Введение к работе
Актуальность проблемы. Цитохром с млекопитающих - низкомолекулярный гем-содержащий белок, обладающий целым рядом биологических активностей. Основной функцией цитохрома с является перенос электрона от убихинол: цитохром с - редуктазы (комплекс III) на цитохром с - оксидазу (комплекс IV) дыхательной цепи митохондрий. В условиях высокой ионной силы цитохром с служит переносчиком электронов от цитохрома Ьз наружной мембраны к комплексу IV внутренней мембраны митохондрий (Bernardi, Azzone, 1981). При этом происходит перенос электронов по дыхательной цепи в обход ее начальных участков (участков генерации активных форм кислорода (АФК)). Значительная часть цитохрома с находится в митохондриях в довольно прочной связи с кардиолипином, входящим в состав внутренней митохондриальной мембраны, и осуществляет пероксидазную функцию, которая может играть важную роль в инициировании выхода цитохрома с из митохондрий (Kagan et. al., 2005). После выхода в цитозоль цитохром с взаимодействует с фактором Apaf-І, что является ключевым этапом для образования апоптосом и запуска цитохром с - зависимого апоптоза (Zou et. al., 1999, Ни et. al., 1999). И, наконец, цитохром с обладает специфической антиоксидантной активностью, заключающейся в эффективном ингибировании продукции супероксидных радикалов (О2 ) (Skulachev, 1998, Korshunov et. al., 1997).
Супероксидные радикалы - нормальные метаболиты всех живых организмов, утилизирующих кислород в процессах обмена, но в избыточных концентрациях они токсичны, в первую очередь, как источник гидроксильных радикалов (ОН ). Гидроксильные радикалы обладают очень высокой реакционной способностью, вызывают окислительное повреждение липидов, белков, ДНК и других компонентов клетки. Общепринято, что продукция супероксида является неотъемлемым свойством дыхательной цепи митохондрий эукариотических клеток. Образование активных форм кислорода, таких как супероксид, в митохондриях является главной причиной окислительного стресса, ведущего к различным патологическим состояниям: нейродегенеративным заболеваниям, атеросклерозу и старению (Balaban, 2005).
Цитохром с широко используется для измерения скоростей генерации супероксидного анион-радикала. Однако, восстановление цитохрома с неспецифично для супероксида. Аскорбиновая кислота, глутатион и клеточные редуктазы могут восстанавливать цитохром с, который может быть реокислен цитохром с - оксидазой и пероксидазой. Эти неспецифичные реакции восстановления и окисления цитохрома с искажают истинные значения скоростей образования супероксида.
Чтобы увеличить специфичность измерения супероксида, цитохром с частично ацетилируют (-60% лизиновых остатков ацетилировано) (Azzi et. al., 1975). Ацетилирование лизиновых остатков цитохрома с снижает скорости его восстановления митохондриальной и микросомальной редуктазами и скорости его окисления цитохром с - оксидазой, при этом способность цитохрома с к восстановлению супероксидом сохраняется. При ацетилировании цитохрома с уксусным ангидридом образуется достаточно гетерогенная смесь молекул цитохрома с с различным числом модифицированных лизиновых остатков. При этом реакционная способность цитохрома с по отношению к природному восстановителю и окислителю (цитохром с - редуктазе и цитохром с - оксидазе) зависит от степени ацетилирования. При ацетилировании снижается общий положительный заряд цитохрома с, что ведет к снижению сродства к супероксиду. Неспецифическое взаимодействие ацетилированного цитохрома с (АсС) с компонентами дыхательной цепи уменьшают добавлением фосфата калия в сравнительно высоких концентрациях (до 100 мМ). С другой стороны, высокие концентрации фосфата калия вызывают частичное разобщение дыхательной цепи, что искажает картину генерации супероксида.
Все вышесказанное определяет актуальность задачи получения и подробного исследования рекомбинантных мутантных цитохромов с, несущих замены, направленные на снижение реакционной способности по отношению к компонентам дыхательной цепи, и разработки на их основе тест-системы для измерения скорости генерации супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах, представляющей прикладной биохимический интерес.
