Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Методы непрямой реваскуляризации миокарда: современное состояние проблемьги перспективы развития (обзор литературы) 17
1.1 Предпосылки возникновения и краткая история становления методов непрямой реваскуляризации миокарда 19
1.2 Механизмы воздействия лазерного излучения на биологические ткани 26
1.3 Экспериментальные исследования. лазерной реваскуляризации миокарда 34
1.4 Клинические результаты трансмиокардиальной реваскуляризации 39
1.5. Ангиогенез в норме ипатологии 40
1.6. Имплантация клеток костномозгового происхождения в эксперименте клинике 54
Глава 2. Материалы и методы исследования 80
2.1 Полупроводниковый лазер«ЛС-1,56-ИРЭ-Полюс» 80
Общая схема эксперимента
2.2.1. Модельные эксперименты по выбору оптимального режима лазерного излучения 81
2.2.2 Общая схема эксперимента по моделированию хронической ишемической.болезни сердца и её экспериментальному лечению 82
2.3 Методы исследования 83
2.3.1 Методика выполнения модели острого инфаркта миокарда 83
2.3.2 Особенности оперативного вмешательства и послеоперационного периода при вариантах непрямой реваскуляризации на- модели хронической ишемической. болезни сердца 84
2.3.3 Хирургические детали при имплантации мононуклеарных клеток костного мозга в миокард 86
2.3.4 Хирургические детали транмиокардиальнойг лазерной реваекуляризации 86
2.3.5 Хирургические детали лазерной реваекуляризации с имплантацией аутологичных клеток костного мозга 87
2.3.6 Получение и диагностика мононуклеарной фракции аутологичных клеток костного мозга (животных) 87
2.3.7 Морфологическое исследование образцов 89
2.3.8 Морфологическая оценка плотности антериол и капилляров 90
2.3.9 Флюоресцентная кариометрия кардиомиоцитов в зонах воздействия лазер плюс клетки без воздействия у животных с моделыО ХИБС 91
2.3.10 Молекулярные методы исследования 92
2.3.11 Проточная цитофлуориметрия для оценки мононуклеарных клеток (человека) 96
2.3.12 Оценка перфузии миокарда с использованием 99п1Тс 97
2.3.13 Статистические методы исследования 97
2.3.14 Оборудование, использованное при работе 97
2.4 Клиническаяїчасть 98
2.4.1. Общий дизайн исследования 98
2.4.2. Общая характеристика пациентов. 99
2.4.3. Методика выполнения трансмиокардиальной лазерной реваекуляризации миокарда с использованием полупроводникового лазера «1,56-ИРЭ-Полюс» 103
2.4.4. Методика выполнения имплантации мононуклеарной фракции клеток костного «мозга вміазерньїе каналы 105
2.4.5. Ведение больных в раннем «послеоперационном периоде 106
2.5. Инструментальные методы-исследования 108
2.5.Г. Эхокардиографическое исследование 108
2.5.21 Коронарография 109
2.5.3. Перфузионная сцинтиграфия миокарда с 99тТс Технетрил 109
2.5.4 Биохимическая оценка повреждения миокарда и острофазовых маркеров 111
2.6 Выделение мононуклеарной фракции клеток аутологичногокостного мозга для- имплантации в лазерные каналы в клинике 112
2.6.1. Забор-аспирата костного мозга 112
2;6.2 Получение целевых клеток из аутологичного костного мозга 113
2.6.3 Диагностика клеточного материала 114
2.7. Статистическая обработка результатов и выбор критериев достоверности 116
Глава 3. Результаты экспериментальных исследований эффективности методов непрямой реваскуляризации миокарда (трансмиокардиальнои лазерной реваскуляризации миокарда и имплантации мононуклеарных клеток костного мозга в лазерные каналы 117
3.1 Модель хронической ишемической болезни сердца1 (макроскопический анализ сердец) 117
3.2 Гистологическая характеристика модели хронической ишемической болезни сердца 123
3.3 Экспериментальное обоснование выбора оптимального режима лазерного излучения 130
3.4. Радионуклидное исследование миокардиального кровотока в эксперименте 138
3.4.1 Результаты сцинтиграфии до и после ТМЛР па модели ХИБСусобак 138
3.4.2 Результаты сцинтиграфии при имплантации клеток костного мозга на модели ХИБС 140
3.4.3 Результаты сцинтиграфии при комбинированном методе реваскуряризации (ТМЛР плюс клетки) 141
3.5. Гистологическая характеристика вариантов непрямой реваскуляризации 145
3.5.1 Обзорная микроскопия ТМЛР 145
3.5.2. Обзорная, микроскопияг мест имплантации МФККМ- в миокард 149
3.5.3 Обзорная микроскопия мест воздействия ТМЛР и имплантации МФККМ в лазерные каналы 154
3.5.4. Результаты морфометрии сосудов- миокарда. при вариантах непрямой реваскуляризации 163
3.5.5. Морфометрии эпикардиального- слоя в местах воздействия при, различных вариантах реваскуляризации 165
3.5.6. Результаты морфометрической оценки микроциркуляции перирубцовой зоны при воздействии «лазер плюс клетки» в сопоставлении с моделью ХИБС по выявлению щелочной фосфатазьь в эндотелии сосудов (артериол и капилляров) при окрашивании изолектином В4 166
3.5.7. Результаты кардиометрии миокарда- перирубцовой, зоны с воздействием лазер+клетки в сопоставлении с моделью ХИБС 171
3.6. Цитологические и молекулярно-генетические аспекты клеточно-опосредованной непрямой реваскуляризации миокарда 180
3.6.1. Цитофлюориметрический анализ мононуклеарной фракции клеток костного мозга пациентов с ХИБС 180
3.6.2. Оценка уровня экспрессии генов-маркеров хондро-остеогенеза в прилипающей и неприлипающей фракциях клеток костного мозга 184
3.6.3 Оценка уровня экспрессии генов вазо-эндотелиальных факторов роста в сепарированных мононуклеарных клетках костного мозга 189
3.6.4. Исследование уровня экспрессии мРНК генов ангиогенных факторов и хемокинов: VEGF, SDF, Ang-1, Ang2, после имплантации клеток костного мозга в лазерные каналы и с помощью иглы 190
Глава 4 Клинико-функциональная оценка АКШ и трансмиокардиаль-ной лазерной реваскуляризации с использованием полупроводникового лазера «1,56-ИРЭ-ПОЛЮС» 197
4.1. Биохимическая оценка хирургической агрессии при воздействиилазерногоизлучения на миокард 197
4.1.1. Исследование кардиоспецифических маркеров повреждения миокарда при ТМЛР 197
4.1.2. Исследование острофазовых маркеров воспалительной реакции при выполнении ТМЛР в сочетании с АКШ 199
4.2. Клиническая оценка результатов использования трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации всочетании с АКШ у пациентов ИБС с диффузным и дистаьным поражением коронарных артерий в ближайшем и отдаленном периоде после операции 202
4.3. Оценка сократительной способности» миокарда по данным ЭхоКГ после сочетанных операций АКШ и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации у пациентов ИБС с диффузным пристальным поражением коронарных артерий в ближайшем и отдаленном периоде после операции 209
4.3.1. Оценка сегментарной сократимости миокарда 209
4.3.2. Оценка объемных показателей и ФВ ЛЖ после операции 212
4.4. Изменения микроциркуляции миокарда по данным перфузионной сцинтиграфии миокарда с 99тТс после операции АКШ в сочетании с ТМЛР 216
4.5. Клинические примеры 220
4.6. Анализ летальности и осложнений 228
Глава 5 Клинико-функциональная оценка АКШ и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации в сочетании с имплантацией мононуклеариой фракции клеток костного мозга 229
5.1. Биохимическая оценка хирургической агрессии при имплантации мононуклеариой фракции клеток костного мозга в лазерные каналы 229
5.1.1. Исследование кардиоспецифических маркеров повреждения миокарда при ТМЛР и имплантации мононуклеариой фракции-клеток костного мозга 229
