Содержание к диссертации
Введение
CLASS ГЛАВА I. Обзор литературы CLASS 8
1.1. Механизмы накопления фотосенсибилизатора в опухоли ... 8
1.2. Механизмы флуоресценции и ФДТ 11
1.3. Фотодинамическая диагностика 20
1.4. Фотосенсибилизаторы 32
CLASS ГЛАВА II. Материалы и методы 3 CLASS 9
2.1. Аппаратура 40
2.2. Подготовка больного к колоноскопии 42
2.3. Методика колоноскопии 43
2.4. Визуальная эндоскопическая
диагностика полипов 45
2.5. Методика флуоресцентной диагностики 58
CLASS Глава III. Результаты исследования 6 CLASS 4
Заключение 94
Практические рекомендации 104
Выводы 105
Список литературы 107
- Механизмы накопления фотосенсибилизатора в опухоли
- Механизмы флуоресценции и ФДТ
- Аппаратура
- Подготовка больного к колоноскопии
Введение к работе
Несмотря на достижения современной онкологии, проблему диагностики и лечения злокачественных новообразований нельзя считать решенной. Лечение оказывается успешным для большинства больных только при начальных стадиях рака, диагностика которых представляет наибольшую сложность. У 1\3 больных в* момент установления диагноза отмечается далеко зашедший процесс. У подавляющего большинства из них после хирургического лечения в ближайшие 1-2 года возникают рецидивы в зоне операции или отдаленные метастазы, от которых больные погибают. При этом излечение и пятилетняя выживаемость составляет не более 10%.
Частота рака толстой кишки, так же как и рака некоторых
других локализаций, неуклонно увеличивается. По данным
В.И.Чиссова, В.В.Старинского и др.(2005г.) в России в 2004 году
прирост показателя заболеваемости злокачественными
новообразованиями, по сравнению с предыдущим годом, составил 2,8%, по сравнению с 1994 годом - 12,7%. При этом лишь 0,7% новых случаев рака диагностированы в стадии- in situ, 43;3% - во II стадии, в 24,8% - в III стадии, 23,3% - в IV стадии, стадия не была установлена в 7,9% наблюдений [35]. Аналогичные результаты были получены при анализе онкологических заболеваний в гор.Москве. Рак толстой кишки был выявлен в 2006 году у 4328 человек, из них IV стадия заболевания в 1107 случаев. Запущенная (IV стадия) рака прямой кишки была диагностирована у 389 из 1588 больных, что составляет 24,5%. Среди других онкологических заболеваний рак толстой кишки в 2006 году по частоте занял первое место.
Многочисленными клиническими, морфологическими и эндоскопическими исследованиями, обобщенными в трудах Веселова В.В.(1997, 2000, 2005), установлено, что исходные изменения
4 слизистой оболочки толстой кишки имеют определенное значение в развитии рака [7,8,9]. Это четко показано на примере аденоматозных полипов, в удаленных тканях, в которых нередко обнаруживаются очаги инвазивной карциномы [109,194]. Неоперированные больные с семейным аденоматозом практически все погибают от рака толстой кишки [195].
Прогресс' в молекулярной биологии привел к открытию наследственных генетических дефектов, приводящих к развитию рака. Некоторые наследуемые дефекты приводят к стократному повышению риска возникновения злокачественных опухолей. В ряде случаев, вероятность развития рака у носителей этого наследуемого дефекта достигает 100%.
Молекулярным субстратом наследственной формы рака являются-унаследованные от родителей терминальные мутации в одном аллеле гена супрессора или мутаторного гена. Этот дефект поражает все соматические клетки потомков, а мутации во втором аллеле, которые приводят к малигнизации клетки, являются приобретенными и чаще всего носят случайный характер.
Семейный аденоматозный полипоз толстой кишки (САПТК) во многие десятки раз повышает риск возникновения рака ободочной и прямой кишок. Проведенные молекулярные исследования показали, что причиной развития этого наследственного синдрома является терминальная мутация в ген АРС (adenomatous polyposis coli), который находится на хромосоме 5q. Этот мутированный ген обнаруживается практически без исключения во всех семьях с аденоматозным полипозом толстой кишки и синдромом Гарднера. У 90% носителей этого гена к 45 годам развивается рак толстой кишки. К наследственным формам рака толстой кишки относятся и неполипозный рак толстой кишки (ННРТК). Причиной возникновения этого рака являются мутации в одном или нескольких генах,
5 отвечающих за репарацию ДНК (DNA mismatch repair genes). Чаще мутации наблюдаются в генах hMSH2 и HMSH1. У носителей терминальной мутации в этих генах кумулятивный риск возникновения рака толстой кишки в течение жизни (до 75 лет) равен 80%. Для САПТК и ННРТК характерен аутосомно-доминантный тип наследования.
В начальный период своего развития в тканях полипа развивается один или несколько очагов злокачественной трансформации эпителия - «фокал-кацинома». В этих случаях щипковая биопсия, взятая «вслепую» вне зоны развития карциномы, даст отрицательные результаты, что нередко приводит к планированию неправильной лечебной тактики. Очаги злокачественной трансформации трудно, а часто невозможно выявить во время эндоскопического исследования из-за небольших размеров опухоли, а между тем лечение в этот период дает наилучшие результаты. Вот почему разработка способов выявления очагов малигнизации крупных и мелких полипов является важной задачей современной онкологии. Одной из перспективных направлений для решения данной задачи является разработка и внедрение в клиническую практику методов флуоресцентной диагностики (ФД) очагов малигнизации полипов прямой и ободочной кишок.
Фотодинамическая диагностика широко применяется для установления злокачественных новообразований кожи, пищевода, мочевого пузыря и ряда других органов. Для диагностики малигнизированных полипов прямой и ободочной кишок флуоресцентный метод не применяется и по этому вопросу в литературе отсутствуют сообщения.
Учитывая высокую актуальность проблемы раннего распознавания малигнизированных полипов толстой кишки, обусловленную высокой частотой заболевания, трудностью
диагностики выявления участков малигнизации полипов толстой кишки на основании результатов общепринятых способов исследования, частым развитием заболевания у трудоспособного населения, отсутствием работ, специально посвященных данной проблеме, мы проанализировали результаты комплексной диагностики у 103 больных с одиночными и множественными полипами прямой и ободочной кишок.
Для выявления участков малигнизации полипов прямой и ободочной кишок нами применялись: эндоскопия с биопсией, фотодинамическая диагностика участков «свечения», электроэксцизия полипа, гистологическое изучение удаленного полипа.
Цель работы:
Улучшение результатов лечения малигнизированных полипов толстой кишки за счет ранней фотодинамической диагностики и комплексных способов установления диагноза.
Задачи исследования:
Определить показания и противопоказания для флуоресцентной диагностики малигнизированных полипов толстой кишки.
Апробировать методику введения Аласенса для определения участков малигнизации полипов.
Провести сопоставление результатов биопсий из участков свечения с результатами предварительной биопсии, выполненной во время колоноскопии.
Определить преимущество колоноскопического обследования полипов после введения препарата Аласенс, по сравнению с обычным эндоскопическим исследованием.
5. Уточнить диагностические возможности флуоресцентных
способов выявления очагов рака в полипе и выявить расхождения
7 между эндоскопическом осмотром и фотодинамическим исследованием.
Научная новизна:
Впервые применен флуоресцентный метод диагностики при полипах толстой кишки и доказана его высокая диагностическая информативность в выявлении очагов малигнизации.
Научно-практическая значимость:
Применение флуоресцентного метода дает возможность оптимизировать диагностику очагов малигнизации полипов толстой кишки, что позволяет в большем проценте случаев диагностировать ранние формы рака толстой кишки.
Разработана комплексная методика эндоскопического и флуоресцентного исследований, позволяющая диагностировать с морфологическим подтверждением малигнизированные полипы и полипы, недоступные рутинной эндоскопической диагностике. Полученные данные делают обязательным динамическое наблюдение всех больных после удаления полипов и меняют представления о частоте одиночных полипов толстой кишке.
Положения, выносимые на защиту:
Для диагностики ранних форм малигнизации полипов толстой кишки необходимо применять фотодинамическую диагностику с выполнением биопсии из участков флуоресценции.
Одиночные полипы встречаются реже, чем это принято считать. За счет флуоресценции, гистологического исследования удается
8 выявить полипы, невидимые глазом, в том числе и при рутинном эндоскопическом исследовании.
3. После эндоскопического удаления малигнизированных полипов во всех случаях необходимо выполнять эндоскопические контрольное исследование и удаление очагов подозрительных на малигнизацию.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Механизмы накопления фотосенсибилизатора в опухоли.
Фотодинамическая диагностика и терапия являются двухкомпонентным методом. Одним компонентом является фотосенсибилизатор, накапливающийся в опухоли при его введении в организм любым способом и задерживающийся в новообразовании дольше, чем в нормальных тканях. Другим компонентом диагностики и лечения является световое воздействие. При локальном облучении опухоли светом определенной длины волны, соответствующей пику поглощения фотосенсибилизатора в опухоли, начинаются процессы, вызывающие красное «свечение» и происходит фотохимические реакции с образованием синглетного кислорода и кислородных свободных радикалов, оказывающих токсическое действие на опухолевые клетки. Опухоль резорбируется и постепенно заменяется соединительной тканью.
