Введение к работе
Актуальность работы. Одной из важнейших проблем современной медицины является возникновение и распространение штаммов патогенных бактерий, устойчивых к антибиотикам. Количество инфекций, плохо поддающихся терапии антибиотиками, растет во всех развитых странах. Помимо очевидных мер, таких как контроль за применением антибиотиков и соблюдение правил больничной гигиены, главным способом борьбы с устойчивыми бактериями является применение новых лекарственных средств. До недавнего времени в качестве основного подхода к разработке новых антибактериальных агентов фармацевтические компаний применяли модификацию уже используемых антибиотиков. Однако этот подход теряет эффективность, поскольку бактерии быстро вырабатывают устойчивость к большинству производных существующих соединений. Более перспективным способом разработки антибиотиков является поиск новых природных антибактериальных агентов, неродственных соединениям, применяемым в медицине.
С другой стороны природные антибактериальные агенты играют важную роль в экологии микробных сообществ. Например, 20% изолятов Escherichia coli из кишечника человека вырабатывают один или несколько микроцинов — пептидных антибиотиков с небольшой молекулярной массой (<10 кДа).
Поэтому, всестороннее исследование структуры, механизмов действия, биологической роли природных антибиотиков, а также механизмов устойчивости к этим соединениям является важной научной и практической задачей.
Диссертационная работа посвящена исследованию природного антибиотика микроцина С (McC). Это соединение вырабатывается E. coli и подавляет рост многих видов энтеробактерий в микромолярных концентрациях. McC представляет собой линейный гептапептид к C-концевому аспартилу которого через N-ацил-фосфорамидную связь присоединен модифицированный остаток АМФ. Внутриклеточной мишенью соединения является аспартил-тРНК-синтетаза. Гены, обеспечивающие синтез McС, организованы в кластер. Было показано, что гены mccC, mccE и mccF микроциновго кластера обеспечивают устойчивость клеток E. coli к производимому антибиотику. Механизмы действия продуктов генов mccC и mccE были подробно изучены в нашей лаборатории, в то время как механизм устойчивости, который обеспечивается геном mccF, не был известен.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение молекулярного механизма действия продукта гена mccF, за счет которого клетки E. coli приобретают устойчивость к McС и родственным соединениям, а также поиск функциональных гомологов белка MccF в других микроорганизмах. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Установить MccF-зависимый механизм устойчивости к McС.
Определить структуру MccF. Охарактеризовать аминокислотные остатки, ответственные за узнавание субстрата и каталитическую активность.
На основании полученных данных о механизме действия и структуре MccF предсказать функциональных гомологов MccF в других микроорганизмов.
Определить, способны ли предсказанные гомологи обеспечивать устойчивость клеток к McC и родственным антибиотикам.
Научная новизна и практическая значимость работы. Был установлен механизм MccF-зависимой устойчивости клеток E. coli к McС. Было показано, что MccF является сериновой пептидазой, которая детоксифицирует антибиотик за счет гидролиза С-N связи, расположенной между -карбоксильной группой С-концевого аспартила микроцинового пептида и модифицированным остатком АМФ. Кроме того, MccF гидролизует ингибиторы аминоацил-тРНК-синтетаз (ARS), сходные по структуре с активной формой McC — аминоацил-сульфамоил-аденозины (aaSA).
Была определена кристаллическая структура MccF в комплексе с McС и его аналогами. Были найдены аминокислотные остатки, ответственные за специфическое распознавание субстрата и реакцию гидролиза. В частности, в MccF была обнаружена петля, аминокислотные остатки которой определяют специфичность пептидазы к аденилированным соединениям.
На основании полученных структурных данных было предсказано, что ряд гомологов MccF также обладает специфичностью к аденилированным субстратам. Экспериментально было показано, что некоторые из найденных ферментов действительно гидролизуют McC и aaSA, а также обеспечивают устойчивость клеток к этим соединениям в физиологических условиях. Для одного из гомологов из Bacillus cereus была определена трехмерная структура и охарактеризованы аминокислотные остатки, ответственные за связывание субстрата и каталитическую активность.
Результаты исследования существенно расширяют представления о биохимии сериновых пептидаз и механизмах лекарственной устойчивости бактерий. Физиологическая функция обнаруженной нами группы пептидаз, представители которой обладают высокой специфичностью к аденилированным соединениям, остается неизвестной. За исключением нескольких ингибиторов ARS, современной науке неизвестны природные вещества похожие по строению на субстраты MccF. Поэтому поиск физиологических функций ферментов MccF-группы является интересной задачей для будущих исследований.
Публикации а апробация работы. По результатам работы опубликовано три статьи в международных рецензируемых журналах. Часть результатов работы представлена на конференции «ASBMB annual meeting», april 24 – 28, 2010, Anaheim, USA.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: общая характеристика работы, литературный обзор, материалы и методы, результаты работы, заключение, выводы, публикации в журналах, список литературы, список сокращений. Работа изложена на 94х страницах машинописного текста. Работа содержит 30 рисунков и 4 таблицы. Список цитируемых литературных источников включает 146 наименований.