5.1.2. Исследование острофазовых маркеров воспалительной реакции при ТМЛР в сочетании с имплантацией МФККМ 231
5.2. Клиническая оценка результатов. использования трансмиокардиальной лазерное реваскуляризации в. сочетании с имплантацией стволовых, клеток, у пациентов с диффузным и дистальным поражением коронарных артерий в ближайшем и отдаленном послеоперационном периоде 232
5.3. Оценка, сократительной» способности миокарда по данным ЭхоКГ после сочетанных операций АКШ; и. имплантации МФККМ влазерные канальну, пациентов ИБС с диффузным дистальным поражением коронарных артерий в ближайшем и отдаленном периоде 236
5.4. Динамика перфузии миокарда по данным сцинтиграфии с П1Тс после операций»АКШ в сочетании с имплантацией МФККМ в лазерные каналы 241
5.5. Влияние количества имплантируемых клеток на,эффект непрямой реваскуляризации 246
Глава 6 Обсуждение полученных результатов 249
Выводы 275
Практические рекомендации 278
Список литературы 279
- Механизмы воздействия лазерного излучения на биологические ткани
- Модель хронической ишемической болезни сердца1 (макроскопический анализ сердец)
- Обзорная микроскопия мест воздействия ТМЛР и имплантации МФККМ в лазерные каналы
- Результаты кардиометрии миокарда- перирубцовой, зоны с воздействием лазер+клетки в сопоставлении с моделью ХИБС
Введение к работе
Актуальность проблемы
Ишемическая болезнь сердца – заболевание, которое в настоящее время определяет высокий общий уровень смертности и инвалидизации населения развитых стран (В.И.Бураковский, 1988; Л.А.Бокерия, 2005). Несмотря на достижения в области хирургии коронарных сосудов сердца, для значительной группы пациентов традиционные методы прямой реваскуляризации миокарда не эффективны.
К этой группе относятся пациенты, перенесшие две и более операций АКШ, а также пациенты, у которых атеросклеротические поражения дистальных отделов коронарного русла не позволяют выполнить адекватную реваскуляризацию (Л.А.Бокерия, И.И.Беришвили, 2004; Л.А.Бокерия, 2005).
Таким образом, поиск альтернативных подходов в хирургическом лечении ИБС является объективной необходимостью. Из существующих на сегодняшний день альтернативных направлений в лечении ИБС в клинике и эксперименте можно выделить следующие: лазерная трансмиокардиальная реваскуляризация; клеточные технологии с использованием различных фенотипов ауто- или аллогенных клеток, в т.ч. эмбриональных для целей реваскуляризаци и улучшения миокардиальной функции; генно-инженерные технологии и сочетание вышеперечисленных методов.
У каждого из вышеуказанных направлений есть перспективы реализации в клинической практике.
Применение различных типов лазеров для выполнения непрямой реваскуляризации миокарда в настоящее время получило достаточно широкое распространение. В научных центрах, занимающихся этой проблемой, накоплен достаточный опыт экспериментальных исследований и клинических наблюдений по оценке эффективности воздействия лазерного излучения на кровообращение миокарда при его хронической ишемии (Horvath et al., 1999; Л.А.Бокерия, И.И.Беришвили, 1997, 2004; Keith B.Allen et al., 2008; Pavan Atluri M.D. et al., 2008). Научно-технические достижения способствовали развитию новых технологий, появлению новых типов лазеров, в том числе полупроводниковых, действие которых на биологические объекты изучено недостаточно.
В настоящее время появились новые способы улучшения коронарного кровообращения за счет применения клеточных технологий. Впервые термин «биологический шунт» применительно к лечению ишемии миокарда с помощью имплантации аутологичных стволовых клеток был предложен доктором N.Asahara в 1999 году. Он же является основоположником современного направления клеточной терапии поврежденного миокарда, основанной на серии экспериментальных исследований с использованием клеток аутологичного костного мозга для реваскуляризации миокарда на модели ишемической болезни сердца.
В то же время способность аутологичных стволовых клеток костномозгового происхождения участвовать в процессах репарации при повреждении миокарда была продемонстрирована Orlic D.B. с соавторами в 2001г. Исследование сердец мышей, которым были имплантированы СК, показало формирование новых сосудов, уменьшение зоны вызванного инфаркта миокарда на 48%. При этом в эксперименте была достигнута регенерация миокарда в постинфарктной зоне, в которую были имплантированы СК. Эти исследования стали предпосылкой для продолжения работ по изучению неоваскуляризации с использованием «клеточных технологий». Первые сообщения были очень обнадеживающими, однако экспериментальный неоваскулогенез не воспроизводился в клинике (Jastin Ortak et al., 2008; Victoria Ballard et al., 2008). За эти годы были частично изучены механизмы развития и дифференцировки имплантированных стволовых клеток в миокарде, отработана технология забора и выделения материала. Однако на настоящий момент остается больше вопросов, чем ответов в отношении клеточной терапии. Эти вопросы касаются как выбора оптимального способа доставки стволовых клеток, так и типа стволовых клеток, используемых с целью реваскуляризации миокарда.
Теория клеточно-опосредованной стратегии в лечении ИБС основана на имплантации непосредственно в ишемизированный миокард или в коронарное русло взвеси костномозговых клеток (Asahara N. et al., 1999;. Orlic D.B. et al., 2001). При этом преследуется две цели: реваскуляризация миокарда и устранение дефицита функциональных клеточных элементов миокарда. На сегодняшний день остается неясной возможность регенерации миокарда вообще и в условиях улучшения кровообращения миокарда с использованием «клеточных технологий» в частности. Считается, что кардиомиоциты сердца человека спустя год после рождения не способны к гиперпластической регенерации. Более того, рядом авторов было доказано, что число кардиомиоцитов в течение жизни не изменяется (MacLellan W.R., Schneider M.D., 2000; Chien K.R., Olson E.N., 2002)
Несмотря на большое количество публикаций, на сегодняшний день отсутствуют работы, органически обосновывающие клиническую эффективность вариантов непрямой реваскуляризации сердца и базирующиеся на предшествующих экспериментальных исследованиях. Это послужило одной из основных мотиваций проведения нашего экспериментально-клинического исследования.
Цель исследования
Разработать в эксперименте и внедрить в клиническую практику концепцию направленного ангиоваскулогенеза миокарда с использованием лазерных и клеточных технологий для повышения эффективности хирургического лечения больных ИБС.
Задачи исследования
-
Изучить в эксперименте варианты непрямого направленного ангиоваскулогенеза миокарда на модели хронической ишемической болезни сердца (ХИБС) у животных при использовании трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации, имплантации стволовых клеток и сочетании трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации с имплантацией стволовых клеток.
-
Дать морфологическую характеристику микроциркуляторного звена при различных вариантах непрямой реваскуляризации миокарда в эксперименте.
-
Изучить изменения микроциркуляторного русла миокарда при различных вариантах непрямой реваскуляризации в эксперименте по данным перфузионной сцинтиграфии миокарда с использованием 99mTc-Технетрил.