В 1955г. Samuel Schwarz путем ацетилирования и восстановления получил порфириновую смесь, которую назвал производными гематопорфирина (ПГП) [175]. В экспериментах на животных, а затем испытаниях в клинических условиях Lipson [116,119,120,124] применил ПГП для флуоресцентной диагностики различных форм рака.
Механизм преимущественного накопления фотосенсибилизатора в опухоли, по-видимому, связан с некоторыми свойствами самой опухоли. Так, в большинстве опухолей отмечается повышенное количество рецепторов для липидов низкой плотности; низкой РН; наличие в опухолевой строме активных макрофагов; повышенная проницаемость сосудистой сети, повышенный синтез коллагена, с которым активно связываются порфирины [52,53,139] и высокий
10
аффинитет липидов к липидным красителям. Все эти факторы
определенно способствуют селективному накоплению
фотосенсибилизатора в опухолевой ткани, хотя механизмы,
обеспечивающие преимущественное распределение
фотосенсибилизатора в опухоли, остаются до конца непонятными.
Исследования показывают, что многие виды опухолевых клеток экспрессируют большое количество мембранных рецепторов для липопротеина низкой плотности, при этом происходит поглощение фотосесибилизатора, связанного с липопротеинами низкой плотности путем эндоцитоза. В этих случаях фотосенсибилизаторы в основном локализуются в мембранных доменах [179], что определяет характер фотоповреждения опухоли путем их некроза и апоптоза [196].
Некоторые авторы предполагают, что некроз опухоли при фотодинимической терапии является результатом повреждения ее сосудов путем деструкции экстрацелюлярного матрикса и повреждения коллагеновых волокон [125,138].
В работах ряда авторов было показано, что опухоле-ассоциированные макрофаги захватывают большое количество фотосенсибилизатора, что обеспечивает селективное накопление в опухоли агрегированных форм красителя [41,105,106].
Флуоресцентным и радиоизотопными методами было показано, что многие фотосенсибилизаторы накапливаются преимущественно в сосудах опухоли, и пусковым моментом в развитии сосудистых изменений при ФДТ является повреждение эндотелия. При морфологических исследованиях, выполненных после динамической терапии, часто диагностируется некроз эндотелиальных клеток, тромбоз мелких сосудов, порозность сосудистой стенки [107,108,134,192], при этом венулы наиболее чувствительны к фотодинамическому воздействию. Во многих работах показано, что в эндотелии вен концентрация супероксиддисмутазы достоверно ниже,
чем в эндотелии артерий. Это создает условие для генерации более высоких концентраций супероксид-аниона, что приводит к выраженному повреждению эндотелия венул [36,133,162].
В значительном числе работ показано, что одной из причин
селективного накопления фотосенсибилизатора является более низкий
рН межклеточной жидкости в опухоли, чем в нормальных тканях за
счет избыточного производства молочной кислоты при активном
гликолизе в раковых клетках. В то же время, внутриклеточный* рН7 в
опухоли такой же или немного выше, чем в нормальных клетках.
Такие соотношения. рН в опухоли и липофильность
фотосенсибилизатора положительно влияет на увеличение
селективного захвата красителя опухолью
[60,71,72,73,85,153,185,187,188 и др.].
Учитывая высокую актуальность проблемы ранней диагностики малигнизированных полипов толстой кишки, обусловленную высокой частотой заболевания, трудностью диагностики выявления участков малигнизации полипов толстой кишки на основании результатов общепринятых способов диагностики, частым развитием заболевания у трудоспособного населения, отсутствием .работ, специально посвященных данной проблеме, мы проанализировали результаты» комплексной*-диагностики и эндоскопического лечения* у 103 больных с одиночными и множественными'полипами прямой кишки.
Для выявления участков малигнизации полипов прямой и ободочной кишок нами применялись: эндоскопия- с биопсией, флуоресцентная диагностика с биопсией участков «свечения», электроэксцизия полипа.
Механизм проникновения фотосенсибилизатора внутрь клетки не совсем ясен. Возможно, сенсибилизатор проникает методом диффузии [177]. Учитывая, что порфирины имеют тенденцию
12 накапливаться в тканях с высокой концентрацией рецепторов к липопротеинам низкой плотности, то порфирины могут переноситься в клетки посредством рецепторно — опосредованного механизма [11,42,131].
Заключение: как видно из приведенных литературных данных, селективное накопление фотосенсибилизатора в опухоли, по-видимому, обусловлено отличительными свойствами самой опухоли и в меньшей степени свойствами применяемого фотосенсибилизатора. Все изученные фотосенсибилизаторы обладают повышенным сродством к тканям, имеющим высокое содержание ретикулоэндотелиальных компонентов (печень, почки, селезенка, головной мозг и др.) и длительно задерживаются в этих тканях [6,38,54]. Накопление в опухолевой ткани фотосенсибилизатора происходит за счет длительной задержки фотосенсибилизатора опухолью и более быстрого выведения его из здоровой ткани.
В настоящее время ведутся исследования по увеличению избирательного накопления фотосенсибилизатора в опухоли за счет конъюгации с моноклональными антителами [93,173] и липосомами [47,94,157,164], применения местных анестетиков и препаратов для локального уменьшения рН [11].
1.2 Механизмы флуоресценции и ФДТ.
Историческая справка.
Солнечный свет для лечения псориаза, рахита применялся в древнем Египте, Индии, Китае. В тот период было известно, что солнечный свет может негативно влиять на активность одних лекарственных средств и быть необходимым компонентом положительного действия других. Сторонником гелиотерапии были Геродот, Гиппократ, Клавдий Гален. В трудах Гиппократа (corpus
13 Hippocraticum, 460-375 гг. до н.э.) [89] дается наиболее детальное сообщение о физиологических эффектах воздействия солнечного света на организм человека.
Прообразом современной ФДТ можно считать попытки древних египтян применять светопоглощающие препараты при кожных заболеваниях. Из древних исторических источников известно, что в Древнем Египте еще 6000 лет назад применяли растительные препараты, вызывающие реакцию в тканях. Этими препаратами лечили депигментированные участки кожи (витилиго), которые ошибочно принимали за проявление проказы. Использовали природные фотосенсибилизаторы (псоралены), содержащиеся в таких растениях, как пастернак, петрушка, зверобой, активирующиеся солнечным светом. После аппликации порошка из этих растений на депигментированные участки кожи и последующей инсоляции ярким солнечным светом на них появлялась пигментация по типу солнечного загара.
В 1550г. до н.э. фотомедицинские процедуры уже были описаны
в Эберском папирусе и священной индийской книге «Atharva Veda».
Основными показаниями к фотолечению были беспигментные очаги
кожи, расцениваемые как лепрозные, большинство из которых,
вероятно, были витилиго (лейкодерма). В соответствии с древней
индийской медицинской литературой применение черных семян
растения «Бейвечи», или «Вейсучайка», сопровождалось экспозицией
под прямым солнечным светом. В последующем оно было
идентифицировано как Psoralena corylifolia. Это растение содержит
псоралены (фурокумарины), являющиеся анаэробными
фотосенсибилизаторами. Это же растение упоминается как средство лечения витилиго в буддистской литературе примерно с 200 г. н.э. и в китайских документах периода Сунь 10-го столетия. В своей знаменитой книге «Mofradat Al Adwiya»( 13-е столетие, Египет) Ибн
14 Эль Битар описал лечение депигментированных очагов кожи (витилиго) тинктурой из меда и порошка семян растения, называемого «Aatrillal», которое в изобилии произрастало в долине реки Нил. Aatrillal был идентифицирован как растение, называемое Ammi majus (амми большая, или китайский тмин), содержащие различные псоралены. После системного применения смеси из порошка семян амми, чаще с медом, «путем слизывания» больному рекомендовали сидеть на ярком солнечном свете в течение 1 или 2 ч, чтобы солнечные лучи падали на депигментированную кожу. Солнечный свет способствовал активации псораленов. Фотодинамическая реакция в лейкодерме приводила к везикуляции (образование пузырей), которая сопровождалась реэпителизацией и репигментацией.
Содержащиеся в растении соединения фурокумаринов обладают свойством сенсибилизировать кожу к действию света и стимулировать образование в ней пигмента меланина, что способствует восстановлению пигментации кожи. В наши дни из амми получен препарат аммифурин, содержащий смесь трех фурокумаринов (изопимпинеллина, бергаптена, ксантотоксина). Его применяют при витилиго, псориазе, красном плоском лишае, нейродермите.
В прошлом столетии в Египте были проведены интенсивные исследования псораленов: Были выделены из растений и химически проанализированы активные ингредиенты. Вскоре после этого главное, наиболее важное соединение 8-метоксипсорален было использовано для лечения псориаза. Фотосенсибилизация и фотохимические реакции при использовании псораленов протекали без участия кислорода.
С целью повышения эффективности применения препарата при различных нозологиях Фототиазин производится не только как раствор для внутривенного введения, но и в виде геля различной
15 концентрации. Готовится к регистрации и производству препарат в форме ректального суппозитория.
