Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Особенности этиологии и патогенеза одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваний 10
1.2. Основные направления и проблемы терапии одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваний 27
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Клинические методы исследования 44
2.2. Лабораторные методы исследования 55
2.3. Статистическая обработка полученных результатов 62
Глава 3. Результаты исследований. исследование особенностей патогенеза одонтогенных абсцессов и флегмон 63
3.1. Оценка активности эффекторных функций лейкоцитов пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области 63
3.2. Оценка активности антиоксидантной емкости плазмы крови пациентов с одонтогенными абсцессами и флегмонами 66
3.3. Микробиологические особенности одонтогенных гнойно- воспалительных заболеваний 67
Глава 4. Результаты исследований. Патогенетически обоснованный подбор методов терапии пациентов с одонтогенными гнойно-воспалительными заболеваниями 71
4.1. Клинико-лабораторное исследование эффективности локальной иммунотерапии препаратом «Суперлимф» больных одонтогенными флегмонами 71
4.2. Клинико-лабораторное исследование эффективности терапии препаратом «Иммуджен» больных одонтогенными флегмонами 79
4.3. Клинико-лабораторное исследование эффективности терапии препаратом «БиоРекс» больных одонтогенными флегмонами 85
4.4. Клинико-лабораторное исследование комплексной терапии с одновременным воздействием на основные патогенетические звенья одонтогенной инфекции 90
Выводы 97
Заключение 99
Список литературы 105
- Особенности этиологии и патогенеза одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваний
- Лабораторные методы исследования
- Клинико-лабораторное исследование эффективности локальной иммунотерапии препаратом «Суперлимф» больных одонтогенными флегмонами
- Клинико-лабораторное исследование комплексной терапии с одновременным воздействием на основные патогенетические звенья одонтогенной инфекции
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на достигнутые успехи в медицине, изучение вопросов патогенеза, диагностики, профилактики и терапии одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области (ЧЛО) остается наиболее актуальным для современной хирургической стоматологии [Булыгин, 2010; Тер-Асатуров, 2005; Робустова, 2006]. В структуре хирургической патологии челюстно-лицевой области абсцессы и флегмоны составляют от 23 до 38 %. В последние два десятилетия наметилась устойчивая тенденция к увеличению количества пациентов с атипично текущими и хроническими одонтогенными воспалительными заболеваниями [Тарасенко, 2002; Шулаков, 2004; Елисеев, 2005].
Большое значение в определении характера течения инфекционного заболевания имеет состояние неспецифической резистентности организма и активность иммунитета [Митронин, 2004; Елисеев, 2005]. Развитие одонтогенной инфекции предполагает хронический вялотекущий характер заболевания, вторичная иммунная недостаточность при данной патологии подтверждается многочисленными данными [Воложин, 1998; Гербова, 2002; Цымбалов, 2002; Удальцова, 2006]. Биохимическими маркерами антибактериального иммунитета являются некоторые параметры свободно-радикальных процессов в различных клеточных элементах крови и раны, такие как продукция свободных радикалов кислорода и азота фагоцитирующими клетками, активность основных антиокислительных ферментов в лейкоцитах, антиокислительная емкость плазмы. В зависимости от типа и интенсивности бактериального стимула продукция свободных радикалов и направление их генерации изменяются [Michalchik, 2002].
Учитывая влияние врожденного иммунитета на течение и исход различных патологических процессов, используются различные методы регуляции активности радикалформирующей способности фагоцитов как в эксперименте, так и в клинике [Гаврилюк, 2009]. В то же время изменения основных параметров иммунологического статуса и общей антиоксидантной активности организма больных при гнойной одонтогенной патологии строго индивидуально, и эффективность стандартной терапии существенно варьирует у различных пациентов [Царёв, 1993; Тарасенко, 2002; Шулаков, 2004].
Гнойно-воспалительные заболевания продолжают оставаться насущной проблемой, так как по современным представлениям микроорганизмы становятся резистентными не только к антибиотикам [Алексеева, 2005; Ball, 1997], но и к механизмам иммунитета человека [Бухарин, 2000]. Клиническими критериями персистенции служат частота хронизации инфекционного процесса, формирование реконвалесцентного бактерионосительства и продолжительность выделения патогена из инфицированных органов и тканей [Царев, 2006]. Патогенность различных штаммов бактерий тесно коррелирует со степенью индукции бактериальных антирадикальных ферментов [Clements 1999], антилизоцимной, антикомплементарной и антиинтерфероновой активностями бактерий [Бухарин 2000]. Перспективным является создание новых методических подходов поиска лекарственных препаратов, мишенью действия которых будут факторы персистенции, что определяет особую значимость данной темы исследования. В то же время, необходимо исследование причин сбоя иммунной системы в антагонизме с инфекцией.