-
Дать оценку безопасности применения в клинической практике предложенных методов непрямой реваскуляризации миокарда на основании анализа динамики кардиоспецифических и острофазовых маркеров после лазерной реваскуляризации и после имплантации клеток костного мозга в лазерные каналы в сочетании с коронарным шунтированием в клинике.
-
Изучить клиническую эффективность трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации в сочетании с коронарным шунтированием у больных ИБС с диффузным и дистальным поражением коронарных артерий.
-
Дать клинико-функциональную оценку применения метода коронарного шунтирования в сочетании с имплантацией мононуклеарной фракции аутологичных клеток костного мозга в лазерные каналы у больных ИБС.
-
Провести сравнительную оценку клинического использования исследуемых методов непрямой реваскуляризации миокарда на основе анализа клинико-инструментального обследования больных ИБС в ближайшем и отдаленном послеоперационном периоде.
Научная новизна
(Личный вклад автора в получение новых научных знаний)
-
Впервые на большом экспериментальном материале дана оценка различным вариантам направленного ангиоваскулогенеза на модели ХИБС с использованием энергии полупроводникового лазера, имплантации аутологичных клеток костного мозга и комбинации этих методов.
-
Дана морфологическая характеристика микроциркуляторного русла миокарда на модели хронической ишемии миокарда при различных вариантах непрямой реваскуляризации миокарда с использованием лазерных и клеточных технологий.
-
Впервые изучены особенности перфузии миокарда при различных вариантах непрямой реваскуляризации в эксперименте по данным перфузионной сцинтиграфии миокарда с использованием 99mTc-Технетрил.
-
Внедрен в клиническую практику метод непрямой реваскуляризации миокарда с использованием полупроводникового лазера «ИРЭ-Полюс» с длиной волны 1,56 мкм и обоснована клиническая эффективность АКШ в сочетании с ТМЛР у больных ИБС с диффузным поражением коронарных артерий в ближайшем и отдаленном послеоперационном периоде.
-
Впервые дана клинико-функциональная оценка эффективности и безопасности использования комбинированного метода АКШ в сочетании с имплантацией мононуклеарной фракции аутологичных клеток костного мозга в лазерные каналы при лечении диффузного поражения коронарных артерий.
-
Впервые на основании результатов проведенного проспективного одноцентрового рандомизированного двойного слепого исследования установлена эффективность клинического применения АКШ в сочетании с методами непрямой реваскуляризации миокарда, основанными на использовании лазерных и клеточных технологий.
Отличие полученных новых научных результатов от результатов, полученных другими авторами
В доступной литературе мы не встретили клинических рандомизированных исследований, где в сравнительном аспекте проводилось сравнение различных методов непрямой реваскуляризации, в том числе и с группой, где использовались СК. Поэтому полученные результаты обсуждаются только с литературными данными по лазерной реваскуляризации.
В отличие от пункции, осуществляемой механическим путем, лазерное воздействие, помимо формирования канала, создает дополнительные эффекты, обусловленные сочетанием ударной волны и термического воздействия (Ferrara N, Davis-Smith T., 1997; Folkman J. 2001; Jackson KA, Majka SM, Wang H., 2001). Но пациенты ИБС имеют дефицит жизнеспособного миокарда, следовательно, предпочтительнее создание каналов с минимальным повреждением миокарда, минимальной зоной перифокального некроза. Для определения оптимального режима воздействия на миокард с учетом наименьшего термического повреждения в рамках данной работы было проведено специальное исследование. В качестве объекта исследования в работе использовались 50 участков передней стенки левого желудочка ЛЖ сердец людей, умерших от различных причин в возрасте от 30 до 65 лет в сроки, не превышающие 1 суток с момента смерти. Внедрен в клиническую практику метод непрямой реваскуляризации миокарда с использованием полупроводникового лазера «ИРЭ-Полюс» с длиной волны 1,56 мкм и обоснована клиническая эффективность АКШ в сочетании с ТМЛР у больных ИБС с диффузным поражением коронарных артерий в ближайшем и отдаленном послеоперационном периоде.
Наряду с исследованиями, которые показывают эффективность ТМЛР, есть и клинические исследования, которые не выявили улучшения миокардиального кровотока в области трансмиокардиальных каналов ( et al., 2006; Pavan Atluri et al., 2008; Xu C, Police S et al., 2002). Наши экспериментальные исследования показали улучшение перфузии ишемизированного миокарда после непрямой реваскуляризации, что было подтверждено не только морфологическими, но и радионуклидными методоми исследования. Так, при использовании лазерного воздействия в зоне реваскуляризации улучшение перфузии составила 20%.
Значительное влияние клеток на ремоделирование миокарда отмечают практически все исследователи, проводящие эксперименты на модели инфаркта миокарда. По их данным улучшаются эластические свойства рубца, он становится менее ригидным, улучшая кровенаполнение ЛЖ в диастолу (Fukushima S., Anabel Varela-Carver et al., 2007). Клеточная трансплантация способствовала также профилактике дилатации ЛЖ, но ни в одном исследовании не было показано, что пересаженные клетки замещают собой рубцовую ткань.
Подтвердив предположение об эффективности имплантации МФККМ в лазерные каналы на улучшение кровообращения миокарда, нами была поставлена задача выявить дозозависимый эффект этой процедуры. В результате была выявлена прямая корреляционная зависимость между количеством клеток и приростом перфузии миокарда по данным перфузионной сцинтиграфии и по полученным графикам было установлено, что имеется дозозависимый эффект и рекомендуемая доза имплантируемых клеток должна превышать 50млн. Только в этом случае гарантирован наилучший успех процедуры.
Подчеркивая несомненную эффективность ТМЛР, большинство авторов отмечает снижение класса стенокардии (J.G. Vincent at al. 1997; K. B. Allen at al. 1997, 1998; Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А., 2003). Между тем, объективной и субъективной оценке состояния больных в литературе не уделено достаточно внимания. По-видимому, отсутствие таких сопоставлений обусловлено либо недостаточным числом наблюдений, либо недостаточным количеством больных, подвергшихся соответствующему обследованию.
Научная и практическая значимость полученных новых научных знаний
-
На основании многоплановых экспериментальных исследований
установлена эффективность различных методов непрямой реваскуляризации миокарда, основанных на использовании лазерных и клеточных технологий, обладающих эффектом направленного ангиоваскулогенеза при хронической ишемии миокарда. -
Сравнительный анализ морфологической картины микроциркуляторного русла миокарда после воздействия изучаемых вариантов непрямой реваскуляризации при экспериментной ишемии миокарда выявил, что наиболее эффективным и ангиогенным является метод имплантации МФККМ в лазерные каналы.
-
Разработан и внедрен в клиническую практику метод сочетанной реваскуляризации миокарда аортокоронарное шунтирование и ТМЛР с использованием полупроводникового лазера у больных ИБС.
-
Разработан оригинальный безопасный метод непрямой реваскуляризации миокарда со взаимопотенциирующим эффектом лазерного воздействия и клеточной терапии для хирургического лечения больных ИБС с диффузным, преимущественно дистальным поражением коронарного русла.
-
Полученные положительные результаты клинико-экспериментального исследования научно обосновали возможность использования клеточных технологий для применения в клинической практике при хирургическом лечении больных ИБС с диффузным и дистальным поражением коронарных артерий.
-
Дана клинико-инструментальная оценка методов непрямой реваскуляризации миокарда, разработаны показания и противопоказания к использованию методов направленного ангиоваскулогенеза для применения при хирургическом лечении ИБС в кардиохирургической практике.