В процессе экспериментально-клинических исследований Фототиазина был собран обширный материал о фоновом действии фотосенсибилизатора на новообразования. Было достоверно подтверждено, что хлорин ей, хотя и медленно, но тормозит развитие опухолей и без прямого применения лазерного излучения, а только за счет естественного дневного света. Регистрируемое замедление роста опухоли реализуется через микроциркулярное русло опухолей и сопровождается цитотоксическим и цитостатическим действием Фототиазина на раковые клетки.
В результате исследований было подтверждено, что разработанный фотосенсибилизатор сохраняет свои свойства не только при внутривенном или наружном применения, но и в форме порошка при приеме перорально. Это легло в основу разработки лекарственного средства пролонгированного действия для профилактики онкозаболеваний или применения на этапе их ремиссии, а также в качестве сочетаемого биопрепарата при традиционной терапии новообразований.
Фитоэстрагены, в свою очередь, препятствуют перерождению здоровых клеток в раковые и тормозят деление уже имеющихся в организме раковых клеток. Накопившийся в организме в процессе приема препарата фотосенсибилизатор под воздействием обычного дневного света постепенно внедряется в пораженные новообразованиями ткани и способствует их постепенному разрушению.
Развитию фототерапии способствовали ряд открытий в области физики: в 1800 г. F.W.Herschel описал инфракрасный спектр солнечного света, а в 1806 г. J.W.Ritter открыли ультрафиолетовый свет.
EJ.Widmark в 1889 г. впервые экспериментально доказал, что гиперемию кожи, ожог и загар вызывает свет ульрафиолетовой области спектра.
A.H.Downes и М.Р.Blunt впервые продемонстрировали эффект излучения в ультрафиолетовой области спектра.
W.R.Finsen в ноябре 1895г., используя открытия в области физики света, стал проводить сеансы облучения пациента с туберкулезной волчанкой, которые привели к длительной ремиссии заболевания [39,65].
В многочисленных работах второй половины 19 в. было отмечено, что прием человеком или животным лекарственного средства или растения вызывает токсический эффект только в том случае, если человек или животное подвергается световому воздействию. C.Darwin и K.Damman в 1892 г. сообщили о развитии экзантемы у животных после поедания гречихи в условиях сильного солнечного облучения. Подобные реакции были отмечены у овец и крупного рогатого скота, питающихся зверобоем [110].
J.Prime в 1900 г. сообщил о случаях возникновения отека и изъязвления на колее пальцев рук, выпадения ногтей в зоне солнечного облучения у больных, систематически принимающих раствор красителя - иозина, содержащего бром, для лечения проказы [158].
Аналогичный эффект был получен немецким студентом O.Raab, который занимался поиском новых противомалярийных средств. В результате проведенных исследований им было установлено, что низкие концентрации акрединового и других красителей, инертных в темноте, приводили к быстрой гибели парамеции при облучении солнечным светом. H.Tappeiner впервые ввел термин «фотодинамическое действие». Термин широко используется до настоящего времени. O.Raab и von Tappeiner предположили, что токсический эффект связан с активной флуоресценцией красителя, так
17 как к этому времени было известно, что красители обладают свойством абсорбировать свет и активно флуоресцировать.
A.J. von Tappeiner ошибочно предположил, что фотодинамическая реакция основана на действии ионов в пространственной близости от флуоресцирующего красителя.
В противовес этому мнению Neiser и Dreyer утверждали, что флуоресценция не вызывает гибели микроорганизмов, а повреждающее действие исключительно связано с величиной фотосенсибилизации ткани экзогенным красителем.
Leboux-Lebards в 1902 г. заметил, что гибель парамеции, от эозина наступает быстрее в открытых чашках, чем' в закрытых. Это* позволило ему предположить, что присутствие кислорода должно быть основным условием для реализации фотодинамической реакции [114]. В-этом также был убежден W.Straub, профессор фармокологии Лейпцигского университета [182]. В противоположность своим более ранним сообщениям von Tappeiner также признал необходимость-наличия кислорода в развитии эффекта ФДТ [186];
Первое сообщение фототоксичности гематопорфирина сделал-W.H.Hausmann. В 1908 г. он установил, что гематопорфирин - это активный сенсибилизатор [81]. В эксперименте на мышах в 1910 г. W.H.Hausmann [82] установил изменение интенсивности реакции- в зависимости от количества фотосенсибилизатора и- интенсивности свободного потока.
В эксперименте на себе F.Meyer-Betz [135] испытал действие гематопорфирина на человеческий организм. Фоточувствительность в виде отека и- гиперемии и гиперпигментации кожи продолжались в течение двух месяцев.
За последние годы диагностика и лечение большинства форм рака претерпела существенные изменения. Все чаще применяются способы установления- ранних форм новообразования и все чаще
18 местное лечение дополняется терапией, позволяющей разрушать раковые клетки на участках, выходящих за зоны удаления опухоли. Длительное время для этих целей применялись химиотерапия и рентгенотерапия, при которых наряду с раковыми клетками уничтожаются здоровые ткани, падает иммунитет. Для этих целей с успехом может применяться ФД и ФДТ, возможности которых изучаются в последние годы.
По сравнению с рентгенотерапией ФДТ имеет ряд преимуществ, так как не связана с осложнениями, свойственными лучевым методам лечения. Теоретически ФДТ идеальна для лечения слизистых оболочек, особенно при ранних формах заболевания [150].
Безусловно, ФДТ глубоколежащих опухолей бесполезна. Так, поверхностное облучение светом будет недостаточным для воздействия на всю толщу новообразования. В этих случаях следует применять комбинированные способы лечения, включающие хирургическое или эндоскопическое лечение и ФДТ.
В литературе имеются сообщения об избирательности накопления фотосенсибилизатора в опухолевых тканях по сравнению с нормальными [75].Потенциальной специфичности ФДТ в отношении опухоли (и меньшего повреждения нормальных тканей) можно достичь как за счёт накопления (задержки) фотосенсибилизатора, так и ограничения области облучаемой светом. Этот вариант усиления терапевтического эффекта даёт ФДТ серьёзные преимущества перед другими методами лечения. Терапевтический потенциал ФДТ можно будет использовать гораздо полнее при повышении специфичности лечения опухолевых клеток. Так, например, для снижения содержания опухолевых клеток в аутотрансплантатах костного мозга используются химические агенты или моноклональные антитела. Одной из новейших техник экстракорпоральной очистки красного костного мозга является ФДТ. Для фотодинамического контроля над
19 красным костным мозгом, полученным от больных во время ремиссии, предложено несколько фотосенсибилизаторов, включая Фотофрин, производное бензопорфирина (BPD) и мероцианин 540 (МС540) (Fisher et al., 1995). Трансплантаты костного мозга представляют собой суспензию свободно плавающих клеток, которые легко подвергнуть равномерному воздействию фотосенсибилизатора и света. Серьёзным преимуществом этой техники является возможность удалить препарат перед реинфузией клеток пациенту, чтобы избежать системной фотосенсибилизацией. Имеется сообщение, что ФДТ может снизить содержание клоногенных промиелоцитарных лейкозных клеток и клеток при хроническом миелоидном лейкозе на величину, кратную 8 log (Atzpodien et al., 1986). При этом удаётся сохранить 50% полипотентных гемопоэтических клеток предшественников.
По итогам этих исследований были начаты клинические испытания, целью которых стала оценка возможностей ФДТ при пересадке красного костного мозга. Исследования токсических влияний ФДТ при использовании МС540 для очистки костного мозга при лейкозах и лимфомах находятся на фазе I клинических испытаний. Sieber (1987) сообщил, что при ФДТ с применением МС540 in vitro удавалось на 4-5 порядков снизить количество клеток неходжкинской лимфомы в материале, полученном от пациента, при этом доза препарата позволяла сохранить около 50% нормальных гемопоэтических клеток предшественников. В дальнейших исследованиях планируется при лечении пациентов высокими дозами бусульфана и циклофосфамида «спасать» пациентов путём пересадки аутологичного костного мозга, очищенного с помощью ФДТ.
В последние годы ФДТ стала использоваться в качестве терапии ранних или поверхностных опухолей пищевода. Данный вид лечения представляет собой вероятную альтернативу эзофагэктомии [148]. В нескольких странах уже закончена III фаза клинических испытаний
20 применения ФДТ для лечения поверхностных опухолей и паллиативной терапии при злокачественной дисплазии пищевода. В Канаде, Японии, США, Нидерландах и Франции получены официальные одобрения этой методики. ФДТ также используется для лечения эзофагита Барретта, представляющий собой прогрессирующее замещение нормального плоского эпителия пищевода призматическим, что сочетается у некоторых пациентов с диафрагмальной грыжей и эзофагитом. Частота развития рака у больных эзофагитом Барретта в 30-40 раз выше, чем в остальной популляции (Cameron et al., 1985). Это заболевания развивается примерно у 10% больных (Sjogren и Johnson, 1983). При эзофагите Барретта в случае аденокарциномы и в некоторых случаях тяжёлой дисплазии рекомендовано эзофагэктомия. Однако хирургическое вмешательство связано с высоким уровнем осложнений и смертностью. В силу этого возникла необходимость в альтернативной неинвазивной терапии.
