Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1. Развитие, строение и функции селезенки 12
1.2. Спленэктомия и ее осложнения
1.3. Консервативные методы профилактики и лечения постспленэктомичского синдрома 22
1.4. Хирургические методы профилактики и коррекции постспленэктомического синдрома 23
1.5. Культивирование клеток селезенки 30
1.6. Методы снижения иммуногенности клеточных трансплантатов 33
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 34
П. 1. Характеристика донорского материала 34
11.2. Получение культур клеток селезенки 35
11.3. Материалы и методы инкапсулирования культур клеток селезенки 36
П.3.1. Инкапсулирование модельных клеточных систем 37
И.3.2. Инкапсулирование культур клеток селезенки 38
П.4. Материалы и методы моделирования постспленэктомического синдрома и трансплантации культур клеток селезенки з Н.
4.1. Оперативные вмешательства на мелких лабораторных животных 39
П.4.2. Оперативные вмешательства на крупных лабораторных животных 41
П.5. Материалы и методы морфологической оценки культур клеток селезенки 42
П.6. Методы оценки постспленэктомического синдрома и функции трансплантатов культур клеток селезенки в организме реципиента 43
П.7. Статистическая обработка данных 45
ГЛАВА III. Результаты исследования 46
III. 1. Оценка морфологических показателей культур клеток селезенки до трансплантации 46
III. 1.1. Фетальные и неонатальные культуры клеток 46
III. 1.2. Культуры клеток, полученные от взрослых доноров 50
Ш.2. Инкапсулирование клеточных модельных систем и культуры клеток селезенки 53
Ш.З. Морфологическая оценка состоятельности трансплантатов культур клеток селезенки 57
Ш.3.1. Морфологическая оценка состоятельности трансплантатов фетальных и неонатальных культур клеток селезенки 57
Ш.З.2. Морфологическая оценка состоятельности трансплантатов культур клеток селезенки, полученных от взрослых доноров 61
Ш.4. Функциональная оценка модели постспленэктомического синдрома 64
Ш.4. 1. Данные объективного обследования 64
Ш.4. 2. Характеристика системы гемопоэза 65
Ш.4. 3. Характеристика системы гемостаза 67
4. 4. Характеристика иммунной системы 68
Ш.5. Оценка функциональных показателей у реципиентов после
трансплантации культур клеток селезенки 70
Ш. 5. 1. Данные объективного обследования 70
Ш. 5. 2. Характеристика системы гемопоэза 70
Ш. 5. 3. Характеристика системы гемостаза 72
Ш. 5. 4. Характеристика иммунной системы 74
ГЛАВА IV. Обсуждение результатов 77
Заключение 86
Выводы 89
Практические рекомендации 90
Список литературы
- Хирургические методы профилактики и коррекции постспленэктомического синдрома
- Материалы и методы инкапсулирования культур клеток селезенки
- Методы оценки постспленэктомического синдрома и функции трансплантатов культур клеток селезенки в организме реципиента
- Морфологическая оценка состоятельности трансплантатов культур клеток селезенки, полученных от взрослых доноров
Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение возможностей коррекции
нарушений иммунного ответа и системы гемостаза после спленэктомии
(СЭ) остается актуальным и в настоящее время. Спленэктомия
распространенное оперативное вмешательство, показаниями к которому
служат травмы, инфаркты, кисты, опухоли, абсцессы селезенки, ряд
гематологических заболеваний (гемолитические и гипопластические
анемии, тромбоцитопении, болезнь Ходжкина и другие) [Климанский
ВА, 1991; Buntain W.L., Lynn Н.В., 1979; Fotiadis С, et al, 1992; Sharma
О.P., et al., 2002]. Кроме того, СЭ часто является этапом хирургического
вмешательства при операциях на органах брюшной полости (при
онкологическом их поражении, при ятрогенных разрывах, составляющих
от 14 до 40% от общего количества травм селезенки) [Cassar К., Munro А.,
2002; Sabau P.J., et al., 1999]. Ряд состояний (пожилой возраст, голодание,
авитаминозы) может привести к функциональной асплении, которая, как и
спленэктомия, подвергает пациента риску тяжелых инфекционных
заболеваний [Бутенко Г.М, 1990]. Под термином
«постспленэктомический синдром» (ПСС) мы понимаем снижение общего тонуса и работоспособности, повышенную восприимчивость к инфекциям за счет снижения иммунорезистентности, повышение количества тромбоцитов в периферической крови, вследствие чего у больных наблюдается склонность к тромбоэмболическим осложнениям.