Достоверность выводов и рекомендаций
Большое количество клинических наблюдений (134), проведение научного анализа с применением современных методов статистики является свидетельством высокой достоверности выводов и рекомендаций, сформулированных в диссертационной работе.
Краткая характеристика клинического материала (объекта исследования) и научных методов исследования
Экспериментальная часть выполнена на 32 здоровых беспородных собаках обоего пола, с массой тела 18 - 20 кг, которым моделировался острый ИМ путем перевязки передней межжелудочковой коронарной артерии и диагональной артерии. Спустя три месяца на фоне формирования модели ХИБС выполнялись различные варианты непрямой реваскуляризации миокарда левого желудочка. Животные выводились из эксперимента спустя 3-4 месяца после проведения моделирования острого инфаркта миокарда (группа контроля) и через 7-8 недель после операции реваскуляризации - 19-20 недель от начала эксперимента.
В рамках клинической части работы обследованы 134 пациента ИБС мужского и женского пола. В зависимости от выбранного метода лечения пациенты были разделены на 3 группы. Первая группа (n = 83) – в этой группе выполнена операция прямой реваскуляризации миокарда (аутовенозное аортокоронарное шунтирование и маммарокоронарное шунтирование) в сочетании с трансмиокардиальной лазерной реваскуляризацией миокарда с использованием полупроводникового лазера «1,56-ИРЭ-Полюс». Вторая группа (n = 35) – выполнена операция прямой реваскуляризации миокарда в сочетании с имплантацией стволовых клеток в лазерные каналы, которые проводились также с использованием полупроводникового лазера «1,56-ИРЭ-Полюс». Третья группа - контрольная группа (n = 16) –в этой группе выполнена операция прямой реваскуляризации миокарда с эндартерэктомией и без трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации миокарда.
Статистическая обработка экспериментальных данных исследования проводилась средствами интегрированной статистической системы Origin 7.5 for Windows, используемое программное обеспечение: OC Microsoft Windows XP, Microsoft Office XP Professional.
Статистическая обработка результатов и выбор критериев достоверности в клинической части работы проводились с использованием программ «STATISTICA 6.0», «Microsoft Exel 4.0» с использованием критериев Вилкоксона, Манна-Уитни, Friedman ANOVA, вычислением корреляции Спирмена.
Использованное оснащение, оборудование и аппаратура
Для морфологического анализа использовался программно-аппаратный комплекс для анализа изображений на базе микроскопа Axioskop FL-40 c камерой AxioCam MRc, программный пакет AxioVision 3.1) и Axiovert М200 c камерой AxioCam НRc, программный пакет AxioVision 4.7, Carl Zeiss, Германия, для резки гистологических образцов был использован криостат «Miсrom» HM-550 (Carl Zeiss, Германия). Дизайн праймеров осуществлен с помощь программного обеспечения Vector NTI 8 (InforMax Inc., USA). Проточная цитофлуориметрия для оценки мононуклеарных клеток (человека) осуществлялась на цитофлуориметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Исследование перфузии миокарда до и после операции выполнено на гамма-камере «DIACAM» (Siemens, Германия) в планарном режиме.
В клинической части работы эхокардиографическое исследование проводили на аппарате «Sonos-5500», фирмы «Hewlett Packard» (США). Коронарографическое исследование проводили на ангиографических установках Infinix (CC-i), «Toshiba Medical Systems Corporation» (Япония).
Для определения жизнеспособности миокарда выполнялась перфузионная сцинтиграфия миокарда с 99mTc-Технетрилом (в покое и при нагрузке). Количественная обработка данных проводилась на компьютере MCs-560 фирмы “Technicare” (США) по программе, разработанной в лаборатории радионуклидных методов исследования ННИИПК им. акад. Мешалкина и параллельно на компьютере 486/NP с клинической программой «Голд-Рада».
Личный вклад автора в осуществление данного научного исследования
Автор принимал непосредственное участие в экспериментальных исследованиях, в диагностике коронарной патологии больных ИБС и отборе пациентов на реваскуляризацию миокарда. Автор лично участвовал в операциях АКШ в сочетании с трансмиокардиальной лазерной реваскуляризация миокарда, а также АКШ и трансмиокардиальной лазерной реваскуляризации в сочетании с имплантацией МФККМ у больных.
Анализ данных экспериментальной части работы с использованием статистических методов выполнен автором при консультации доктора медицинских наук, профессора П.М. Ларионова - руководителя отдела лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии ННИИПК имени академика Е.Н. Мешалкина.
Набор клинического материала и его анализ с использованием статистических методов выполнен автором при консультации доктора меицинских. наук, профессора А.М. Чернявского – руководителя Центра хирургии аорты, коронарных и периферических артерий.
Апробация работы и публикации по теме диссертации
Основные положения, выводы и практические рекомендации доложены на ежегодной сессии НЦ ССХ им. А.Н. Бакулева РАМН (г. Москва, 2005, 2006, 2007, 2008); на Всероссийских съездах сердечно-сосудистых хирургов, проходивших в Москве в 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 годах; на Научных чтениях, посвященных памяти академика Е.Н.Мешалкина в 2006 и 2008 годах, опубликованы в центральной научно-медицинской литературе.
Механизмы воздействия лазерного излучения на биологические ткани
В основе работы лазеров лежит принцип накопления активной средой световой энергии с последующим высвобождением ее в виде монохроматичного пучка. Световое излучение лазера обладает такими исключительными свойствами, как острая направленность, высокая монохроматичность, когерентность, обуславливающие распространение волны в пространстве с очень малым углом расхождения, что позволяет получать чрезвычайно высокую плотность энергии. Несфокусированный луч лазера обычно имеет ширину 1-2 см, а с наведенным фокусом - от 1,0 до 0.01мм и меньше.
В основе действия лучей лазера на различные биологические объекты лежит либо непрерывное, либо импульсное воздействие светового луча большой мощности. При излучении в непрерывном режиме поглощение энергии излучения приводит к увеличению температуры в клетках и тканях, на несколько десятков и даже сотен градусов. Под влиянием термического фактора большие массы тканей "испаряются " в течение нескольких секунд. В импульсном режиме действия излучения на биологические объекты более сложно. Взаимодействие излучения с живой тканью здесь носит взрывной характер и сопровождается как тепловыми эффектами (коагуляция, испарение), так и. образованием волн сжатия и разряжения, распространяющихся вглубь ткани.
Перед тем, как рассмотреть механизм лазерного воздействия на миокард, следует остановиться на морфологических аспектах непрямой реваскуляризации. Во взрослом организме предусмотрено несколько механизмов сосудообразования (Непомнящих Л.М., 1981):
Ангиогенез - репарация и рост существующей сети микроциркуляторных сосудов
Артериогенез - ремоделирование сосудистого русла, например,
формирование коллатералей
Васкулогенез - процесс формирования первичного сосудистого сплетения in situ из клеток-предшественников.
В основе ангио- и артериогенеза лежат схожие механизмы и принципы регуляции, это сложные многоэтапные процессы, которые реализуются при взаимодействии клеточных элементов, ростовых факторов и компонентов внеклеточного матрикса.