Overhold и Panjehpour (1997) сообщили о результатах ФДТ 12-ти пациентов с дисплазией пищевода[148]. У 5 из этих больных на фоне эзофагита Барретта наблюдалась аденокарцинома. Свет доставлялся через стандартный диффузор или центрующий пищеводный баллон. Все пациенты в течение длительного времени получали омепразол, чтобы снизить кислотность после ФДТ. У пациентов с эзофагитом Барретта и поверхностным раком пищевода после ФДТ наблюдалось отторжение диспластической и озлокачествлённой слизистой. После этого у всех пациентов отмечалось заживление и частичное замещение патологической слизистой нормальным плоским эпителием, а у 3-х больных описано полное замещение здоровыми клетками. У 4-х пациентов с выраженным циркулярным отторжением слизистой в проксимальной или средней частях пищевода заживление сопровождалось стриктурами, которые успешно лечились дилатацией.
21 Исследователи показали также, что баллонная техника эффективнее использования диффузора при таких обширных поверхностных поражениях, как дисплазия. Но более точное местное облучение при ФДТ строго локализованных поражений дает применение диффузора. В ходе лечения у пациентов с общей дозой света, равной 300 Дж\см2, после сеанса ФДТ развивалась умеренная боль в грудной клетке, что заставляло ограничивать протяженность отрезка пищевода, подвергавшегося ФДТ в ходе одного сеанса, 5-7 см. ФДТ эзофагита Барретта может оказаться эффективной по нескольким причинам. Так, эзофагит Барретта может занимать протяженные участки пищевода, а диспластические изменения часто мультифокальны и распределяются непредсказуемо. При возникновении дисплазии в плоской барреттовской ткани отличить ее от рака бывает чрезвычайно сложно..
1.3 Фотодинамическая диагностика.
Гематопорфириновую флуоресценцию неопластических тканей
наблюдал A.Policard в 1914 г. [156]. По его предположению красная
флуоресценция, вызываемая ультрафиолетовым светом, обусловлена
накоплением гематопорфирина вследствие вторичного
инфицирования гемолитическими бактериями. В другом эксперименте было показано, что красную флуоресценцию неопластической ткани можно усилить путем введения экзогенного гематопорфирина [13].
У 11 больных с онкологическими заболеваниями внутривенно был введен гематопорфирин за 12-72 часа до операции. Яркая красная флуоресценция визуализировалась во время операции при облучении ультрафиолетовым светом. Был сделан вывод, что красную флуоресценцию можно использовать для выявления невидимых глазом участков опухоли или уточнения границ новообразования [10].
Разработка фотосенсибилизатора с улучшенным качеством привело к созданию производного гематопорфирина НрД за счет
22 обработки гемапорфирина концентрированной серной и уксусной кислотами[18]. Препарат оказался более токсичным и в 2 раза эффективнее [15], что позволило применить его как для диагностики, так и для лечения больных с опухолями различной локализации.
RX.Lipson и EJ.Baldes в 1961 г. [121] наблюдали флуоресценцию опухоли во время эндоскопического исследования и сделали вывод, что флуоресцентная эндоскопия после введения НрД может быть ценным методом для диагностики злокачественных новообразований.
В другом случае была доказана корреляция флуоресценции с положительной биопсией плоскоклеточного рака и аденокарциномы у 75-85% больных при 23% ложноотрицательных результатах при доброкачественных очагах [19]. Таким образом, флуоресценция стала дополнять данные визуальной дифференциальной диагностики злокачественных и доброкачественных изменений.
Первоначально исследования R.L.Lipson с соавторами были направлены на флуоресцентную диагностику опухолей. Первое описание фотодинамической деструкции раковых опухолей он сделал в 1966 г. [123] и доложил в том же году результаты лечения на IX Международном противораковом Конгрессе в гор.Токио.
В другом случае фото динамическая деструкция выполнена трансплантированной под кожу крысам опухоли [23].
В опытах на мышах, которым имплантировали раковые опухоли мочевого пузыря человека, отмечается заметная деструкция новообразования после ее облучения белым светом [24]. Авторы делают вывод, что ФДТ может быть способом лечения поверхностно-стелющихся опухолей мочевого пузыря.
В своих дальнейших работах [117,118,119,120,122,124] детально изучает эффективность флуоресцентной диагностики и ФДТ не только опухолей, но и их метастазов.
Как было установлено многочисленными исследованиями,
молекулы фотосенсибилизаторов при поглощении света способны
индуцировать фотохимические реакции двух типов
[12,14,31,40,68,86,102,115,165]:
реакция первого типа связана с окислительными процессами. Под влиянием света молекулы фотосенсибилизатора переходят в возбужденное (синглетное) состояние. При обратном переходе в исходное состояние излучается кванта света - флуоресценция, которая изменяет цвет опухоли и дает возможность определить ее малигнизацию.
В других случаях молекула фотосенсибилизатора из основного-состояния переходят на тримплетный уровень. В этих случаях молекула фотосенсибилизатора может взаимодействовать с молекулами субстрата, отрывая у них электроны или атомы водорода с образованием свободных радикалов, которые могут .вызывать окисление субстрата [75].
При реакции второго типа энергоперенос происходит из тримплетного состояния фотосенсибилизатора на молекулы кислорода с образованием синглетного кислорода. Нестабильные циклические перекиси, образованные в результате взаимодействия синглетного кислорода с органическими субстратами, распадаются с образованием продуктов деструкции и свободных радикалов. Возможно, что синглетный кислород может отрывать электрон от окисляемого субстрата с образованием супероксидных радикалов [12,36,40,48,84].
Фотохимические реакции, происходящие при I и II типах, в конечном итоге приводят к деструкции опухоли. При этом роль синглетного кислорода при реакции первого типа значительная, т.к. кислород возникает во вторичных процессах.
Образовавшийся синглетный кислород имеется ограниченные возможности перемещения от места его образования [136], поэтому
24 зона повреждения опухоли при ФДТ тесно связана с локализацией фотосенсибилизатора [154].
Кроме синглетного кислорода и прямого фототоксического воздействия на опухолевые клетки при ФДТ важную роль в деструкции опухоли играет повреждение эндотелия кровеносных сосудов [54,87,141,168,180,192], стимуляция продукции фактора некроза опухоли [50, 54,58,64,103,104,145]. Образование синглетного кислорода и свободных радикалов лежит в основе фотодинамического повреждения.
На основании многочисленных исследований были выявлены факторы, повышающие и снижающие чувствительность раковых клеток к фотосенсибилизатору.
Так, красители, находящиеся в цитоплазме, могут повысить чувствительность тубулина к фотоповреждению [44,45]. Уровень накопления
фотосенсибилизатора и гибель раковой клетки снижается при удалении из опухолевых клеток питающих сосудов [70].
Снижение уровня кислорода в тканях за счет разрушения сосудистой стенки может привести к частичной регрессии опухоли [178,189,197]. Во время сеанса ФДТ опухоли во всех случаях происходит сокращение радиуса оксигенированной ткани вокруг капилляров [69]. Резкое снижение напряжения кислорода с развитием глубокой гипоксии так же возникает за счет высокой концентрации фотосенсибилизатора, высокой плотности энергии света, высокой скорости генерации синглетного кислорода [142,178,197].
Фракционирование дозы света, облучение с меньшей плотностью мощности обеспечивают хорошую реоксигенацию ткани во время сеанса ФДТ [69,74,92,178,190,197]. Во время сеанса ФДТ происходит повреждение сосудов, расстройство кровообращения в
25 опухоли, что вызывает ее разрушение или стабилизацию дальнейшего роста [51,128,168,181,183].
В настоящее время флуоресцентная диагностика, основанная на изучении экзогенного фотосенсибилизатора, используется только в сочетании с ФДТ, т.к. большинство фотосенсибилизаторов характеризуется замедленным выведением из организма, в связи с чем использовать фотосенсибилизаторы только для диагностики нецелесообразно.
Феномен флуоресценции и фосфоресценции основывается на поглощении фотонов света маркером, с последующим их испусканием при большей длине волны. В обоих случаях (флуоресценции и фосфоресценции) поглощенные фотоны возбуждают электроны маркера, которые находятся на низкоэнергетическом уровне, переводя их в высокоэнергетическое состояние. После этого электроны снова переходят на низкоэнергетический уровень, но не одномоментно, а с некоторой задержкой по времени, высвобождая при этом фотоны света, но уже большей длины волны, отличной от изначальной, при которой происходило возбуждение. При флуоресценции возбуждение и испускание следуют по времени друг за другом очень быстро, поэтому флуоресценции прекращается практически одномоментно с выключением возбуждающего света.
Флуоресцентный маркер обычное химическое соединение (фотосенсибилизатор), которое создано специально для того, чтобы избирательно накопиться в раковой ткани. После того, как начинает производиться возбуждение маркера с помощью светового излучения определенной длины волны, маркер начинает светиться, выявляя при этом зоны поражения. На этом именно и основан принцип флуоресцентной диагностики раковых заболеваний.
Аутофлуоресценцию злокачественной опухоли впервые описал французский врач A.Polykard из Лиона. В удаленной части саркомы
26 крысы он наблюдал красную флуоресценцию порфиринов при облучении опухоли ультрафиолетовой лампой Вуда [156]. Пробная флуоресценция неоднократно наблюдалась в культурах бактерий, поэтому не исключалось возникновение флуоресценции из-за вторичной инфекции. Хотя флуоресценция была правильно отнесена к присутствию порфирина в опухоли.