В настоящее время для коррекции постспленэктомического синдрома
применяются консервативные (иммунокорригирующая, антиагрегантная и
антикоагулянтная терапия, лечение возникших осложнений) и
хирургические методы. Среди последних следует отметить метод аутотрансплантации ткани селезенки, дающий в большинстве случаев хорошие функциональные результаты [Гринев К.М., 1990; Benjamin J.Т., et al, 1978; Livingston CD., et al, 1982; Patel J., et al, 1982]. Однако, в силу ряда причин, эта операция не всегда выполнима (онкологическое, септическое поражение органа, отсутствие технических возможностей) [Григорьев Е.Г. и соавт., 1996; Шабунин А.В. и соавт., 2000; Яжик СИ., Краля И.В., 2000]. Органная трансплантация селезенки - трудоемкая операция, требующая проведения иммуносупрессивной терапии в послеоперационном периоде, не получила широкого распространения [Аскерханов Р.П., Сафаров СЮ., 1987].
Таким образом, поиск новых путей компенсации ПСС продолжает оставаться актуальной проблемой современной хирургии.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящего исследования является экспериментальное обоснование метода ксенотрансплантации
і f>OC. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА
-4-(КсТ) культур клеток селезенки для коррекции постспленэктомического синдрома (доказательство переживания и функционирования клеточного трансплантата в организме реципиента). Задачи исследования:
Доказать морфологическую состоятельность клеток селезенки в культуре.
Определить оптимальный срок культивирования клеток селезенки.
Доказать морфологическую и функциональную состоятельность трансплантированной культуры клеток селезенки в организме реципиента.
Определить срок переживания клеточного трансплантата в организме реципиента.
Исследовать влияние трансплантации культур клеток селезенки на течение постспленэктомического синдрома.
Разработать новый метод инкапсулирования культур клеток селезенки для иммунопротекции клеточного трансплантата в организме реципиента.
Изучить закономерности неоорганогенеза селезенки после КсТ культур клеток.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые предлагается новый хирургический
метод коррекции постспленэктомического синдрома
ксенотрансплантацией клеточных культур.
Впервые проводится комплексная оценка морфологической и функциональной состоятельности клеток селезенки в культуре и после ее трансплантации на сроках до 6 месяцев.
Определен оптимальный срок культивирования клеток селезенки.
Проведена сравнительная характеристика культур клеток селезенки, полученных от разных типов доноров.
Впервые для мониторинга за функционированием трансплантата культур клеток селезенки в организме реципиента обосновано использование определения активности комплемента по альтернативному пути.
Впервые для иммунопротекции клеточных культур был применен метод инкапсулирования при поочередном нанесении противоположно заряженных полиэлектролитов.
Хирургические методы профилактики и коррекции постспленэктомического синдрома
Хотя культивированием тканей ученые занимаются уже свыше ста лет, остается очень много неразрешенных вопросов (в том числе и проблема трансплантации культивированных клеток). Метод клеточных культур представляет собой целый комплекс процессов, имеющих целью разобщение клеток, их подготовку к культивированию, а также само культивирование в питательных средах. Разобщение клеток достигается механическим измельчением ткани (ножницами), обработкой протеолитическими ферментами и центрифугированием клеточной суспензии с протеолитическими ферментами с последующим отмыванием клеток [Chabaud О., et al., 1988].
