Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 4-7
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
Глава I. Физико-химические свойства интерферона и его применение в клинике 9-20
Глава 2. Методы очистки и определения биологической активности интерферона 21 — 27
А. Методы определения антивирусной активности интерферона 21-22
Б. Методы очистки интерферона 22-27
Глава 3. Механизм индукции и биологического действия интерферонов 28—43
A. Индукция интерферона 28-33
Б. Современные представления о механизме действия интерферона 34-41
B. Схема антивирусного действия та терферона 41—43
Глава 4. Нуклеазная активность препаратов ин терферона 44-46
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 47-122
Глава 5. Методы исследования 47-5В
Глава 6. Условия протекания рибонуклеазной реакции препаратов лейкоцитарного
интерферона человека 59- 70
Глава 7. Характеристика свойств рибонуклеазной активности препаратов лейкоцитарного интерферона человека 71
Глава 8, Гель-фильтрация на колонке с Сефадексом G-50 продуктов рибонуклеазной реакции препаратов лейкоцитарного интерферона человека 84-88
Глава 9. Электрофорез в геле как метод сравнительного исследования рибонуклеазной и антивирусной активности 89 — III
Глава 10.Сравнение рибонуклеазной и антивирусной активности в одних и тех же препаратах лейкоцитарного интерферона человека 112 - 122
ОБСУЖДЕНИЕ 123-135
ВЫВОДЫ 136-137
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
В 1957 ГОДУ Айзеке И Лшщенман ( Isaacs,Lindenman , 1957) впервые описали интерферон как противовирусный агент. К настоящему времени известно, что это вещество имеет несколько аспектов действия, важнейшими из которых являются противовирусная антиклеточная, иммуномодулирующая и радио-протекторная функция. Как считают многие исследователи, "интерферон от носится к классу генетически детерминированных индуцибельных белков, синтезируемых клетками позвоночных и осуществляющих широкие контрольно регуляторные функции, направленные на сохранение клеточного гомвостаза" (Ершов Ф.й., Аскарходжаев Н.А., 1980). В 1979 году найдены интерфероноподобные белки - ингибиторы вирусов в листьях растений (Ladygina et al. , 1979), что указывает на общность механизмов антивирусной зашиты и универсальность системы интерферона.
Противовирусное действие интерферона изучается со време ни его открытия и количество исследований, посвященных этой проблеме, неуклонно возрастает. Во всех работах отмечается эффективность применения интерферона при вирусных инфекциях, как в эксперименте, так и в клинике.
Изучение влияния интерферона на иммунную систему организма получило свое развитие с совершенствованием методов очистки препаратов. Только в последнее время удалось доказать, что сложное и многоплановое влияние интерферона на иммунную систему является свойством самой молекулы интерферона, а не его примесей. В большом количестве работ приводятся данные о противоопухолевом действии интерферона и акцентируется внима ние исследователей на возможности использования этого эффекта При лечении раковых заболеваний (Finter.Fantes , 1981).
Несмотря на ту особую роль, которую играет интерферон в лечении вирусных инфекций, являясь практически единственным известным антивирусным фактором естественного происхожу дения, механизм его действия до конца не изучен. За последние годы достигнуты значительные успехи в очистке препаратов интерферона, исследовании их структуры и механизма антивирусной защиты. Обнаружена индукция в клетках, обработанных интерфероном, специфических белков, опосредующих его противовирусное действие в присутствии двуспиральных РНК, В то же время, многие вопросы, связанные с изучением биохимии и молекулярной биологии интерферона, остаются до настоящего времени нерешенными,
В процессе индукции интерферона и его действия, по-видимому, происходит активация целой группы клеточных ферментов (Kerr et al.,1974,1977; Kimchi et al.,1979; Raj, Pitha,1980).