A.Polycard в 1924 году высказал важное мнение, что в опухолях животных могут накапливаться эндогенные порфирины, обладающие способностью флуоресцировать при облучении светом [156].
В ранних исследованиях ФДТ производилась с использованием «производного гематопорфирина» и лишь позже был получен более очищенный препарат Фотофрин II, обладающий большей активностью [55,56,57].
После 18-летнего перерыва в 1942 году Auler и Banzer из Германии описали красную флуоресценцию, возникшую после экзогенно введенных порфиринов в злокачественную опухоль. Дальнейшее исследование связано с немецкими учеными v Figge и Weitland, которые продолжили изучение туморотропных свойств порфиринов для диагностики и лечения опухолей [63]. В экспериментах на мышах в экспериментально индуцированные и трансплантированные опухоли вводили различные порфирины, в том числе и гематопорфирин. Флуоресценция появлялась во всех случаях через 24-48 часов и держалась в течение 10-14 дней. В нормальных тканях флуоресценция не отмечалась, кроме лимфатических узлов [62].
Клинические испытания провели Manganiello и Figgo в 1951 году. Трем больным со злокачественными опухолями головы и шеи ввели гематопорфирины, но флуоресценция не определялась, что было связано с небольшой дозой фотосенсибилизатора и предварительным облучением пациентов[130].
Типичную красную флуоресценцию доброкачественных и
злокачественных новообразований удалось получить Raussmussan-
Taxdall, Ward и Figgo в 1955 году. После внутривенной инфузии
гематопорфирина флуоресценция была выявлена в 7 из 8
злокачественных опухолей и у 1 из 3 доброкачественных опухолей. С
возрастанием дозы облучения возрастала интенсивность
флуоресценции. Исследования, проведенные С.С.Реск, Н.Р.Маск,
W.A.Holbrook в 1955 году показали, что яркая флуоресценция опухоли
наблюдается только при введении больших (токсических) доз
гематопорфирина[152]. Появление запредельной кожной
фототоксичности заставили врачей1 отказаться от дальнейших клинических испытаний.
Экспериментальные и клинические испытания были возобновлены только в начале 70-ых годов прошлого столетия после того, как Lipson синтезировал дериват гематопорфирина и исследовал его на животных и 15 больных [117,122] с гистологически подтвержденными злокачественными опухолями в 14 .случаях. Флуоресценция была выявлена у 10 из 15 больных.
В том же году R.H.Lipson установил, что после введения внутривенно сложной смеси гематопорфиринов происходит их избирательное накопление в опухоли с характерной красной флуоресценцией в фиолетовом диапазоне спектра [122]. R.H.Lipson 1966 году [123] применил «производное гематопорфирина» для лечения рецидива рака молочной железы.
Впервые было доказано, что флуоресцентный метод может применяться для диагностики злокачественных опухолей. В своих дальнейших исследованиях R.H.Lipson- (1967) убедительно доказал, что флуоресценция возникает только при злокачественных опухолях и отсутствует при доброкачественных.
В противоположность полученных R.H.Lipson результатам Gray et.al. [76] получили флуоресценцию у 13 из 23 больных с доброкачественными заболеваниями шейки матки. Как показали результаты гистологических исследований биоптатов, взятых из очагов флуоресценции, в большинстве из них определялась карцинома in situ или тяжелая дисплазия. Таким образом, были определены новые и более важные показания для фотодинамической диагностики - это установление участков малигнизации и предрака.
Флуоресцентная диагностика злокачественных новообразований головы и шеи была выполнена Leonard и Beck в 1971 году. Типичная красная флуоресценция наблюдалась у 29 пациентов с подтвержденными при биопсии злокачественными опухолями. В 5 случаях при флуоресценции были диагностированы скрытые очаги рака. Только в 2 случаях при биопсии из мест красного свечения элементов опухоли не получено.
Используя ртутную лампу в качестве источника возбуждения флуоресценции, Clinc в 1979 году удалось выявить за счет флуоресценции начальные стадии рака легкого. При этом фиолетовый цвет ртутной лампы чередовался с белым светом, обеспечивая флуоресценцию и нормальный эндоскопический осмотр.
Полное совпадение результатов флуоресценции и гистологического исследования удаленной опухоли мочевого пузыря, считая скрытые очаги, отметил Benson в 1983 году [46].
Новая эра в развитии ФД начинается после разработки криптонно-ионного лазера с длиной волны 405 мм. В 1979 году лазер с успехом стал применяться для возбуждения порфиринов [159].
Впервые данная система была испытана Hayata в 1982 г. с многообещающими результатами [79].
ФДТ с полным или частичным эффектом стала широко применяться при онкологических заболеваниях кожи. M.J.
29
Daugherkyclonbt и соавт. в других своих работах для ФДТ
использовали лазер на красителях с аргоновой накачкой и
подведением света по волоконному световоду во время
эндоскопических исследований. Авторы отметили отчетливые преимущества лазерной подсветки по сравнению с дуговой лампой. Преимущество лазера, по мнению авторов, состоит не в интенсивности или длине волн, а в возможности использования гибких световодов.
В дальнейшем очаги эндобронхиального рака облучались потоком красного лазерного света по кварцевым гибким световодам [25].
Флуоресцентная диагностика в сочетании с различными способами лечения продолжает развиваться во всех странах, в томг числе и в России. Для диагностики рака и предрака все шире применяется ФД. Для местного или внутривенного введения все чаще применятся 5-аминолеволиновая кислота (5-АЛК). Ценность препарата определяется высокой флуоресцентной контрастностью опухоли, что позволяет выявить участки повышенного накопления препарата, обнаружить скрытые очаги предрака и раннего рака, уточнить границы опухолевого поражения различной локализации. Чувствительность и специфичность препарата, по данным различных авторов, составляет от 62 до 92 % в зависимости от локализации процесса.
После введения Аласенса используется аппаратура для визуального определения флуоресценции, либо аппаратура для регистрации спектра. Е.В.Филоненко (2006) применяла оба метода регистрации одновременно.
В Канаде ученые впервые показали, что ауто флуоресцентная бронхоскопия при возбуждении лазерным излучением с длиной волны
442 нм повышает частоту обнаружения дисплазии и карциному in situ с 64 до 86% [91].
Известно, что в неизмененных тканях при возбуждении на волне длиной от 275 нм до 450 нм возникает собственная флуоресценция (в сине-зелено-красном диапазонах спектра). В зоне предрака и раннего рака наблюдается падение интенсивности аутофлуоресценции [11,91,112]. Падение интенсивности флуоресценции отмечается при осмотре по наличию «темных» очагов [83,111].
С целью изучения диагностических возможностей
аутофлуоресценции фирмой «Олимпас» совместно с канадскими
учеными был разработан флуорецентный бронхоскоп, что позволило
значительно повысить диагностические возможности бронхоскопии с
21,9% до 68,8% [90]. {
Kennedy [101] впервые успешно применил местное нанесение аминолеволиновой кислоты для ФДТ заболеваний кожи. В результате селективного накопления в опухолевых клетках возникает красная флуоресценция. Преимущества данного метода включают высокую контрастность и возможность введения методами аппликаций, инстилляций и т.д. Данный способ введения препарата стал широко применяться для диагностики рака различной локализации, особенно рака мочевого пузыря. Kriegmar с соавт. после инстилляций 3% раствора АЛК наблюдали строго ограниченную красную флуоресценцию. Чувствительность метода составил 96,9% вместо 72,7% при обычной цистоскопии [150]. Флуоресцентная диагностика с успехом применялась для ранней диагностики рака легкого [120].
Регистрируется флуоресценция чаще немецкой системой D-Light(AF System («Kare Story GmbH», Германия), позволяющая исследовать различные органы.
Аутофлуоресценция изучается с помощью спектроанализаторов. Для возбуждения флуоресценции в данных установках используются лазерные источники с различной длиной волны.
Флуоресцентная диагностика в настоящее время во всех случаях сочетается с лечением. Наибольший опыт в диагностике и лечении накоплен у больных с онкологическими заболеваниями кожи [43,49,57,127,132,191,193]. При кожных поражениях легко подвести световой излучатель, проследить за результатами лечения, выполнить повторные сеансы лечения. Полная регрессия базально-клеточного рака наступает по данным MJ.Daugherty [57] в 70-80% случаев, при плоско-клеточном раке - в 20% случаев. Аналогичные результаты были получены Q.Peng в 1996 году [154] при опухолях кожи различного гистологического строения. Им были получены хорошие лечебные результаты от 84 до 89 % случаев. P.S.Robinson et al [169], D.C.Pennington [155] при первично-множественных опухолях применяют повторные сеансы ФДТ.
J.C.Kennedy [101] при опухолях кожи в качестве стимулятора местного биосинтеза использовал аминолевулиновую кислоту, которая наносилась на кожу в виде аппликации.
Для лечения рака мочевого пузыря ФДТ впервые была проведена J.Kelby et M.Shell в 1976 году [100]. Препарат вводился внутривенно. Опухоль облучалась светом цистоскопа. Полная регрессия раннего рака мочевого пузыря достигается в 66,7-74% [76,77,128]. Для повышения эффективности проводимого лечения рекомендуется проводить облучение с помощью световода со сферическим наконечником [80,160], что повышает плотность энергии.