Наиболее вероятным механизмом лазерной реваскуляризации миокарда считается лазерно индуцированный ангиогенез, в зоне рубца на месте сформированного лазерного канала и в миокарде, прилегающем к области воздействия [399]. Образование мелких артериол капилляров и сосудов синусоидного типов в трансмиокардиальном рубце, и увеличение плотности сосудов в прилегающем миокарде, подтверждается результатами экспериментальных и клинических исследование [222]. Формирование новых сосудов в зоне рубца и в миокарде сопровождается увеличением ростовых и ангиогенных факторов [10]. Головнева Е.С. отмечает синтез кардиомиоцитами VEGF и b-FGF после выполнения трансмиокардиальных лазерных каналов, синтез ростовых факторов определялся при окрашивании гистологических срезов миокарда анти-VEGF и анти-b-FGF моноклональными антителами [378, 10].
Одним из компонентов действия лазерного излучения на ткани является механическое воздействие, развивающееся при мгновенном переходе твердых и жидких веществ в газообразное состояние и резком повышении внутриклеточного и внутритканевого давления. Механические колебания, распространяющиеся в прилегающем к зоне воздействия лазерного луча миокарде, являются одним из факторов, индуцирующих секрецию провоспалительных цитокинов. Действуя через систему потенциальных механорецепторов (интегрины, белки цитоскелета и сарколеммы), механические стимулы активируют несколько внутриклеточных путей сигнальной трансдукции: МАРК-киназы, JAK сигналы трансдукции и STAT активатор транскрипции и кальций-нейрин зависимый путь. Результатом индукции каскада внутриклеточных сигналов является активирование когнитивных факторов транскрипции NT-B и АР-1, индуцирующих транскрипцию большинства генов цитокинов, в том числе TNF-a и IL-6 [87]. Те, в свою очередь, прямо и опосредованно стимулируют инфильтрацию тканей сердца провоспалительными клетками с формированием зоны асептического воспаления и последующей индукцией основных событий ангиогенеза.
Лазерные установки генерируют импульсы в постоянном или пульсирующем режимах. Примером постоянно действующего лазера является высокоэнергетический ССЬ лазер. Примером пульсирующих лазеров является Ho-YAG лазер (гольмиевый: иттрий-аллюминий-гранатовый лазер) и ХеС1 лазер (эксимерный), которые в свободном режиме имеют длительность импульса до 250 нсек. Параметры, определяющие действие пульсирующих лазеров, следующие: длительность импульса (сек.), энергия импуль са (Дж, Вт), средняя мощность (отношение общей энергии к единице времени), пиковая мощность (энергия импульса/длительность импульса), а также экспозиция излучения или кучность (энергия импульса/площадь облучения).
При взаимодействии с биологическими тканями лазерный луч может абсорбироваться, рассеиваться и частично отражаться тканями [490, 233, 234, 495]. Отражение луча от мышц и крови, как правило, небольшое. Что же касается абсорбции и рассеивания, то это основные факторы взаимодействия лазера с биологическими тканями, которые, прежде всего, зависят от длины волны лазерного излучения.
Аблация возможна при наличии эффективной абсорбции лазерной энергии, в этом случае оптическая энергия, преобразуясь в тепловую, распределяется по относительно малому объему окружающих тканей. Ткани содержат различные эндогенные хромофоры, такие как гемоглобин, белки, вода, которые поглощают различные части спектра. Для разных типов инфракрасного излучения (которые генерируются гольмиевыми, эрбиевыми и С02 лазерами) наиболее важным хромофором является вода, которая имеется в избытке (-80%) в мягких тканях.
Абсорбированная энергия вызывает аблацию тканей разными путями. Для мягких биологических тканей наиболее важны два механизма: термическая аблация и прямая фотоаблация.
Термическая аблация возникает под действием лазерного луча в инфракрасном спектре, что характерно для высокоэнергетичного С02 лазера. При абсорбции лазерной энергии тканевой водой возникает вибрация молекул и происходит быстрое повышение температуры. При этом энергия расходуется на вапоризацию (выпаривание), а температура колеблется от 100 до 150С. После локального высушивания тканей, температура продолжает повышаться до 350-450С, после чего происходит карбонизация (обугливание) и аблация (удаление) тканей, а затем воздействие лазера на новые, более глубоко лежащие слои. Процесс продолжается по мере того, как фронт аблации продвигается глубже в ткани.
Прямая фотоаблация наблюдается при применении лазеров, излучающих в ультрафиолетовом спектре. Примером такого лазера является XeCl (эксимерный) лазер. Высокая энергия фотонов ультрафиолетовых лазеров приводит к возбуждению молекул и переходу их в электрически нестабильное состояние. Подобное возбуждение сопровождается мгновенным нарушением межклеточных и внутриклеточных молекулярных связей в биологических тканях, молекулярной диссоциацией и выбросом разрушенных фрагментов. Молекулы воды, выделяющиеся в процессе разрушения тканей, подвергаются очень быстрому нагреванию и расширению в объеме, что ведет не только к аблации в зоне канала, но и «акустическому удару» окружающих тканей, что по гистологической картине напоминает термическое поражение тканей под действием инфракрасных лазеров [281, 299]. Однако, в отличие от инфракрасных лазеров, лишь небольшая часть пульсовой энергии остается в тканях в виде тепла, обеспечивая тем самым минимальное термическое повреждение окружающих тканей.
Как было отмечено многими исследователями, воздействие лазерного луча на биологические ткани, наносит определенные термические повреждения [239, 197, 234]. Сразу же после лазерного импульса в миокарде определяется четыре концентрических зоны термических изменений: вапоризации, карбонизации, фиксации и зона промежуточных изменений [197].
Модель хронической ишемической болезни сердца1 (макроскопический анализ сердец)
Масса сердец в контрольной группе модели ХИБС (п-5), варьировала в пределах от 38 до 50 грамм, в группах с лазерным, клеточным или комбинированным — лазер плюс клетки воздействиями на перирубцовую область миокарда (п-25), масса сердец была от 34 до 56 грамм. В 3-х из 5 наблюдений контрольной группы и 16-и наблюдениях из 25 в группе с воздействием на перирубцовую область выявлялись аневризмы ЛЖ с максимальными размерами 4x4,5см и минимальными 2,5x2,5см (рис. 9, 10), где первая величина - длинник ориентированный от верхушки к базальной части сердца и второй размер поперечник, максимальный размер аневризмы перпендикулярно ориентированный длиннику. Аневризмы всегда распространялись на переднюю стенку и верхушку с вовлечением боковой стенки ЛЖ. Во всех других наблюдениях, если аневризма не определялась, обнаруживался грубый трансмуральный рубец, сопровождавшийся склерозом эндокарда и эпикарда в его проекции.
Заключая макроскопический анализ, можно с уверенностью говорить о том, что модель ХИБС, сопровождалась грубыми изменениями миокарда ЛЖ с захватом верхушки, передней и боковой стенок, что не могло не сказываться на контрактильной функции сердца, нарушение в этих областях перфузии и вероятнее всего приводило к сердечной недостаточности.
Сейчас в мировой исследовательской практике используются два различных подхода в моделировании ишемической болезни сердца. Так называемые «без инфарктные» ишемические модели и модели с ИМ. Термические повреждения миокарда мелких животных, инъекции цитостатиков в миокард мы не будем рассматривать в нашем анализе.
Первыми, кто использовал модель с фиксированным (80%) инструментальным стенозом проксимальной части передней межжелудочковой нисходящей коронарной артерии для индукции «оглушенного» и гибернированного миокарда у свиней через 7 недель экспланации ишемии был I. Mills с коллегами в 1994 году, продемонстрировав уменьшение перфузии покоя при отсутствии проявлений инфаркта миокарда. И хотя эта группа не изучала контрактильную функцию сердца, они обнаружили депрессию потребления кислорода покоя [324].
