Введение к работе
Актуальность проблемы
Стратегический план Европейского регионального бюро ВОЗ на 2005 – 2010 г.г. определяет борьбу с врожденной краснухой (ВК) в числе приоритетов и предусматривает элиминацию эндемичной краснухи и снижение заболеваемости ВК в странах региона до уровня менее 1 случая на 100 тыс. живых новорожденных (целевая программа «Здоровье для всех в XXI веке»). В странах, где достигнут высокий охват населения профилактическими прививками против краснухи, эта задача успешно решается [Best, Banatlava, 2006].
В Российской Федерации иммунизация против краснухи детей первого – второго года жизни введена в календарь профилактических прививок приказом МЗ РФ от 27.12.97 г. № 375. В связи с отсутствием отечественной вакцины, прививки проводятся зарубежными препаратами, зарегистрированными в установленном порядке [Бектемиров, 2004]. Их действующим началом является вакцинный штамм Wistar RA27/3 (автор – S. A. Plotkin).
В настоящее время, согласно приказу Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 30.10.2007 г. № 673, плановой иммунизации подлежат дети в возрасте 12 месяцев, 6 лет и девочки 13 лет; дополнительной – в рамках реализации Национального проекта в области здравоохранения – все дети от 1 до 17 лет не болевшие, не привитые или однократно привитые против краснухи; а также девушки 18 – 25 лет, не болевшие и не привитые ранее. C 1999 г., когда был зарегистрирован максимальный уровень заболеваемости краснухой (399,0 на 100 000 населения), этот показатель снизился более чем в 10 раз (21,7 на 100 000 населения в 2007 г.), что, в целом, свидетельствует об эффективности вакцинопрофилактики инфекции.
В то же время, специфическая профилактика краснухи в России связана с рядом проблем и вопросов, которые требуют изучения.
В Государственном докладе «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (2007 г.) Главного государственного санитарного врача РФ Г.Г. Онищенко констатируется, что регламентированный ВОЗ 95 % уровень охвата ревакцинирующими прививками в стране не достигнут. Среди заболевших краснухой наметилась тенденция к увеличению доли взрослого населения, в том числе женщин репродуктивного возраста. Как отмечает Г.Г. Онищенко, отсутствие отечественной вакцины сдерживает охват прививками всех подлежащих вакцинации контингентов.
Изолированный на территории Российской Федерации вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов» (автор – В.Н. Мешалова) был получен в г. Ленинграде под руководством академика А.А. Смородинцева в 70-ые годы XX века и депонирован в ГКМВ в 1979 г. Клинические испытания экспериментальных серий вакцины, созданной на его основе, показали высокую иммуногенную активность (100 % сероконверсий в группе серонегативных привитых, СГТ АТ – 8,1 lg2), низкую реактогенность препарата (1 % клинических реакций средней тяжести) [Мешалова и др., 1979]. В 1995 г., в рамках реализации Федеральной целевой программы «Вакцинопрофилактика» (руководитель программы – А.А. Ясинский), вакцинный штамм «Орлов» был восстановлен нами до исходных показателей биологической активности, сертифицирован в ГИСК им. Л.А.Тарасевича как вакцинный и получил наименование «Орлов-В» [Лаврентьева и др., 2003 г].
В большинстве стран, где осуществляется специфическая профилактика краснухи, преобладает циркуляция вирусов первой генетической линии, к которой принадлежит и вакцинный штамм Wistar RA27/3. Россия определена экспертами ВОЗ, как единственная территория с эндемичным распространением вирусов генотипа 2с [WHO, Wkly epidemiol. report, 2005]. Несмотря на высокое антигенное родство различных штаммов вируса краснухи, выделенных в разных регионах мира [Десятскова, 1974., Зверев и др. 2002], филогенетические изменения вируса под прессом коллективного иммунитета представляются возможным событием и создают потенциальную угрозу возникновения его дрейфовых вариантов со значимыми мутационными изменениями генома, как это отмечено, в частности, в отношении вакцинных полиовирусов в ходе реализации программы ликвидации полиомиелита живой оральной вакциной [Облапенко, 2003, Онищенко и др., 2008].
Однако в отечественной научной литературе до последнего времени не было работ, посвященных изучению адаптационной изменчивости вируса краснухи в период вакцинопрофилактики инфекции; а также – определению генетической принадлежности штамма «Орлов-В». Не было работ по определению генетической близости между современными штаммами и изолятами вируса краснухи, циркулирующими на территории РФ, и вакцинными штаммами, полученными более 30 лет тому назад. Не проводилась сравнительная генетическая характеристика отечественного и зарубежного вакцинных штаммов вируса краснухи. Решение этих вопросов представляет не только научный интерес, но и имеет непосредственное отношение к эффективности и безопасности специфической профилактики краснухи на территории Российской Федерации.