Цель исследования.
Целью настоящей диссертационной работы являлось: конструирование, получение и исследование ряда вариантов цитохрома с, содержащих замены лизиновых остатков в окружении гемовой впадины, направленные на снижение электрон-транспортной активности цитохрома с по отношению к белкам-партнерам дыхательной цепи, с последующей разработкой на их основе тест-системы для измерения скорости генерации супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах, обладающих цитохром с - редуктазной и цитохром с - оксидазной активностью.
Основные задачи исследования.
1. Путем введения одиночных и двойных замен в ген цитохрома с лошади исследовать
роль индивидуальных лизиновых остатков в формировании реакционноспособных
комплексов с комплексом III и комплексом IV дыхательной цепи.
2. На основе полученных данных о роли индивидуальных лизиновых остатков
осуществить конструирование мутантных вариантов цитохрома с, обладающих сниженной
электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.
Получить в препаративных количествах мутантные варианты цитохрома с, обладающие сниженной электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.
Провести детальное исследование свойств мутантных вариантов цитохрома с лошади.
На основе отобранных на предыдущих этапах работы мутантных вариантов цитохрома с, обнаруживших наибольшее снижение электрон-транспортной активности, разработать тест-систему для детекции супероксидного анион-радикала в митохондриальном препарате (прочносопряженных инвертированных субмитохондриальных частицах (СМЧ) сердца быка). Сравнить скорости генерации супероксида комплексом І в СМЧ сердца быка, измеренные с помощью полученных мутантных вариантов цитохрома с, и скорости генерации перекиси водорода, измеренные с помощью Amplex Red.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.
Путем специфического сайт-направленного мутагенеза получены мутантные варианты цитохрома с лошади с единичными и двойными заменами лизиновых остатков в окружении гемовой впадины, обеспечивающих взаимодействие цитохрома с с митохондриальными убихинол: цитохром с - редуктазой и цитохром с - оксидазой, на глутаминовую кислоту и незаряженные остатки.
С помощью методов генной инженерии показано, что преимущественный вклад в формирование реакционноспособного комплекса с убихинол: цитохром с - редуктазой дыхательной цепи вносят остатки Lys цитохрома с в положениях 8, 27, 72, 86, 87, а в формирование комплекса с цитохром с - оксидазой - остатки Lys в положениях 13, 79, 86, 87.
Получены мутантные варианты цитохрома с лошади, несущие разные комбинации замен К/Е (в положениях 8, 27, 72, 86, 87) в окружении гемовой впадины и Е/К (в положениях 62, 69, 90) на противоположной гемовой впадине стороне молекулы, обладающие сниженной реакционной способностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи.
Показано, что мутантные варианты цитохрома с лошади с шестью (К27Е/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К, К8Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е) и восемью (К8Е/К27Е/Е62К/Е69К/К72Е/К86Е/К87Е/Е90К) заменами, обладают сниженной
электрон-транспортной активностью по отношению к комплексу III и комплексу IV дыхательной цепи по сравнению с АсС.
Разработана новая эффективная тест-система количественного определения супероксидного анион-радикала в митохондриальных препаратах (в частности, СМЧ сердца быка), основанная на восстановлении мутантных вариантов цитохрома с лошади.
С помощью разработанной тест-системы показано, что в комплексе I СМЧ сердца быка только -50% перекиси водорода образуется в результате дисмутации супероксида.
Разработанная в ходе данной работы тест-система количественного определения супероксидного анион-радикала, основанная на восстановлении мутантных вариантов цитохрома с лошади, может быть использована для измерения скорости генерации супероксида в митохондриальных препаратах, обладающих цитохром с - редуктазной и цитохром с - оксидазной активностью, как инструмент для дальнейшего изучения окислительных процессов в митохондриях.
Апробация работы.
Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международных конференциях: XIX зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2007); II студенческом симпозиуме по биоинженерии (Москва, 2007); Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007» (Москва, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); 12-й Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008); XXI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2009); 341 FEBS Congress (Prague, Czech Republic, 2009); Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации.