В настоящее время широко используются хронические модели на животных с жизнеспособным дисфункциональным миокардом, которые формируют большинство, если не все основные черты гибернированного миокарда у человека. Они включают хроническое уменьшение перфузии покоя и контрактильной функции миокарда, значимо ограничивают коронарный резерв и увеличивают потребление глюкозы миокардом. Эти изменения сопровождаются регионарной . редукцией кальций обрабатывающих протеинов и потерей кардиомиоцитов, вследствие развития вторичного апоптоза.
Продолжительные исследования дисфункции миокарда показали, что состояние хронической оглушённости миокарда с нормальным кровотоком покоя, предшествует гибернации миокарда, эти состояния различаются и протекают в период адаптации миокарда к хронической ишемии. Это показывает, что уменьшение перфузии миокарда в покое, результат, а не причина хронической контрактильной дисфункции миокарда. Таким образом, острая пролонгированная редукция кровотока, может являться начальным стимулом гибернации миокарда [107].
В то же время, чаше всего, к модели хронической ишемической болезни сердца относят модель, выполненную на животных, перенесших инфаркт миокарда [418]. В нашем исследовании формирование ИМ подтверждалось визуальным наблюдением при проведении перевязки передней межжелудочковой коронарной артерии, интраоперационными данными ЭКГ, а также посмертным макроскопическим анализом сердец, после эвтаназии животных. Когда у всех животных были найдены грубые рубцовые изменения миокарда, что в 2/3 наблюдений сочеталось с формированием хронических аневризм в области передне-боковой стенки Л Ж с захватом верхушки.
Доказано, что именно такие модели могут приводить к сердечной недостаточности у животных и, как было показано, сочетаются с высоким риском развития спонтанных ишемических желудочковых аритмий [229].
Считается, что независимо от используемого типа клеток в проводимом лечении, основанном на использовании клеточных технологий, выбор для моделирования животных имеет существенное значение для получения аналога ИБС и развития теоретических аспектов с последующим внедрением полученных результатов в клиническую практику. В основе множества ранних исследований клеточной терапии патологии миокарда были использованы модели острой ишемии. В результате эффективное лечение острой ишемии миокарда в настоящее время широко применяется в клинике.
Это комплекс из процедур тромболизиса, коронаропластики и коронарного шунтирования, в то время как для хронической миокардиальной ишемии выбор вариантов лечения в ряде случаев ограничен. Также, обращают внимание, что большинство моделей ишемии миокарда выполнены и выполняются в настоящее время на грызунах. Сейчас абсолютно ясно, что такие модели на маленьких животных эффективны для изучения энграфтинга стволовых клеток. Однако, значительные различия в анатомии и физиологии миокарда создают серьезные проблемы для последующего перенесения полученных данных на человека. Модели на крупных животных лучше соответствуют сердечным заболеваниям человека, возможна полная оценка энграфтинга стволовых клеток, их дифференциации и функциональных улучшений. На моделях крупных животных возможна более глубокая функциональная оценка миокарда, включая ангиографию, эхокардиографию, сцинтиграфию миокарда. В то же время авторы отмечают, что соответствующих линий стволовых клеток для клеточной терапии подобных моделей с использованием крупных животных недостаточно [172].
Лимитирующим фактором развития моделей для клеточно-опосредованной терапии миокарда у крупных животных является необычайно узкий выбор диагностических антител, необходимых для последующей оценки процессов ангиоваскулогенеза и/или репарации миокарда.
Наше исследование полностью соответствует критериям, ориентированным на развитие моделей сердечно-сосудистой патологии у животных. Во-первых, работа выполнена на крупных животных -беспородных собаках. Во-вторых, реваскуляризация миокарда выполнялась через 3 месяца после моделирования инфаркта миокарда в условиях развившейся хронической ишемии миокарда. В представленном исследовании изучали как изолированное, так и комбинированное воздействие на миокард лазерных и клеточных технологий.
Несколько примеров, иллюстрирующих сроки выполнения клеточно-опосредованных процедур или вариантов непрямой реваскуляризации миокарда у крупных животных от момента моделирования инфаркта, которые мы встретили при анализе литературы.
Так, в острой модели иифаркта-реперфузии, время окклюзии передней нисходящей коронарной артерии составило 2 часа. На следующие сутки были имплантированы мононуклеарные клетки костномозгового происхождения и несепарированные клетки костного мозга для оценки их влияния на функцию миокарда [335].
Georg Lutter с коллегами (2002), выполнили эксперимент на свиньях, однако ишемия миокарда составляла только одну неделю. Так же, недельным сроком было ограничено время экспланации после моделирования ИМ у свиней при исследовании распределения аутологичных клеток костного мозга при их интракоронарной имплантации [512].
В постинфарктной модели на свиньях с целью усиления ангиогенеза, было проведено исследование в сроки 3 недели после моделирования ИМ [244]. Реперфузионная модель выполнена на свиньях, в условиях 90 минутного пережатия средней трети передней межжелудочковой артерии с целью последующей интракоронарной имплантацией клеток, в сроки 4 недели от момента моделирования ИМ [285].
К близкой модели для наших исследований, по срокам экспланации после ИМ, следует отнести модель ХИБС - со сроком более 10 недель после моделирования ИМ у овец, с перевязкой передней нисходящей и первой диагональной коронарных артерий с целью изучения репарации и ангиогенеза на основе лазерной реваскуляризации. [425].
В другой модели на собаках, с подходами аналогичным нашим, экспозиция после моделирования ИМ была более 8 недель, на этой модели ХИБС, авторы изучали комбинированное воздействие кардиомиогенного фактора и прекультивированных аутологичных взрослых мезенхимальных стволовых клеток с целью восстановления функций миокарда [84]. Необходимо также заметить, что моделирование процессов на собаках является значимой в истории медицины, ещё William Harvey в 17 веке проводил свои исследования по циркуляции крови на этих животных [442].
Обзорная микроскопия мест воздействия ТМЛР и имплантации МФККМ в лазерные каналы
Практически все морфологические черты ТМЛР и имплантации МФККМ в лазерные каналы могли обнаруживаться при сочетании этих двух методов реваскуляризации миокарда. Однако интрамиокардиальный ангиоматоз, мог наблюдаться только при имплантации стволовых клеток в лазерные каналы (рис. 40), причем в элементах формирующих ангиоматозные структуры, сохранялась пролиферативная активность (рис. 41 и рис. 42).
Более того, можно констатировать, что именно для этого варианта реваскуляризации было более равномерное распределение сосудистых образований в миокарде в области лазерного воздействия (рис. 42), без акцентированной ориентации на субэпикардиальный слой миокарда.
Так же как и для ТМЛР, были характерны формирование крупных синусоидальных сосудов, по частоте ответвлений больше напоминающих сосудистые клубки (Рис. 43, 44). Кроме крупных синусоидов, также наблюдались и небольшие синусоидальные сосуды в области воздействия (рис.45).
Представленная морфологическая картина в группе сочетания ТМЛР с имплантацией стволовых клеток, отражает картину ангио- и васкулогенеза -появление ангиоматозных структур. Сам процесс, сосудистого «созревания» еще незакончен к концу 1-го месяца после проведенной реваскуляризации.
Необходимо обсудить особенности формирования разноразмерных синусоидных сосудов, которые обнаруживаются чаще непосредственно в области лазерного воздействия или примыкают к нему.
Для удобства обсуждения мы привлечем схему миокардиального кровотока, предложенную несколькими поколениями морфологов, занимавшихся особенностями сердечной циркуляции (рис.46).