Существует два основных способа культивирования клеток: во флотирующей культуре и в монослое [Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н., 1984; Поташов Л.В., Галибин О.В., 1998; Chabaud О., et al., 1988]. Флотирующая клеточная культура представляет собой взвесь тканевых микрофрагментов в питательной среде [Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н., 1984]. Монослойная культура может расти на стекле, на геле, на милипоре [Chabaud О., et al., 1988]. Чаще всего в исследованиях используется культивирование клеток в монослое. Культивирование в монослое заключается в том, что очищенные клетки прикрепляются к какой-либо поверхности (стекло, гель, миллипор) и растут одним тонким слоем. Таким образом, достигается одинаковая ориентация клеток в пространстве (чего нет ни в ткани, ни во флотирующей культуре).
При этом элиминируются "лейкоциты-пассажиры", которые играют большую роль в развитии отторжения [Блюмкин В.Н., 1984; Галибин О.В., 2003]. Существует мнение, что культивирование улучшает выживаемость не за счет уменьшения числа антигенпредставляющих клеток, а за счет снижения экспрессии антигенов первого класса главного комплекса гистосовместимости [Markmann J.F., et al., 1990].
С точки зрения возможности для роста in vitro существенным преимуществом обладают клетки плодных тканей. Плодная ткань по сравнению со взрослой является менее дифференцированной и обладает большим внутренним потенциалом роста, что дает фетальным клеткам возможность расти и делиться автономно [Perloff L.J., et al., 1980]. Выяснено, что способность к автономному росту у взрослых клеток резко снижается, и лишь 1% из них эту способность сохраняет. Фетальные органы содержат в основном бластные и стволовые клетки, наделенные мощным потенциалом пролиферации. Каждая пересаженная фетальная клетка способна дать самообновляющийся долгоживущий росток функциональной ткани в организме реципиента [Сухих Г.Т., 1998].
Значительное преимущество трансплантации культур фетальных и неонатальных клеток - возможность отказаться от иммуносупрессивной терапии, обусловленная меньшей иммуногенностыо фетальных клеток и снижением ее в процессе культивирования. Большинство фетальных клеток имеют слабо экспрессированные комплексы главных антигенов гистосовместимости, что на порядок уменьшает уровень посттрансплантационных осложнений [Сухих Г.Т., 1998].
В литературе обсуждаются способы выделения и культивирования лимфоцитов селезенки для иммунологических, вирусологических и фармакологических исследований [Барсуков А.Н. и соавт., 1990; Малайцев В.В., Богданова И.М., 1977; Раевская М.В., 1995; Lanza R. P., et al., 1997] и стромальных клеток селезенки [Прокопьев М.В., 2001; Советова Г.П. и соавт., 1976; Chailakhyan R.K., et al., 2000]. Стромальному микроокружению клеток в селезенке придается большое значение, поскольку оно оказывает регуляторное влияние на пролиферацию и дифференцировку гемопоэтических клеток [Гринев К.М., 1990; Прокопьев М.В., 2001; Советова Г.П. и соавт., 1976; Шарецкий А.Н. и соавт., 1979; Швец В.Н., 1976; Briard D., et al., 2002; Crowley M.T., et al., 1999; Mcllroy D., et al., 2001; Dieu M. В., et al.,1998; Oppenheim J.J., 1993; Steiniger В., Barth P., Hellinger A., 2001].
Для получения культур клеток селезенки применяется метод механической дезагрегации [Барсуков А.Н. и соавт., 1990; Фриденштейн А.Я. и соавт., 1999], заключающийся в протирании предварительно измельченной ножницами селезенки через нейлоновую сетку [Раевская М.В., 1995] или пропусканием тканевых фрагментов через шприц с уменьшающимся диаметром иглы, гомогенизации и ресуспендировании ткани селезенки в питательной среде [Chailakhyan R.K., et al., 2000]. Для выделения клеток селезенки также существует метод трипсинизации ткани [Советова Г.П. и соавт., 1976; Chailakhyan R.K., et al., 2000].