Штамм «Орлов-В» получен на первичной культуре клеток ППК. Использование в качестве тканевого субстрата в производстве вакцины первично-трипсинизированных клеточных культур усложняет технологию получения вакцины, затрудняет стандартизацию качественных характеристик конечного продукта, повышает себестоимость препарата. Более экономичным, технологичным, стабильным по биологическим свойствам клеточным субстратом для производства МИБП являются полуперевиваемые (диплоидные) линии клеток человека, рекомендованные экспертами ВОЗ для производства, в частности, вакцины против краснухи [Серия технических докладов ВОЗ, № 28, 1989].
При проведении в России массовой иммунизации детского населения и селективной вакцинации взрослых, существенное значение приобретает экономическая составляющая кампании. Использование для профилактики краснухи отечественного препарата, полученного на диплоидной линии клеток человека, позволило бы, ориентировочно, снизить затраты только на дополнительную иммунизацию населения в рамках реализации национального проекта «Здоровье» в 1,7 раза и сэкономить около 187 млн. рублей. При проведении плановой иммунизации экономия составила бы около 64 млн руб. ежегодно (в ценах 2008 г.). Экономическое преимущество такого препарата определяет актуальность разработки, так как его внедрение будет способствовать повышению охвата прививками всех декретированных контингентов и совершенствованию профилактики СКВ.
Вместе с тем, адаптация вируса к иной системе клеток-продуцентов может сопровождаться мутациями вирусного генома с изменением молекулярно-генетических свойств полученного варианта. Для оценки пригодности более технологичного варианта вакцинного вируса необходимо определить его генетическую стабильность in vitro, а также, в опытах in vivo – сохранность основных биологических свойств, характеризующих штаммы для живых вакцин: специфическую и иммунологическую безопасность; специфическую активность.
Вышеизложенное свидетельствует об актуальности настоящего исследования и служит основанием для получения варианта эндемичного для России вакцинного штамма вируса краснухи, адаптированного к более технологичному тканевому субстрату, и его всестороннего изучения.
Цель работы:
Создание на основе вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов» кандидата в вакцинный штамм и определение возможности его использования для профилактики краснухи на территории России.
Задачи исследования:
-
Провести сравнительный генетический анализ вакцинных штаммов вируса краснухи и современных штаммов и изолятов вируса.
-
Определить возможные филогенетические изменения вируса краснухи в период вакцинопрофилактики инфекции.
-
Оценить чувствительность ряда диплоидных линий клеток к вирусу краснухи и получить вариант исходного вируса краснухи, адаптированный к диплоидной культуре клеток «М-22» (штамм «Орлов-Д»).
-
Провести сравнительный генетический анализ штаммов Wistar RA27/3 и «Орлов-Д».
-
Оценить возможность использования диплоидной культуры клеток «М-22» в качестве тканевого субстрата для получения вакцины против краснухи.
-
Изучить генетические изменения вируса краснухи в процессе аттенуации в культуре клеток ППК и при его адаптации к диплоидной линии клеток «М-22».
-
Исследовать в опыте на обезьянах макака-резус специфическую безопасность штамма «Орлов-Д», включая контагиозность.
-
Определить в испытаниях на обезьянах макака-резус специфическую и протективную активность штамма «Орлов-Д».
9. Изучить влияние иммунизации препаратом из штамма «Орлов-Д» на
показатели врожденного иммунитета обезьян.
Научная новизна и теоретическая значимость исследования:
Впервые получены новые знания:
- о генетической принадлежности вакцинного штамма «Орлов-В», о генетических маркерах, характеризующих ослабленные варианты вируса краснухи;
- о более тесном генетическом родстве штамма «Орлов-В» и российских изолятов вируса краснухи, чем это присуще штамму Wistar RA27/3;
- об адаптационной изменчивости вируса краснухи в период вакцинопрофилактики инфекции;
В ходе исследования получен новый вариант вакцинного штамма «Орлов», адаптированный к более технологичному тканевому субстрату – штамм «Орлов-Д». Впервые проведена сравнительная генетическая характеристика штаммов «Орлов-Д» и Wistar RA27/3 и установлены различия между штаммами в высоко консервативной области белка Е1, отвечающей за поливалентную иммуногенную активность вируса.
Впервые разработаны технологические подходы к получению живой ат-тенуированной краснушной вакцины на основе штамма «Орлов-Д» и ди-плоидной культуры клеток кожно-мышечных фибробластов человека «М-22».
Впервые в эксперименте получены сведения о специфической безопасности штамма вируса краснухи «Орлов-Д», включая отсутствие контагиозных свойств, а также данные о высоких показателях его иммуногенной активности и протективности, не уступающие по этим критериям препарату сравнения – штамму Wistar RA27/3; доказана иммунологическая безопасность штамма. Эти результаты являются научным обоснованием перспективности использования штамма «Орлов-Д» для профилактики краснухи в России.
Практическая значимость:
Получение нового аттенуированного штамма для живой вакцины против краснухи и разработка способа получения вакцины на технологичном тканевом субстрате создает реальные предпосылки для получения вакцины против краснухи на основе эндемичного для России штамма вируса, что будет способствовать совершенствованию профилактики краснухи и СВК на территории Российской Федерации.
