Рис-подобных промоторов узнаваемых РНКП P. ananatis для плавного варьирования уровня экспрессии целевых генов в данном организме.
Совокупность разработанных методов активно применяется в работе НИИ «Аджиномото-Генетика» и позволяет быстро и эффективно решать как прикладные задачи по конструированию штаммов-продуцентов на базе Р. ananatis, так и задачи по изучению метаболизма данной бактерии.
Публикации и апробация работы.
По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, из них 2 в журналах, рекомендованных ВАК, 1 патентная заявка и 1 материалы научной конференции. Материалы диссертации докладывались на конкурсе работ сотрудников ЗАО «АГРИ» (июнь 2006).
Диссертационная работа была апробирована на совместном семинаре секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП ГосНИИгенетика и НТС ЗАО «АГРИ» 9 марта 2010 года.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из 6 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждения», «Выводы» и «Список цитируемой литературы». Работа изложена на_ /ИЗ .страницах, включая к-рисунков и у таблиц. Список цитируемой литературы содержит<*Й-источника, в том числе 3~на русском языке.