Для снижения иммуногенности клеточных трансплантатов в настоящее время применяется культивирование клеток при низкой температуре, облучение УФ-лучами, криоконсервация и иммуноизоляция [Federlin K.F., et al., 2001]. В последнее время ведется разработка различных иммуноизолирующих систем, при использовании которых вещества с низким молекулярным/ весом (электролиты, кислород, биоактивные секреторные вещества) проникают через мембрану, и в то же время исключается контакт трансплантата с иммуноцитами и антителами [Lanza R. P., et al., 1997]. В течение последнего десятилетия были исследованы некоторые методы микроинкапсулирования островков Лангерганса. Однако существует множество проблем, ограничивающих применение большинства микрокапсул, и только альгинат-поли -лизиновые системы могли функционировать в организме крупных лабораторных животных в течение длительного времени [Lanza R. P. et al., 1997]. В настоящее время существуют аппаратные [Vilesov A.D. et al., 2002] и физикохимические методы ponath Е., et al, 1999; Neu В., et al., 2001; Sukhorukov G.B., 2002] инкапсулирования клеточных объектов.
Материалы и методы инкапсулирования культур клеток селезенки
Целью нашего исследования было экспериментальное обоснование метода ксенотрансплантации культур клеток селезенки для коррекции постспленэктомического синдрома, являющегося комплексом функиональных изменений кроветворной, гемостатической и иммунной систем. На первом этапе работ было необходимо доказать морфологическую состоятельность культуры клеток селезенки и изучить общие закономерности, происходящие в культуре. Были исследованы культуры клеток, полученные от разных типов доноров: взрослых, фетальных и неонатальных. Показана принципиальная возможность культивирования клеток, полученных от взрослых доноров, однако срок переживания таких клеток в культуре снижен по сравнению с фетальными и неонатальными клетками. Это может быть объяснено высокой пролиферативной активностью менее дифференцированных стромальных клеток фетальных и неонатальных тканей, что дает им возможность расти и делиться автономно, в то время как во взрослом организме способность клеток к автономному росту резко снижается [Perloff L.J. et al., 1980].
Так как селезенка обладает высоким кровонаполнением, полного вымывания эритроцитов во время предварительной подготовки ткани к культивированию не происходит. Эритроциты продолжают вымываться в питательную среду в течение первых суток культивирования, что делает необходимым более частую и полную смену культуральной среды. Если при культивировании клеток эндокринных органов (пожделудочная железа, надпочечники, щитовидная и паращитовидные железы) достаточно проводить смену среды раз в три дня [Блюмкин В.Н., 1984], то культивирование клеток селезенки делает необходимым проведение данной процедуры через день. Кроме того, во время культивирования элиминируются "лейкоциты-пассажиры", которые играют большую роль в развитии отторжения [Блюмкин B.H., 1984; Галибин О.В., 2003]. Таким образом, из культуры Летальных и неонатальных клеток селезенки к 7 суткам вымываются высокодифференцированные клеточные элементы - эритроциты и клетки лимфоидного ряда, стромальные клетки сохраняют жизнеспособность до 14 суток. Клеткам стромального микроокружения селезенки придается большое значение, поскольку продуцируя ряд цитокинов и интерлейкннов (в том числе TLC и BLC), они оказывают регуляторное влияние на пролиферацию и днфференцнровку гемопоэтических клеток и иммуннокомпетентных клеток, таких как натуральные киллеры, Т- и В-лимфоциты [Гринев К.М., 1990; Прокопьев М.В., 2001; Советова Г.П. и соавт., 1976; Шарецкий А.Н. и соавт., 1979; Швец В.Н., 1976; Board D., et al., 2002; Crowley M.T., et al., 1999; Dieu M. В., et al., 1998; Mcllroy D., et al., 2001; Oppenheim J.J., 1993; Steiniger В., Barth P., Hellinger A., 2001]. Кроме того, стромальное кроветворное микроокружение при трансплантации стимулирует неоанпюгенез и миграцию форменных элементов крови во вновь образованный орган [Гринев К.М, 1990; Leitner W., et al., 1994]. Таким образом, оптимальный срок культивирования фетальных и неонатальных клеток (8-10 суток) обусловлен высоким процентным содержанием стромальных клеток и почти полной элиминацией клеток лимфоидного ряда. При культивировании клеток, полученных от взрослых доноров, данный показатель, также обусловленный оптимальным соотношением лимфоидных и стромальных элементов, составил 6-8 суток.