Положения, выносимые на защиту:
1. Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В» идентифицирован как вирус генотипа 2с, эндемичный для территории РФ, и генетически более близок к циркулирующим на территории России изолятам вируса краснухи, чем вакцинный штамм Wistar RА27/3. Вакцинопрофилактика краснухи вызывает филогенетические изменения возбудителя.
2. Выбор диплоидной линии клеток фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека «М-22» для получения штамма «Орлов-Д» обусловлен чувствительностью указанной культуры клеток к вакцинному штамму вируса краснухи, аналогичной чувствительности клеточной культуры ППК, использованной для аттенуации штамма «Орлов», а также наличием банка посевных клеток «М-22», рекомендованных ГИСК им. Л.А. Тарасевича для производства вакцинных препаратов. Данная культура клеток является технологичным субстратом и пригодна для промышленного выпуска краснушной вакцины.
3. Аттенуация штамма «Орлов» вируса краснухи в первичной культуре клеток ППК сопровождается значимой мутацией в структуре гена Е1. В процессе многократного пассирования штамма «Орлов-Д» в диплоидной культуре клеток «М-22» сохраняется его генетическая стабильность.
-
Доклиническое изучение штамма «Орлов-Д» на обезьянах макака –
резус специфической безопасности, специфической активности и иммунологической безопасности свидетельствует о его пригодности для получения вакцины против краснухи.
Внедрение результатов исследования в практику:
1. Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В». Депонирован в ГКМВ (№
2326 от 04.04.1995 г.); свидетельство об аттестации штамма в ГИСК им.
Л.А. Тарасевича № 01-33/8 от 29.03.95 г.
2. Штамм вируса краснухи «Орлов-Д». Депонирован в ГКМВ (№ 2347 от
29.12.1998 г.).
3. Штамм вируса краснухи «Лебедев». Депонирован в ГКМВ (№ 2365 от
17.12.2004 г.).
4. Изоляты вируса краснухи, выделенные на территории Пермского края.
Депонированы в коллекцию Международного генетического банка
Национального центра биотехнологической информации (Национальный
институт здоровья, США) (№№ EF210064 - EF210075 от 21.04.07 г.).
5. Патент на изобретение РФ № 2081912 «Вакцинный штамм вируса краснухи
Орлов-В». Приоритет от 22.05.1995 г.
6. Патент на изобретение РФ № 2173344 «Вакцинный штамм вируса краснухи
«Орлов-Д» и способ получения вакцины против краснухи». Приоритет от 28.06.1999 г.
-
Инструкция по изготовлению и контролю живой культуральной краснушной вакцины. Рассмотрена и одобрена Ученым Советом ФГУ «Санкт-Петербургский НИИЭМ имени Пастера Министерства здравоохранения Российской Федерации» (протокол № 10 от 14.11.2001г.) и утверждена директором Института 14.11.2001 г.
Апробация работы и публикации:
Основные результаты исследовательской работы доложены и обсуждены на 18 научных форумах и конференциях: на юбилейной конференции НИИЭМ им. Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 1995 г.) ; на Международной конференции «XXXI Dani preventive medicine» (Nis, 1997 г.), на Международной конференции «Modern Vaccinology»» (г. Уфа, 1996 г.); на II Международной научной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г.Санкт-Петербург, 1998 г.); на Международной конференции «XXXII Dani preventive medicine» (Nis, 1998 г.), на научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения академика В.Д. Белякова «Достижения отечественной эпидемиологии в XX веке. Взгляд в будущее» (г. Санкт-Петербург, 2001 г.); на Международной научной конференции «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы» (г. Санкт-Петербург, 2003 г.); на научно-практической конференции «Вакцинопрофилактика в XXI веке (Пермь, 2000 г.); на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (г. Пермь, 2003 г.); на Всероссийской научной конференции с международным участием «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (г. Адлер, 2006 г.); на Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах» (г. Адлер, 2007 г.); на IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (г. Москва, 2007 г.); на Международном конгрессе «48th Annual Meeting of the Eurohean Society for Pediatric Research» (г. Прага, 2007 г.), на Международном Российско-Норвежском семинаре «Совершенствование системы эпидемиологического надзора, диагностики и профилактики врожденной краснухи» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.); на 3 заседаниях Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Санкт- Петербург, 2003, 2005, 2007 г.г.); на заседании Ученого Совета ГУ ИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН (Московская область, 2007 г.).
Диссертационная работа была апробирована на заседании проблемной комиссии по вирусологии (25.09.08 г.) и заседании Ученого Совета (02.10.08 г.) ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора.
Научные положения, изложенные в диссертации, опубликованы в 31 печатной работе в период с 1995 по 2008 г.г., включая монографию «Краснуха» (Пермь – Санкт-Петербург – Москва, 2002), аналитический обзор «Инфекционная заболеваемость в Северо- Западном федеральном округе России. Закономерности и особенности эпидемического процесса в современный период» (СПб., 2007) и 8 работ в журналах, которые рекомендованы ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук. По материалам исследования получено два патента РФ на изобретение.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 328 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, главы материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы и приложений. Список литературы включает 297 работ, из них 113 отечественных и 184 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 20 таблицами.