Хорошие лечебные результаты при эндоскопической ФДТ онкологических заболеваний мочевого пузыря были опубликованы Benson и другими авторами [46,100,146,161,174 и др.]. Так, Pront
32 провел ФДТ у 9 больных с опухолями мочевого пузыря. У 9 (47%) наблюдал полную регрессию.
При ФДТ рака мочевого пузыря в большинстве случаев удается получить хорошие ближайшие результаты. Даже при раке мочевого пузыря in situ рецидивы после ФДТ возникают у 56% больных в течение первых двух лет.
Для лечения центрального рака легкого эндоскопическая ФДТ была впервые применена в Японии в 1980 году. При ранних стадиях рака легкого полная регрессия опухоли, по данным различных авторов получена, в 65-90% больных [59,61,99,151].
Частота развития местных рецидивов при ФДТ раннего рака легких составляет от 8 до 13 %, при полной ремиссии опухоли от 77,3 до 93 % по данным различных авторов [96,97,100].
У больных раком легкого ФДТ применялась у 14 соматически инкурабельных больных с излечением в 1 случае [155]. В другом случае полная регрессия начального центрального рака легкого наступила у 11 из 13 больных после однократного сеанса ФДТ, в остальных двух случаях после повторных курсов лечения ФДТ применяется при онкологических заболеваниях легкого как для лечения [98], так и для реканализации просвета бронхов [37,113,126]. Полученные результаты были сопоставлены с результатами лазеротерапии. Полное восстановление просвета удалось достичь у 10% больных при лазеротерапии и у 17% больных при сочетанном применении ФДТ и ЛТ. Аналогичные результаты были получены в группе из 136 больных со стенозирующим раком пищевода. После фото динамической реканализации рака пищевода был отмечен более длительный период уменьшения дисфагии, чем при АИГ-лазерной деструкции (на 12%).
Фотодинамическая терапия с паллиативной целью находит применение у больных со стенозирующим раком пищевода [133] с
33 удовлетворительными ближайшими результатами. У 1 из 7 больных проходимость пищевода восстановилась в течение 11 месяцев. Полная регрессия опухоли в сроки до 6 месяцев составила 87% у 123 больных раком пищевода [176].
Хорошие ближайшие и отдаленные результаты были получены при ФДТ пищевода Барретта [148], при раннем раке пищевода [78].
1.4 Фотосенсибилизаторы
Фотодинамический эффект, который происходит в тканях под воздействием видимого света, еще в 1900 г. наблюдал будущий фармаколог из Мюнхена Оскар Рааб. Однако основателем фототерапии считается Нильсон, Ридберг, Финсен, ставший в 1908 г. лауреатом Нобелевской премии.
Научные исследования велись учеными разных стран на протяжении десятилетий. Сегодня в медицинской практике используются «Фотофрин» (США и Канада) и «Фотосан», «НРД» (Китай) и «Фотогем» (Россия). Создаются фотосенсибилизаторы второго поколения, отличающиеся высокой селективностью к раковым клеткам и слабой задержкой в нормальных тканях, низкой токсичностью и простотой выведения из организма, а также яркой люминесценцией для надежной диагностики опухоли.
К настоящему времени в практической медицине не применяется ряд препаратов так называемого I поколения: Фотофрин, Фотосенс, Фотогем и др. Все препараты I поколения обладают определенными недостатками, которые значительно сузили область применения ФДТ. Основными недостатками являются недостаточная избирательность в опухолевых тканях, продолжительная фотосенсибилизация нормальной кожи, что требует от пациента
34 находиться в затемненном помещении и соблюдения мер по защите кожи от солнечного света.
Дальнейшая работа ученых в области ФДТ направлена на создании препаратов II поколения, к которым предъявлялись следующие требования: фотосенсибилизатор не должен быть токсичен для нормальных клеток человеческого организма; свойства препарата должны обеспечивать высокую избирательность накопления в опухоли, по сравнению с нормальной тканью и быстрое выведение препарата из организма после сеанса терапии; препарат должен иметь неизмененный стабильный и, желательно, моносостав; необходимо, чтобы сенсибилизатор имел высокую реакционную способность и^ обеспечивал достаточный перенос энергии для образования активного (синглетного) кислорода; препарат должен иметь выраженное поглощение в красной части видимого спектра для обеспечения большей глубины проникновения'света в ткани. В последние годы такие вещества стали пытаться получать на* основе хлоринов, производимых из хлорофилла растений или путем химического синтеза.
Первым препаратом нового поколения, удовлетворяющим поставленным требованиям, стал разработанный российскими учеными препарат под названием «Фотодита-зин» - органическое соединение, полученное путем сложной1 многоэтапной переработки хлорофилла водоросли Spirulina platenzis Gom Geitleri. Осуществлены обширные клинические исследования препарата Фотодитазина в ведущих онкологических научных центрах.
Результаты, полученные при использовании Фотодитазина, показывают, что он приближается по своим свойствам к качествам «идеального» фотосенсибилизатора. Препарат нетоксичен, имеет невысокую тропность (степень накопления в пораженных тканях),
35 быстро накапливается в опухоли и выводится из организма практически полностью в течение суток.
В настоящее время проводится направленный поиск
фотосенсибилизатора среди производных хлоринов,
бактериохлорипурпуринов, бензопорфиринов, тексаферинов,
этиопурпуринов, нафталоцианинов. При этом особый интерес представляют фотосенсибилизаторы, обладающие способностью не только быстро накапливаться в опухолях, но высокой скоростью распадаться. Со временем, как это принято в химиотерапии опухолей, будет создан банк препаратов адресного спектра применения адаптированных к определенным нозологическим и гистологическим формам рака.
Впервые водорастворимые производные хлорофилла предложил
использовать для медицинских целей E.Snyder (США) в 1942г. При
внутривенном применении хлориновых смесей, в основном
содержащих хлорин рб, были отмечены низкая токсичность,
гипотензивное, антисклеротическое, спазмолитическое,
обезболивающее, противоревматоидное действие. При пероральном применении в дозах 1 г в день в течение 30 дней улучшаются показатели биохимии крови, в частности, в 1,5-2 раза снижался уровень холестерина в крови. Это послужило показанием к использованию водорастворимых хлоринов для профилактики и лечения сердечно-сосудистых заболеваний, атеросклероза, ревматоидного артрита.
Первое упоминание об использовании производных хлоринового ряда ФДТ касается производных феофорбида А, которые относятся к хлоринам.
Некоторые из них были запатентованы в качестве потенциальных фотосенсибилизаторов для ФДТ в 1984 г. в Японии.
В научной литературе об использовании производных хлоринового ряда ФДТ было заявлено в 1986г., когда группа авторов из США (J.Bommer, B.Burnhem), исходя из оценки перспективности свойств хлорина еб, сообщили о результатах своего поиска фотосесибилизатора, удовлетворяют важнейшим требованиям ФДТ, а именно хорошей туморотропностью к интенсивному поглощению в длинноволновой красной области спектра. В 1994-2001 гг. в России были проведены систематические исследования тетрапиррольных макроциклов хлоринового ряда (производных хлорофилла) с целью выявления структурно-функциональных закономерностей накопления фотосенсибилизаторов в опухоли, повышения терапевтических свойств на их основе лекарственных субстанций и форм. В этот же период была разработана технология извлечения из растительного сырья комплекса биологически активных хлоринов, которые содержат в качестве основного компонента хлорин еб. В результате были созданы фотосенсибилизаторы II поколения — Фотохлорин (Photochlorin) и Фотодитазин (Photoditazin). Препараты представляют собой 0,35 % раствор для внутривенного введения и содержат композиции из трех циклических тетрапирроловхлоринивой природы (с гидрированным кольцом D), основной из которых (80-90%) хлорины, Фотохлорин и Фотодитазин, способны разрушать биологические субстраты светом с длиной волны в диапазоне 654-670 нм, чему соответствует эффективная глубина проникновения света до 7 мм.
Дальнейшее развитие ФД и ФДТ основывается на изобретении и широком медицинском применении лазеров определенной длины волны. Облучение которыми фотосенсибилизаторов нового поколения позволили получить флуоресценцию опухоли в красном диапазоне спектра, что привело к появлению целого направления в медицине -эндоскопической флуоресцентной диагностики рака.
Производная гематопорфирина (НрД) представляет собой смесь порфиринов, имеющих слабую фотосенсибилизирующую активность (24, 25). Соединения, обуславливающие биологическую активность НрД, можно отделить от малоактивных компонентов. Препарат, содержащий до 80% активных фракций, известен как Фотофрин П. Он в настоящее время является одним из самых распространенных в мире фотосенсибилизаторов. При введении в организм любым способом он накапливается во всех тканях и органах ретикулоэндотелиальной системы, а также в опухолях, где он задерживается больше времени, чем в других тканях [20,21,26].
Полным аналогом Фотофрина II в России является фотосенсибилизатор Фотогем. При поглощении кванта света Фотогем способен переходить в возбужденное состояние и флуоресцировать в красном диапазоне света и вызывать фототоксичные реакции в опухоли.
Указанные свойства позволяют использовать его как для диагностики опухоли, так и для лечения.
С 1994 г. в нашей стране испытывается препарат второго поколения - Фотосенс. Препарат обладает высокой фотодинамической активностью и способностью глубоко проникать в ткани.