В качестве органа-депо для трансплантации нами был выбран большой сальник. Исследования показали, что интраперитонеальная аутотрансплантация ткани селезенки, при сравнении с ретроперитонеалыюй и подкожной трансплантацией, приводит к лучшим морфологическим и функциональным результатам [Iinuma Н., et al., 1992; Pabst R., et al., 1991; Patel J.M., et al., 1986; Sasaki K., et al., 1991]. Большой сальник, являясь хорошо васкуляризованным образованием, обеспечивает диффузию питательных веществ к трансплантату до прорастания в него кровеносных сосудов и способствует образованию капиллярной сети спленоидов.
Для объяснения процессов неоорганогенеза после трансплантации культур клеток необходимо рассмотреть процессы органогенеза селезенки. В начальной стадии закладка органа представлена компактным скоплением фибробластов, число которых быстро увеличивается за счет митотического деления [Жарикова Н.А. , 1979], затем возрастает количество кровеносных капилляров, они приобретают характер артериол. В это время строма органа образует разветвленную сеть, утолщаясь по периферии она формирует капсулу. На последнем этапе происходит заселение стромы лимфоцитами, мигрирующими из кровеносного русла [Жарикова Н.А., 1979; Хлистова З.С. и соавт., 1982]. К концу эмбрионального периода сформированы соединительнотканный остов и сосудистое русло селезенки, стромальные фибробласты и многочисленные макрофаги образуют микроокружение для лимфоцитов [Волкова О.В., Пекарский М.И,, 1976]. Та же последовательность событий наблюдается и при трансплантации фетальных клеток. Ксенотрансплантированные стромальные клетки делятся путем митоза и, выделяя различные биологически активные молекулы, стимулируют прорастание капилляров из органа-депо (сальник). Затем часть капилляров трансформируются в более крупные сосуды (артериолы), строма формирует разветвленную сеть и соединительно-тканную капсулу. Далее, продуцируя TCL, BCL и другие вещества, стромальные клетки привлекают из кровеносного русла кроветворные и лимфоидные клетки реципиента и способствуют их дальнейшей пролиферации и дифференцировке. Через месяц после операции образуется спленоид, состоящий из стромальной сетки, заполненной фолликулоподобными скоплений лимфоцитов. Формирования красной пульпы во вновь образованном органе отмечено не было. Таким образом, после трансплантации клеток последовательность и общий алгоритм процессов соответствует таковому при органогенезе.
При трансплантации культур клеток, полученных от взрослых доноров, все процессы неоорганогенеза ускоряются, что обусловлено высокой иммуногенностью материала. Можно ожидать, что и функционировать трансплантаты данного типа будут лишь в течение короткого времени, однако возможно более раннее их влияние на гематопоэтическую, гемостатическую и иммунную систему.
Была проведена функциональная оценка моделированного ПСС до и после трансплантации культур стромальных клеток селезенки. Животные с экспериментальным ПСС наблюдались в течение 10 месяцев, после трансплантации культуры клеток — в течение 6 месяцев. Показано, что после КсТ спленэктомированным животным функциональные показатели гемопоэтической, гемостатической и иммунной систем приближаются к исходным (до спленэктомии). Результаты сравнивались с контрольными, полученными через 10 месяцев после СЭ, когда показатели исследуемых систем приобретают стабильно отличные от исходных значения. Так, на диаграмме №4 можно видеть динамику содержания моноцитов в периферической крови у спленэктомированных животных. Привлекает внимание снижение количества моноцитов через 3-4 месяца после операции, в то время как через 10 месяцев вновь отмечается резко повышенное количество моноцитов в периферической крови.