R. Truex и M.J. Schwartz B.S., (1951) изучая на щенках собак, а также у взрослых собак, особенности венозной системы в области атриовентрикулярного узла и предсердно-желудочковых соединений, обратили внимание на сосуды синусоидного типа, размерами от 10 до 100 мкм с наибольшем диаметром. Для этих сосудов было характерным, большой просвет, относительно толщины сосудистой стенки, сама сосудистая стенка представляла собой лишенную мышечных элементов с тонким слоем соединительной ткани, местами слабо дифференцирующийся и хорошо видимый эндотелиальный слой. Форма могла быть самой разнообразной. Ими так же описаны подобные образования в ЛЖ, при ряде инфекционно 1 токсических состояниях у людей. Была так же выдвинута гипотеза, о возможности формирования аномальных сосудов синусоидного типа, при возникновении аномального кровотока - в направлении противоположном обычному, или их артериализации, что подтверждалось результатами тотального сердечного венозного блока при перевязке сердечного синуса и всех видимых вен сердца [462].
Интересные результаты были представлены в прямо противоположном эксперименте, когда полная перевязка устья правой коронарной артерии, а также устьев передней нисходящей и левой огибающей артерий не приводила к полной остановке кровотока через венозный синус [460].
Следует также отметить, что до сегодняшнего дня этот вопрос является остро дискуссионным. Фантом сосудов синусоидного типа реет над непрямой реваскуляризацией миокарда, ряд авторов с не скрываемым скепсисом и раздражением, резко высказываются относительно выявления подобных сосудистых образований в миокарде, утверждая, что миокард не рыхлая губка. С последним утверждением трудно не согласиться.
Вероятно, что эти авторы, во-первых, не морфологи, а во-вторых, если морфологи, то в лучшем случае не принимавшие участия в изучении подобных объектов, в худшем эти специалисты только считают себя морфологами [463].
К сожалению, упомянутые выше авторы поставили под сомнение результаты первопроходцев в области непрямой реваскляризации, показавших, что синусоидальные сосудистые образования являются постоянным спутником ТМЛР, участвующим в усилении кровоснабжения миокарда и обнаруживаемым в местах лазерного воздействия [123].
Более того, еще большей и откровенной спекуляцией выглядит выдернутое из контекста функционирование сосудистых синусоидов печени и селезенки в условиях патологических состояний, когда на самом деле может определяться прерывистая базальная мембрана.
Ну и конечно не обошлось без прямого передергивания фактов. В классическом описании синусоидных образований левого желудочка Wearns с коллегами в 1933 году [486] не упоминали о базальной мембране сосудов, обращалось внимание на нерегулярность просветов этих сосудистых образований [99; 497].
По нашему мнению - нетипичные формы сосудообразования, такие как формирование ангиоматозных структур и крупных сосудов синусоидного типа от 40 до 1000 мкм и более во многом являются следствием нетипичных условий формирования подобных образований.
Так A. Pettersson с коллегами в 2000 году, наблюдая изменения сосудистого русла связанные с инъекцией рекомбинантного VEGF, описывала появление дилатированных, часто извитых сосудов синусоидного типа. Крупные синусоиды, по прошествии времени, трансформировались в менее крупные сосуды, путем формирования «эндотелиальных мостиков» или приобретали развитую сосудистую стенку, преобразуясь в относительно крупные артерии и вены [403].
Формирование похожих сосудистых образований наблюдали и другие авторы при опухолевом ангиогенезе, хотя в меньшей степени, а также при репаративных процессах в миокарде и заживлении раневой поверхности [375, 193].
Появление ангиоматозных образований в тканях рассматривается рядом авторов в качестве одного из осложнений, которое сопровождает высокие дозы рекомбинантного VEGF [280, 372].
Таким образом, отмеченное нами формирование ангиоматозных структур и крупных сосудов синусоидного типа, скорее всего, обусловлено действием VEGF. Это предположение согласуется с полученными нами данными ОТ-ПЦР, подтверждающими высокий уровень экспрессии VEGF в миокарде через две и даже через четыре недели.
Вероятно, этот же механизм лежит в основе разрастания дилатированных, чрезмерно извитых синусоидных образований, возможно принадлежащих, к системе лимфатических сосудов. Что так же наблюдалось при индукции сосудообразования высокими дозами VEGF и приводило к формированию очень крупных щелевидных структур с расширенным просветом неправильной формы [349].
Образование ангиоматозных структур чаще ассоциировалось с эпикардом и подлежащими зонами миокарда. Отчасти это можно объяснить частичной миграцией имплантированных клеток костного мозга в зону эпикарда по лимфатическим капиллярам по градиенту гемодинамического давления.
Кроме того, Pettersson А. с коллегами (2000) в своем исследовании наблюдали, что инъекция равных доз рекомбинантного VEGF в различные ткани, в частности в подкожную жировую клетчатку и поперечно-полосатую мышцу, стимулировала гетерогенный по интенсивности и продолжительности региональный ангиогенез, более значимый при локализации рекомбинантного VEGF в подкожной клетчатке. Таким образом, более выраженная способность эпикарда к индукции ангиогенеза в ответ на действие ангиогенных факторов - другое возможное объяснение частого появления очаговых ангиоматозных структур локализованных в эпикарде.
В то же время, можно указать на снижение интереса к морфологическому анализу экспериментальных материалов и даже полному отказу от него, некоторыми авторами. Во всем полагаясь только на продвинутые лучевые методы исследования, такие как МРТ [335].
В аналитической работе, прослеживающей судьбу и исходы лазерных каналов Peter Whittaker (1999) в качестве позитивного примера использовал иллюстрацию лазерного канала (рис. 47), остающегося открытым 86 дней, с большим количеством межсосудистых связей и открывающегося в полость ЛЖ. Необходимо добавить, что лазерный канал был выполнен с использованием эксимерного лазера. На наш взгляд это сосудистое образование было типичным сосудом синусоидного типа [497].
Надо сказать, что в этом мы не одиноки. Так, Lu с соавторами (1999) наблюдали сосуды синусоидного типа в области лазерного воздействия на миокард, спустя 60 дней [294].
Мы полагаем, что формирование сосудов синусоидного типа обусловлено непростой комбинацией ряда процессов. Во-первых, это тканевая реакция на термическое повреждение, во-вторых, нарушение целостности ткани от эпикарда до эндокарда, в третьих зона лазерного канала со стороны эндокарда контактирует с большим объемом крови, в четвертых, сердце - это обильно васкуляризированный орган и наконец последнее, миокард продолжает сокращаться. Кроме этого следует учесть, что 5 слоев образующих стенку сердца могут реагировать неодинаково, а так же степень повреждения относительно центра воздействия неоднородна. Любые попытки объяснить всё будут спекуляцией, но в итоге мы получаем обильно васкуляризированный рубец с разнокалиберными сосудами по размеру и нерегулярными по форме просвета, чаще синусоидного типа, когда может не наблюдаться собственная стенка или она слабо выражена, но сосуды функционирует в соединительнотканном каркасе.
Результаты кардиометрии миокарда- перирубцовой, зоны с воздействием лазер+клетки в сопоставлении с моделью ХИБС
На рис.53 представлен этап работы специальной программы, подготовленной для кардиометрии миокарда перирубцовой зоны.