Фотодинамические методы являются отличным средством профилактики. Введенный пациенту препарат, как фонариком, высвечивает не только крупные опухоли, но и очень мелкие уплотнения, которые не в состоянии обнаружить ни УЗИ, ни руки хирурга. А ведь ранняя диагностика рака в подавляющем большинстве случаев дает хорошие шансы на излечение.
В последние годы Г.В.Пономаревым создано новое соединение Фотодитазин, которое достаточно быстро расщепляется ферментами человеческого организма и, соответственно, сокращает время ожогов кожи на солнце.
Исходным сырьем для производства препарата является
производные хлорофилла. Как было установлено,
фотосенсибилизаторы обладают интенсивной полосой поглощения, они полностью распадаются в течение двух суток.
В 1994-2001 гг. в нашей стране проведены исследования производных хлорофилла. В результате были созданы фотосенсибилизаторы второго поколения. Фотохлорил и Фотодитазин, способные проникать в ткани на глубину до 7 мм. Препараты быстро выводятся из организма, что дает возможность исключить длительную госпитализацию больного.
«Фотодитазин» является микроводоросль Spirulina platensis, содержащая хлорофилл А, который, в свою очередь, путем последовательных химических трансформаций превращается в лекарственную субстанцию. Фотодитазин действует быстро. Препарат вводят в вену, он поступает в раковые клетки, где идет активный обмен веществ, и задерживается на несколько часов. Опухоль начинает светиться. Для лечения нередко достаточно одного сеанса. Любой фотосенсибилизатор, в том числе и «Фотодитазин», можно для диагностики и лечения применять повторно. Основным недостатком фототерапии является небольшая глубина лечебного воздействия (до 1,5мм вглубь). Вот почему лечение наиболее эффективно при ранних формах заболевания, особенно при раке кожи. Ежегодно в России регистрируется около 70 тысяч рака кожи, количество неуклонно увеличивается.
Было обнаружено, что некоторые красители избирательно накапливаются и окрашивают опухолевые ткани. Опухолевые ткани, при внутривенном введении этих веществ и после их накопления в организме, флуоресцировали в красном диапазоне спектра, что привело к появлению целого направления в медицине — эндоскопической флуоресцентной диагностики рака.
Как видно из приведенного обзора литературы, фотодинамическая диагностика все шире применяется для выявления ранних форм заболевания, установления «предраковых» изменений слизистой оболочки и кожи, выявления скрытых метастазов. Объектом исследования в основном являются заболевания кожи, легких, гинекологические заболевания. Работ, диагностики малигнизированных полипов прямой и толстой кишки нам в доступной литературе не встретилось, так же как и комбинированные эндоскопические и флуоресцентные способы лечения.
Располагая значительным опытом эндоскопической диагностики и лечения полипов толстой кишки, мы провели сопоставление результатов эндоскопической диагностики и лечения с результатами флуоресцентных способов диагностики и лечения. Полученные результаты оказались обнадеживающими, что позволяет нам рекомендовать разработанный комплексный метод диагностики и лечения полипов прямой кишки для более широкого применения.
Механизмы накопления фотосенсибилизатора в опухоли
Фотодинамическая диагностика и терапия являются двухкомпонентным методом. Одним компонентом является фотосенсибилизатор, накапливающийся в опухоли при его введении в организм любым способом и задерживающийся в новообразовании дольше, чем в нормальных тканях. Другим компонентом диагностики и лечения является световое воздействие. При локальном облучении опухоли светом определенной длины волны, соответствующей пику поглощения фотосенсибилизатора в опухоли, начинаются процессы, вызывающие красное «свечение» и происходит фотохимические реакции с образованием синглетного кислорода и кислородных свободных радикалов, оказывающих токсическое действие на опухолевые клетки. Опухоль резорбируется и постепенно заменяется соединительной тканью.
В 1955г. Samuel Schwarz путем ацетилирования и восстановления получил порфириновую смесь, которую назвал производными гематопорфирина (ПГП) [175]. В экспериментах на животных, а затем испытаниях в клинических условиях Lipson [116,119,120,124] применил ПГП для флуоресцентной диагностики различных форм рака.
Механизм преимущественного накопления фотосенсибилизатора в опухоли, по-видимому, связан с некоторыми свойствами самой опухоли. Так, в большинстве опухолей отмечается повышенное количество рецепторов для липидов низкой плотности; низкой РН; наличие в опухолевой строме активных макрофагов; повышенная проницаемость сосудистой сети, повышенный синтез коллагена, с которым активно связываются порфирины [52,53,139] и высокий аффинитет липидов к липидным красителям. Все эти факторы определенно способствуют селективному накоплению фотосенсибилизатора в опухолевой ткани, хотя механизмы, обеспечивающие преимущественное распределение фотосенсибилизатора в опухоли, остаются до конца непонятными.
Исследования показывают, что многие виды опухолевых клеток экспрессируют большое количество мембранных рецепторов для липопротеина низкой плотности, при этом происходит поглощение фотосесибилизатора, связанного с липопротеинами низкой плотности путем эндоцитоза. В этих случаях фотосенсибилизаторы в основном локализуются в мембранных доменах [179], что определяет характер фотоповреждения опухоли путем их некроза и апоптоза [196].
Некоторые авторы предполагают, что некроз опухоли при фотодинимической терапии является результатом повреждения ее сосудов путем деструкции экстрацелюлярного матрикса и повреждения коллагеновых волокон [125,138].
В работах ряда авторов было показано, что опухоле-ассоциированные макрофаги захватывают большое количество фотосенсибилизатора, что обеспечивает селективное накопление в опухоли агрегированных форм красителя [41,105,106].
Флуоресцентным и радиоизотопными методами было показано, что многие фотосенсибилизаторы накапливаются преимущественно в сосудах опухоли, и пусковым моментом в развитии сосудистых изменений при ФДТ является повреждение эндотелия. При морфологических исследованиях, выполненных после динамической терапии, часто диагностируется некроз эндотелиальных клеток, тромбоз мелких сосудов, порозность сосудистой стенки [107,108,134,192], при этом венулы наиболее чувствительны к фотодинамическому воздействию. Во многих работах показано, что в эндотелии вен концентрация супероксиддисмутазы достоверно ниже, чем в эндотелии артерий. Это создает условие для генерации более высоких концентраций супероксид-аниона, что приводит к выраженному повреждению эндотелия венул [36,133,162].
В значительном числе работ показано, что одной из причин селективного накопления фотосенсибилизатора является более низкий рН межклеточной жидкости в опухоли, чем в нормальных тканях за счет избыточного производства молочной кислоты при активном гликолизе в раковых клетках. В то же время, внутриклеточный рН7 в опухоли такой же или немного выше, чем в нормальных клетках. Такие соотношения. рН в опухоли и липофильность фотосенсибилизатора положительно влияет на увеличение селективного захвата красителя опухолью [60,71,72,73,85,153,185,187,188 и др.].
Учитывая высокую актуальность проблемы ранней диагностики малигнизированных полипов толстой кишки, обусловленную высокой частотой заболевания, трудностью диагностики выявления участков малигнизации полипов толстой кишки на основании результатов общепринятых способов диагностики, частым развитием заболевания у трудоспособного населения, отсутствием .работ, специально посвященных данной проблеме, мы проанализировали результаты» комплексной -диагностики и эндоскопического лечения у 103 больных с одиночными и множественными полипами прямой кишки.
Для выявления участков малигнизации полипов прямой и ободочной кишок нами применялись: эндоскопия- с биопсией, флуоресцентная диагностика с биопсией участков «свечения», электроэксцизия полипа.
Механизмы флуоресценции и ФДТ
Солнечный свет для лечения псориаза, рахита применялся в древнем Египте, Индии, Китае. В тот период было известно, что солнечный свет может негативно влиять на активность одних лекарственных средств и быть необходимым компонентом положительного действия других. Сторонником гелиотерапии были Геродот, Гиппократ, Клавдий Гален. В трудах Гиппократа (corpus Hippocraticum, 460-375 гг. до н.э.) [89] дается наиболее детальное сообщение о физиологических эффектах воздействия солнечного света на организм человека.
Прообразом современной ФДТ можно считать попытки древних египтян применять светопоглощающие препараты при кожных заболеваниях. Из древних исторических источников известно, что в Древнем Египте еще 6000 лет назад применяли растительные препараты, вызывающие реакцию в тканях. Этими препаратами лечили депигментированные участки кожи (витилиго), которые ошибочно принимали за проявление проказы. Использовали природные фотосенсибилизаторы (псоралены), содержащиеся в таких растениях, как пастернак, петрушка, зверобой, активирующиеся солнечным светом. После аппликации порошка из этих растений на депигментированные участки кожи и последующей инсоляции ярким солнечным светом на них появлялась пигментация по типу солнечного загара.