Методы оценки постспленэктомического синдрома и функции трансплантатов культур клеток селезенки в организме реципиента
Для оценки жизнеспособности культур клеток выполнялись морфологические исследования на сроках 3,5,7,9,11,13 суток культивирования. Во время смены питательной среды пипеткой забиралось небольшое количество культуры, образец промывался физиологическим раствором и фиксировался в растворе Буэна (срок фиксации до 7 суток) или в 10% растворе формалина (срок фиксации до 30 суток). Формировался банк микропрепаратов для ретроспективного морфологического анализа.
Приготовление микропрепаратов осуществлялось в отделе патоморфологии Научно-Исследовательского Центра СПбГМУ им.ак. И.П.Павлова (зав. - д.м.н., проф. В.В.Томсон). После фиксации препараты проводились через спирты, ксилолы, парафшшзировались. Микропрепараты готовились по обычной методике с окраской гематоксилин-эозином. Оценку препаратов проводили на световом микроскопе и «оптико-электронной системе для исследования малоконтрастных биологических объектов» (свидетельство на полезную модель РФ, регистрационный номер 17087 от 10.03.2001) , разработанной в отделе экспериментальной медицины Научно-Исследовательского Центра СПбГМУ им. ак. И.П.Павлова. Оптико-электронная система состоит из микроскопа «Люмам-01» с оптическим адаптером, цветной телевизионной ПЗС-камеры, видеомонитора и IBM - совместимого компьютера. Использовались следующие программы регистрации и корректировки изображения: Vidcap AVI Capture Application, ACDSee v. 3.1, Photo Express.
Перед операцией каждая культур оценивалась микроскопически с использованием экспресс-метода получения гистологических препаратов клеточных культур [Черникова М.В. и соавт., 2001] II.5.2. Морфологическая оценка трансплантатов культур клеток селезенки
Забор эксцизионных препаратов осуществлялся на сроках 15, 30,45, 60,75,90 и 180 суток после операции. Макроскопически оценивали размер, цвет, консистенцию, наличие или отсутствие признаков воспалительной реакции, визуальное наличие кровеносных сосудов в трансплантате. Приготовление микропрепаратов осуществлялось в отделе патоморфологии Научно-Исследовательского Центра СПбГМУ им.ак. И.П.Павлова. Гистологический материал фиксировался в 10% нейтральном формалине, проводился через спирты, ксилолы, парафинизировался. Срезы толщиной 5 мкм окрашивались гематоксилином-эозином или но Ван-Гизону. Оценку переживаем ости ксенотрансплантата в организме реципиента проводили при микроскопическом исследовании препаратов на световом микроскопе и «оптико-электронной системе для исследования малоконтрастных биологических объектов».
Все морфологические исследования проводились совместно со старшим лаборантом кафедры общей хирургии к.б.н. Черниковой М.В. и младшим научным сотрудником отдела экспериментальной медицины НИЦ Будиловой Л.В.
И.6. Методы оценки постспленэктомического синдрома и функции трансплантатов культур клеток селезенки в организме реципиента
Оценка функциональных результатов ксенотрансплантации проводилась на крупных лабораторных животных (собаках). Все исследуемые параметры определялись в дооперационном периоде, затем каждый месяц после операции на протяжении 9 месяцев. Определялись следующие параметры:
1. Общее состояние животных (внешний вид, поведение, аппетит, наличие послеоперационных осложнений)
2. Общеклинические показатели (клинический анализ крови, коагулограмма). Исследования проводились в Центральной Клинико-диагностической Лаборатории СПбГМУ (зав. - д.м.н., проф. В.Л.Эммануэль) с использованием оборудования указанного подразделения.