Однако вопрос о ферментативных свойствах самого интерферона не подвергался подробному изучению, В литературе имеется несколько работ, посвященных нуклеазной активности, найденной в препаратах различных интерферонов, которые носят противоречивый характер, С одной стороны, сообщается о наличии РНК-азы в
Препаратах высокоочищенного мышиного Интерферона ( Graziadei, 1973) и о бесплодности попыток отделить ДНК-азу, содержащуюся в препаратах куриного интерферона, от его антивирусной активности ( Taylor-Papadimitriou et al. , 1971), С ДРУГОЙ СТОРОНЫ, В работах последних лет ( Karpetsky et al. , 1979, Winchurch et al. f 1977) приводятся данные о том, что не обнаружено активности рибонуклеази в высокоочищенных препаратах лейкоцитарного и лимфобластоидного интерферона человека.
Работа, начатая нами до опубликования данных, относящихся к рибонуклеазной активности в препаратах интерферона человека, базировалась на результатах, полученных при изучении пря мого действия препаратов интерферона на нуклеиновые кислоты вирусов (Иванова Н.А., Поляк Р.Я,, 1966 а,б) и данных об успешном применении нуклеаз в лечении заболеваний вирусной этиологии (Салганик и др., 1964-1969). Учитывая то, что нуклеазы играют значительную роль в опосредовании механизма действия интерферона, а также то,что даже в качестве примесей они могут принимать участие в проявлении антивирусной активности препарата, так как сами обладают подобным действием, представляло определенный интерес изучение рибонуклеазной активности в препаратах интерферона лейкоцитов человека, которые наиболее широко применяются при лечении различных заболеваний»
Цель исследования Целью настоящей работы явилось изучение вопроса о наличии нуклеазной активности в различных препаратах лейкоцитарного интерферона человека, выявление ряда свойств фермента и характера его действия.
Основные задачи исследования. Основными задачами, поставленными при выполнении данной работы, явились следующие:
1. Выбор оптимальных условий проведения ферментативной реакции, а также изучение влияния ряда воздействий на РН&»азу, содержащуюся в препаратах лейкоцитарного интерферона человека.
2, Выяснение эндо или экзонуклеазного характера действия рибонуклеазы препаратов лейкоцитарного интерферона человека с целью сравнения с ферментами, найденными в препаратах интерферона из других источников.
3 Изучение вопроса о возможности разделения рибонуклеазной и антивирусной активности в препаратах лейкоцитарного интерферона человека, а также сравнение этих двух видов активности в одних и тех же препаратах - 7 Основные положения диссертации. В ходе экспериментов были получены следующие основные результаты:
1. В препаратах лейкоцитарного интерферона человека» в том числе и высокоочищенных, обнаружена эндонуклеазная РНК-азная активность с оптимумом рН 7,0 7,5.
2. Исследован ряд свойств фермента и показано, что по многим параметрам он сходен с панкреатической РНК-азой.
3. Усиление антивирусного действия препаратов сопровождается обычно и возрастанием в них рибонуклеазной активности, а контрольные препараты интерферона не содержат фермента.
4. Электрофорез в полиакриламидном геле в различных модификациях препаратов лейкоцитарного интерферона человека пока » зал частичное, а в ряде случаев - полное совпадение этих двух активностей. Это позволило сделать вывод, что по крайней мере часть рибонуклеазной активности тесно связана с молекулами интерферона.
Новизна и практическая значимость. В работе впервые подробно исследованы свойства рибонуклеази, обнаруженной в препаратах лейкоцитарного интерферона человека различной степени очистки и концентрации. Положения, приведенные выше, позволяют считать целесообразным дальнейшее исследование взаимодействия антивирусной и рибонуклеазной активностей препаратов лейкоцитарного интерферона человека, учитывая, что нуклеазная активность играет роль в опосредовании его действия и что сама нуклеаза способна оказывать противовирусный эффект. Метод определения РНК-азы в препаратах интерферона в качестве предварительного теста на присутствие в нем антивирусной активности может быть внедрен в научную практику. Полученные результаты можно в будущем использовать для более детального исследования механизма взаимодействия ИЖ-азной и антивирусной активности препаратов интерферона.