В 1550г. до н.э. фотомедицинские процедуры уже были описаны в Эберском папирусе и священной индийской книге «Atharva Veda». Основными показаниями к фотолечению были беспигментные очаги кожи, расцениваемые как лепрозные, большинство из которых, вероятно, были витилиго (лейкодерма). В соответствии с древней индийской медицинской литературой применение черных семян растения «Бейвечи», или «Вейсучайка», сопровождалось экспозицией под прямым солнечным светом. В последующем оно было идентифицировано как Psoralena corylifolia. Это растение содержит псоралены (фурокумарины), являющиеся анаэробными фотосенсибилизаторами. Это же растение упоминается как средство лечения витилиго в буддистской литературе примерно с 200 г. н.э. и в китайских документах периода Сунь 10-го столетия. В своей знаменитой книге «Mofradat Al Adwiya»( 13-е столетие, Египет) Ибн
Эль Битар описал лечение депигментированных очагов кожи (витилиго) тинктурой из меда и порошка семян растения, называемого «Aatrillal», которое в изобилии произрастало в долине реки Нил. Aatrillal был идентифицирован как растение, называемое Ammi majus (амми большая, или китайский тмин), содержащие различные псоралены. После системного применения смеси из порошка семян амми, чаще с медом, «путем слизывания» больному рекомендовали сидеть на ярком солнечном свете в течение 1 или 2 ч, чтобы солнечные лучи падали на депигментированную кожу. Солнечный свет способствовал активации псораленов. Фотодинамическая реакция в лейкодерме приводила к везикуляции (образование пузырей), которая сопровождалась реэпителизацией и репигментацией.
Содержащиеся в растении соединения фурокумаринов обладают свойством сенсибилизировать кожу к действию света и стимулировать образование в ней пигмента меланина, что способствует восстановлению пигментации кожи. В наши дни из амми получен препарат аммифурин, содержащий смесь трех фурокумаринов (изопимпинеллина, бергаптена, ксантотоксина). Его применяют при витилиго, псориазе, красном плоском лишае, нейродермите.
В прошлом столетии в Египте были проведены интенсивные исследования псораленов: Были выделены из растений и химически проанализированы активные ингредиенты. Вскоре после этого главное, наиболее важное соединение 8-метоксипсорален было использовано для лечения псориаза. Фотосенсибилизация и фотохимические реакции при использовании псораленов протекали без участия кислорода.
Аппаратура
Среди современных методов ранней диагностики раковой трансформации полипов толстой кишки наиболее перспективными считаются флуоресцентные методы, основанные на возможности распознавания злокачественных новообразований по индуцированной световым излучением характерной флуоресценции экзогенных или эндогенных флуорхромов.
Избирательность накопления фотосенсибилизаторов в опухоли и возможность его обнаружения по спектрам экзогенной флуоресценции из освещаемой лазерным излучением области составляют основу флуоресцентной диагностики и фотодинамической терапии. Флуоресцентная диагностика участков малигнизации полипов позволяет определять их топографию, выявлять опухолевые перерождения полипов малых размеров (до 1 мм), локализующихся в поверхностных слоях, поскольку чувствительность этого метода намного выше, чем у других современных методов- ранней диагностики за счет применения панорамной флуоресцентной визуализации патологического очага и локальной спектрфлуориметрии.
Несмотря на очевидные диагностические и лечебные возможности метода, его практическое применение ограничивают сложность выполнения и высокая стоимость необходимых для ФД и ФДТ препаратов и оборудования. Поэтому данная методика применялась на завершающем этапе обследования больных с полипами толстой кишки, у которых на предварительном этапе обследования заподозрена малигнизация опухоли, но при щипковой биопсии данных за раковое перерождение не обнаружено.
На начальном этапе обследования нами применялись клинико-лабораторные методы, колоноскопия, фотодинамическая диагностика, биопсия из участков «свечения» полипа. Только у одной трети больных выполнялась ирригоскопия, на методике которой мы предпочитаем не останавливаться, так как исследование проводили рентгенологи.
Эндоскопическое обследование выполнялось видеосистемами японских фирм «Пентакс» и «Фуджинон».
Видеоколоноскопы фирмы «Пентакс» модель FC-38FW наиболее удобны для выполнения колоноскопии. Наличие усиленной вводимой трубки облегчает выполнение ротации эндоскопа и сбаривание кишки на его рабочей части. Большой диаметр биопсийного канала 3,2 мм позволяет производить с большей эффективностью лечебно-оперативные вмешательства.
Цветной видеоколоноскоп EC-3870ZK фирмы «Пентакс» имеет улучшенное изображение, небольшой диаметр оптической трубки 12,8 мм, широкий биопсийный канал 3,8 мм, увеличительную функцию. Аппарат имеет новый эргономичный дизайн рукоятки управления. Стабилизация увеличивающего изображения производиться дистальным колпачком. Эндоскоп позволяет производить полное экранное изображение с четкой видимостью и хорошей цветопередачей. Наличие ротации на 280 градусов PVE соединения облегчают исследования толстой кишки ротационным способом.
Подготовка больного к колоноскопии
Для проведения колоноскопии проводилась общая и местная подготовка, применяемая в нашей клинике
Общая подготовка включала комплекс лечебно-профилактических мероприятий, направленных на коррекцию выявленных при клиническом обследовании нарушений и стабилизацию общего состояния больного.
Местная подготовка была направлена на удаление содержимого толстой кишки. При этом применялись различные способы, позволяющие удалить из просвета кишки жидкое и твердое содержимое, а так же отмыть слизистую оболочку от имеющихся наложений. Чаще других подготовка толстой кишки проводилась при помощи лаважа. Для этих целей применялся «фортране» французского производства и отечественный препарат «Лавакол».
Упаковка «Фортране» состоит из четырех . пакетов, содержащих 64 грамма полиэтиленгликоля и 9 г. электролитов. В зависимости от массы тела и функционального состояния толстой кишки применялось от 2 до 4 пакетов, чаще 3. Каждый пакет растворялся в 1 литре воды и выпивается в течение 1-1,5 часов накануне исследования. У пожилых больных и при наличии упорных запоров введение раствора замедлялось. Весь объем «Фортранса» 3-4 литра раствора принимался с 17 часов до 20-21 часа.
При наличии упорных запоров у больного проводился комбинированный способ подготовки, включающий пероральный прием препарата «Дюфалак» 2-3 дня до исследования и «Фортране» накануне проведения колоноскопии. Объем раствора «Дюфалак» подбирался индивидуально и обычно составляет от 1,5 до 4 литров. Как было установлено, сочетанная подготовка кишечника расширяла границы применения колоноскопии за счет ее выполнения у больных, кишечник которых невозможно подготовить общепринятыми способами.
Несмотря на относительную безопасность «Фортранса» и «Дюфалака» их применение связано с быстрым введением в организм больного большого количества жидкости, что может привести к нарушению сердечно-сосудистой деятельности. В двух случаях после приема 4 литров раствора «Фортране» наступала кратковременная потеря сознания. Поэтому у пожилых и старых больных, особенно при наличии изменений со стороны сердечно-сосудистой системы мы применяли стандартный способ подготовки толстой кишки к колоноскопии.
В течение трех суток прием бесшлаковых продуктов. В 15-16 часов прием 40-60 мл Касторового масла, через 4-6 часов от момента-приема слабительного 2 очистительные клизмы объемом 1-1,5 литра каждая. В 6-7 часов в день исследования 2 очистительные клизмы с. промежутками в 1 час. Выполнение осмотра через 2 часа после последней клизмы.
При любом способе подготовки полное отсутствие кишечного содержимого отмечалось не чаще 60-65% случаев. В процессе осмотра жидкое содержимое приходилось удалять через канал эндоскопа, а слизистую отмывать струей воды. Поэтому ширококанальные эндоскопы имеют определенные преимущества по сравненению с эндоскопами, имеющими стандартный инструментальный канал.
Большая часть больных (89%) поступали в больницу им.С.П.Боткина из проктологических отделений после выявления у них полипов прямой кишки во время ректороманоскопии. Для установления изменений толстой кишки и уточнения диагноза больным выполнялась колоноскопия.
Процесс введения и выведения колоноскопа осуществлялся под контролем зрения по просвету толстой кишки. Диаметр кишки восстанавливался за счет инсуфляции воздуха, избыток которого удалялся отсосом. При возникновении болей, которые нередко возникают при натяжении брыжейки, дальнейшее продвижение эндоскопа осуществлялось только после спрямления углов и сбаривания кишки на оптической трубке эндоскопа. Кишечная стенка, обладая определенным запасом эластичности, при оказании на нее давления растягивается, что в сочетании с гибкостью эндоскопа создает условия для формирования петель и их растяжения, т.к. аппарат преодолевает изгибы кишки по дуге большего радиуса. Для профилактики натяжения брыжейки мы применяли ротационный способ введения колоноскопа, при котором наряду с поступательным движением аппарату придавали вращательные движения [27]. В этих случаях дистальный конец эндоскопа преодолевал изгибы толстой кишки по дуге меньшего радиуса, не растягивая кишку.
При удлиненных петлистых подвижных отделах толстой кишки мы использовали методику «сегментарного присбаривания» и ручное пособие через переднюю брюшную стенку.
Используя методику продвижения колоноскопа под контролем зрения и различные дополнительные приемы, нам удалось во всех 103 случаях провести тотальный осмотр толстой кишки, выявить наличие полипов и выполнить щипковую биопсию.
![Особенности заболеваемости злокачественными новообразованиями ободочной и прямой кишки с учетом внешних факторов и риска полинеоплазий [Электронный ресурс]](/i/i/4344/191458.png "Особенности заболеваемости злокачественными новообразованиями ободочной и прямой кишки с учетом внешних факторов и риска полинеоплазий [Электронный ресурс] Мамонтов Константин Григорьевич")