3. Иммунологические показатели (поглотительная активность нейтрофилов, реакция торможения миграции лейкоцитов, активность комплемента по альтернативному пути). Два первых параметра исследовались по стандартным методикам в иммунологической лаборатории СПбГМУ им.ак. И.П.Павлова (зав. - д.м.н., проф. А.А.Тотолян).
Уровень активности комплемента сыворотки крови определялся с использованием фотометрической методики, разработанной на кафедре биохимии СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова (зав. каф. - д.м.н., проф. Л.В.Галебская), позволяющей раздельно определить активность классического (КПК) и альтернативного (АПК) путей активации комплемента [Галебская Л.В., Рюмина Е.В., 1999]. Исследования проводились на приборе ФЭК-56 М. В основе используемой методики лежит реакция комплементзависимого лизиса. В качестве объекта лизиса использовали взвесь эритроцитов кролика, содержащую около 18 млн. эр/ мл.
Уровень активности комплемента оценивался по следующим параметрам: lag t- индукционный период (отражает время, необходимое для протекания каскада реакций активации комплемента и сборки мембраноатакующего комплекса на поверхности эритроцитов); V- скорость комплементзависимого лизиса эритроцитов кролика; ГЕК - гемолитическая ёмкость комплемента - отражает количество функционально активного комплемента. Используя ЭГТА (этиленгликольтетраацетат), мы отдельно определяли активность альтернативного пути активации комплемента (АПК). В основе данного исследования лежит способность ЭГТА как комплексного соединения связывать ионы Са, а значит, препятствовать сборке функционально активной С-1 конвертазы классического пути. Согласно ряду исследований [Галибин О.В. и соавт., 1999; Доильницына О.В., Беляева И.Г., 1997] именно активность альтернативного пути позволяет прогнозировать эффект трансплантации клеточных культур.
Н.7. Статистическая обработка данных При статистической обработке полученных данных предполагалось, что измеряемые величины распределены по нормальному закону, являются случайными и независимыми. Математическая обработка результатов исследований проводилась по методикам Л.А.Алексеевой и соавт. (1997). С использованием статистических программ находились среднее арифметическое (М), среднее квадратичное отклонение, исходя из которого рассчитывались средняя ошибка (т) и средняя ошибка разности средних величин. Соотношение разности сравниваемых средних к ошибке разности сопоставлялось со значениями t в таблице вероятности р по распределению Стьюдента.
Морфологическая оценка состоятельности трансплантатов культур клеток селезенки, полученных от взрослых доноров
Для приготовления культуры клеток селезенки использовалась модифицированная нами методика выращивания клеточных культур эндокринных органов [Беляева И.Г. и соавт., 1999]. В стерильном боксе, предназначенном для хирургических работ, осуществлялся забор органа, который помещался в стерильную чашку Петри с раствором Хенкса в деситикратном разведении и антибиотиками (пенициллин и гентамицин). На 500 мл раствора Хенкса добавляли 1 млн. ЕД бензилпенициллина натрия и 80 мг гентамицина. Удаляли капсулу органа, прослойки соединительной ткани с кровеносными сосудами. Селезенка промывалась теплым раствором Хенкса и измельчалась ножницами до диаметра фрагментов 0,5 мм и меньше.
Тканевая масса помещалась в стерильные матрацы объемом 100 мл с питательной средой следующего состава: бычья сыворотка - 10%, гидролизат лактальбумнна - 30%, среда 199 - 60%, пенициллин 1 млн. на 500 мл питательной среды. Кроме того, на каждые 500 мл бычьей сыворотки добавлялось по 80 мг гентамицина.
Взвесь клеток одного органа культивировалась в 50 мл питательной среды. Культивирование проводилось в термостате "ГПИ-01 газопроточный" при температуре 37 С со сменой питательной среды на следующий день после начала культивирования, а затем через каждые сутки. Во время пересева осуществлялся забор материала для морфологического исследования. В течение культивирования проводился бактериологический и вирусологический контроль за стерильностью. Срок культивирования составлял 6-14 дней.