Критериями включения или исключения являлись, размеры ядра, их форма, округлая или овальная, а также интенсивность флюоресценции этидиума бромида
Результаты представленных в таблице 10 отражают значимое увеличение численной плотности ядер кардиоцитов в группе с воздействием на миокард «лазер плюс клетки», при сравнении с численной плотностью ядер кардиоцитов перирубцовой зоны миокарда модели постинфарктного рубца. В то же время суммарная площадь изучаемых объектов и количество изученных ядер оказались достаточными для проведения статистического анализа.
Абсолютные показатели суммарной площади ядер кардиоцитов на тестовую площадь 39437мкм2, представленные в табл. 11, так же как и относительные показатели среднего процента площади ядер кардиоцитов значимо и достоверно возрастают при воздействии на прерирубцовую область миокарда в группе «лазер+клетки».
Продолжая тему кардиометрии кардиоцитов, в табл. 12 представлены результаты, показывающие общее увеличение средних абсолютных размеров самого ядра, его площади и «идеального» диаметра при воздействии на миокард «лазер+клетки» в сравнении с контролем - моделью ХИБС.
В таблице 13 представленные денситометрические результаты показывают, что нет различий в максимальном и минимальном уровне флюоресценции, что в свою очередь отражает однородность ядер и как следствие этого их состояний, анализируемых групп кардиоцитов из контроля ХИБС и после воздействия «лазер плюс клетки».
Общепринятой точкой зрения на сегодняшний день, является гипотеза постулирующая — сердце «постмитотический орган». Кардиомиоциты человеческого сердца не могут регенерировать по гиперпластическому типу.
Вместо этого оно может только формировать рубец в ответ на некроз и воспаление. Потеря контрактильных тканей миокарда вызывает застойную сердечную недостаточность. В то же время, некоторые земноводные регенерируют свои сердца. Регенерация основывается на пролиферации кардиоцитов. В дополнение, кардиомиоциты теплокровных пролиферируют только в течение фетального развития. Пролиферация кардиоцитов достигает максимума при формировании сердца и останавливается сразу после рождения, в последующем рост сердца обусловлен увеличением размеров кардиоцитов [72].
В этом смысле показательна работа Moore GW с соавторами, выполненная в 1980г., продемонстрировавшая, что с увеличением сердца человека процент кардиомиоцитов не меняется, приблизительно составляя 75% от объема всего сердца, что так же характерно и для нормального сердца. На контрасте с этим плотность ядер снижается пропорционально увеличению сердца [336].
На этом фоне, казалось бы сердце без работы должно атрофироваться с увеличением плотности ядер. Однако результаты Kinishita М. с соавторами (1996), продемонстрировавших проявления кардиоцитарной атрофии при проведении обхода ЛЖ с помощью аппарата вспомогательного кровообращения в течение месяца, без изменений плотности ядер [253].
Интересно выглядят результаты, полученные Lim Н с соавторами (1999), которые при использовании модели хронической ишемии у свиней с трехмесячной ишемией, без очевидных некротических изменений миокарда, выявили регионарную потерю ядер кардиоцитов (35%) за счет включения механизмов апоптоза на фоне регионарной гипертрофии. Эта была первая работа в этом направлении, показавшем связь между хронической ишемией и ишемической кардиомиопатией [292].
В следующей работе эта группа подтвердила результаты предыдущего исследования, усилив значение недостаточности кальциевой атефазы саркоплазматического ретикулума кардиоцитов в зоне формирования ишемии [147].
В более позднем исследовании на инфарктной окклюзии с 90 минутной экспозицией, проведенной на миниатюрных свиньях, сразу за которой следовала интракоронарная инъекция МСК или МФККМ. Было показано что, ФВ ЛЖ была обратно пропорциональна уровню апоптоза. В то же время, ФВ ЛЖ позитивно коррелировала с количеством кровеносных сосудов и экспрессией VEGF и bFGF в зоне инфаркта. Авторы заключили, увеличение экспрессии VEGF и bFGF, уменьшает апоптоз в кардиоцитах, реализуя тем самым клеточно-опосредованный паракринный механизм [289].
К аналогичному объяснению влияния клеточной терапии, через паракринные, клеточно-опосредованные механизмы, пришли авторы, изучавшие на ишемической и доксирубициновой моделях у мышей, клеточную и цитокиновую терапии. В своей работе они показали антиапоптотическое действие цитокиновой и в большей степени клеточной терапии на кардиоциты с использованием МФККМ. Уменьшалась рубцовая зона, увеличивалась плотность сосудов [290].
Одна из работ, выполненная на модели хронической ишемии миокарда у свиней, продемонстрировала увеличение жизнеспособности миокарда после ТМЛР на основе увеличения плотности кардиомиоцитов в области лазерного воздействия, что привело к реваскуляризации и увеличению плотности миофиламентов кардиомиоцитов спустя 4 недели после ТМЛР [82].
Приведенные выше результаты во многом согласуются с нашими данными, также показывающими увеличение плотности ядер кардиомиоцитов в зонах реваскуляризации с воздействием «лазер плюс клетки».
Для последующего научного прорыва, необходим был новый подход к измерению пролиферативного потенциала кардиоцитов, такой подход в 2001 г. продемонстрировала группа авторов во главе с А.Р Beltrami [89].
Ранее проведенный анализ с использованием электронной микроскопии оказался неточен. Было найдено, что популяция кардиоцитов в состоянии митоза, составляет 0,015%. В принципе, этого достаточно для восстановления 100 гр миокарда за менее, чем 3 месяца [243]. Новый подход к оценке заключался в тщательном морфологическом анализе Ki-67 позитивных ядер кардиомиоцитов, в сердцах пациентов, умерших в результате ИМ, на 4-12 день после ИМ. Известно, что Ki-67 антиген отличается выраженной экспрессией в ярдах млекопитающих в период митоза. Известна также средняя длительность митоза 30 минут, периоды клеточного цикла между митозами 25 часов. Было показано, что нормальный ЛЖ содержит 5,5x109 кардиомиоцитов и 3,8x109 кардиомиоцитов после ИМ. Выявлено, что в интактном миокарде 11 кардиомиоцитов в состоянии митоза (Ki-67 позитивных) на 106 кардиоцитов. В миокарде инфарцированного желудочка 520 (Ki-67 позитивных) на 106 (из которых, в периинфарктной зоне 775 на 10б и 264 на 106 в отдалении от периинфарктной зоны). Далее проведенные расчеты показали, что в нормальном ЛЖ 60500 кардиоцитов в состоянии митоза, и 1976000 в инфакцированном миокарде. Было предположено, что подобная клеточная пролиферация при ИМ может происходить из пролиферирующего пула резидентных региональных клеток миокарда или за счет циркулирующих клеток костномозгового происхождения. Эти подсчеты показали возможность регенерации миокарда за счет гиперплазии, оставив на повестке дня два источника, резидентные или регионарные камбиальные элементы миокарда и циркулирующие, костномозгового происхождения [89].
Однако, в своей ранней работе Orlic D. с соавторами (2001) показали, что имплантированные в границу инфаркта клетки костного мозга не мигрируют в интактный миокард, поэтому остается возможность клеточного хоуминга в область инфарцированного миокарда. Это в значительной степени сконцентрировало исследователей на возможность восстановления миокардиоцитов за счет циркулирующих клеток костномозгового происхождения с их последующим энграфтингом [364].
В экспериментах на животных, используя инъекцию культурированных клеток или мобилизованных стволовых клеток индуцированных ростовыми факторами стволовых клеток, Donnald Orlic с коллегами первыми продемонстрировали возможность быстрой регенерации миокарда.
Похожие диссертации на Направленный ангиоваскулогенез при хирургическом лечении ИБС (клинико-экспериментальное исследование)