П.З. Материалы и методы инкапсулирования культур клеток селезенки Отработка методики послойного нанесения полиэлектролитов [Sukhorukov G.B., 2002] для инкапсулирования живых клеточных систем производилась в Институте Коллоидов и Границ Раздела Макса Планка (Потсдам, Германия) (Max-Plank-Institut fur Kolloid-und-Grenzflachenforschung) с использованием аппаратуры отдела Полых Капсул (руководитель группы - доктор Г.Б.Сухоруков). Метод основан на образовании связей между положительно и отрицательно заряженными полиэлектролитами на поверхности инкапсулируемого объекта [Donath Е., et al, 1999; Neu В., et al., 2001; Sukhorukov G.B., 2002].
Для подбора биологически совместимых полиэлектролитных пар, способных формировать устойчивые комплексы как in vitro, так и in vivo, были исследованы возможные комбинации следующих полиэлектролитов: альгинат натрия (Алг)(Сигма), декстран сульфат (Сигма), желатин тип А (Сигма), поли-Л-лизин (ПЛЛ)(Сигма) и хитозан с низким молекулярным весом (Хит)(3000 кДа).
Для отработки методики инкапсулирования клеток были использованы эритроциты, фиксированные 2% глютаральдегидом, и нативные эритроциты. Изоляция эритроцитов производилась трехкратным центрифугированием (3000 об/мин) крови в фосфатном буфере (рН=7,4). Для получения капсул клетки инкубировалась с раствором полианиона (альгинат натрия или декстран сульфат) в 0,154 М хлориде натрия. Полученная клеточная взвесь подвергалась интенсивному перемешиванию в течение 30 минут, после чего трижды центрифугировалась с удалением супернатанта, содержащего избыток несвязанного полиэлектролита. В последующем процедура повторялась с чередованием инкубации клеток в растворах поликатионов и полианионов для получения достаточного количества слоев.
Исследование полученных инкапсулированных объектов проводилось при световой (Eschenbach, SHB45, Germany) и конфокальной микроскопии (лазерная сканирующая конфокальная система Leica TCS NT, Leica, Germany). Визуализация капсулы была достигнута нанесением слоя поликатиона, меченного флюоресциином.
Для упрочнения связи альгината и хитозана, использовались две модификации методики. Первый вариант: после нанесения слоя альгината клетки инкубировались в солевом растворе, содержащем 0,2 М хлорид натрия и 0,05 М хлорид кальция в течение получаса, после чего наносился слой хитозана (2мг/мл). При втором варианте раствор хлорида кальция (0,ЗМ) добавлялся непосредственно при адсорбции хитозана (3 мг/мл).
При инкапсулировании культуры клеток селезенки использовалась следующая модификация метода. Процедура проводилась на 3-5 сутки культивирования в условиях ламинарной камеры. Клетки с раствором полианионов инкубировались в чашках Петри в течение 15 минут. Затем излишек раствора удалялся пипетированием, клетки промывались раствором Хенкса, 5 минут инкубировались с 1% раствором хлорида кальция и вновь промывались раствором Хенкса с добавлением антибиотиков. После нанесение слоя поликатионов клетки дважды промывались раствором Хенкса с антибиотиками с удалением надосадочной жидкости пипетированием. После окончания процедуры клетки помещались в матрас с питательной средой.
![Методы терапевтической коррекции микроциркуляции и системы гемостаза в профилактике тромбозов сосудистых реконструкций у больных с синдромом Лериша [Электронный ресурс]](/i/i/4705/195455.png "Методы терапевтической коррекции микроциркуляции и системы гемостаза в профилактике тромбозов сосудистых реконструкций у больных с синдромом Лериша [Электронный ресурс] Назаренко Александр Геннадьевич")