Исходя из этого,актуальной является разработка новой стратегии патогенетически обоснованного лечения гнойно-воспалительных заболеваний ЧЛО с одновременным воздействием на основные звенья патогенеза. Учитывая вышеизложенное, были определены цель и задачи исследования.
Цель исследования: разработать комплекс мер по лечению гнойно-воспалительных заболеваний ЧЛО и профилактике развития их осложнений.
Достижение цели работы будет обеспечено комплексным выполнением следующих задач:
-
Определить интенсивность суммарного и внутриклеточного радикалообразования в фагоцитах больных с абсцессами и флегмонами с разной степенью распространенностью гнойно-воспалительного процесса.
-
Исследовать эффективность внутриклеточного киллинга поглощенных бактерий лейкоцитами больных с абсцессами и флегмонами с разной степенью распространенностью гнойно-воспалительного процесса.
-
Установить наличие корреляции между показателями внутриклеточной генерации радикалов и степенью эффективности фагоцитоза при различных клинических формах одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваний.
-
Определить изменения антиоксидантной активности плазмы крови больных с одонтогенными абсцессами и флегмонами в динамике заболевания на фоне стандартной комплексной терапии.
-
Оценить клиническую эффективность добавления к стандартной комплексной терапии пациентов с одонтогенными флегмонами метода локальной иммунокоррекции препаратом «Суперлимф», комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот «Иммуджен» и местной терапии фитопрепаратом «БиоРекс» в отдельности и в комплексе.
Научная новизна исследования. Впервые обнаружено нарушение перераспределения радикалов вне- и внутри лейкоцитов, выделенных из периферической крови пациентов с одонтогенными гнойно-воспалительными заболеваниями. Выявлено, что дефицит внутриклеточных радикалов в лейкоцитах больных приводит к нарушению фагоцитарной активности и персистенции возбудителей гнойной инфекции. Выявлена прямая корреляция между тяжестью инфекционного процесса и процентом выживаемости бактерий после фагоцитоза (k-0,84).
Впервые обоснована целесообразность применения препаратов, воздействующих на перераспределение радикалов вне- и внутри клетки для лечения больных с одонтогенными флегмонами. Научно доказано положительное влияние локальной иммунокоррекции с применением комплекса цитокинов «Суперлимф» в составе комплексной терапии пациентов с одонтогенными флегмонами разной степени тяжести.
Впервые исследовано влияние комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот на динамику общих и местных клинических проявлений в комплексном лечении больных с одонтогенными флегмонами.
Впервые показано положительное влияние местного применения фитопрепарата «БиоРекс» на антимикробный иммунитет, уменьшение микробной обсемененности раневой поверхности и репаративные процессы у больных с флегмонами челюстно-лицевой области.
На основании выполненных биохимических и иммунологических исследований установлено, что применение препаратов, воздействующих на различные звенья патогенеза в комплексном лечении одонтогенных флегмон обеспечивает оптимальные результаты: быстрый регресс воспалительных явлений, сокращение сроков экссудации и усиление репаративных тканевых процессов.
Практическая значимость работы. Определена значимость в качестве прогностических и диагностических параметров показателей внутриклеточного радикалообразования, фагоцитарной активности лейкоцитов больных с гнойно-воспалительными процессами челюстно-лицевой области. Выявлена прямая корреляция между тяжестью инфекционного процесса и процентом выживаемости бактерий после фагоцитоза (k-0,84).
Предложен метод локальной обработки раны препаратом «Суперлимф» в виде орошений и поверхностной инфильтрации в комплексном лечении пациентов с одонтогенными флегмонами.
В комплекс лечебных мероприятий был включен препарат «Иммуджен» – комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот, восполняющий спад антиоксидантной емкости плазмы крови (наиболее выражен на 3-5- сутки на фоне стандартной терапии) и стимулирующий процессы репарации.
Предложен метод локальной обработки препаратом «БиоРекс», ускоряющий сроки очищения раны и стимулирующий грануляцию и эпителизацию раневой поверхности.
Эффективность совместного клинического применения препаратов «Суперлимф», «Иммуджен», «БиоРекс» позволяет сократить сроки госпитализации, уменьшить количество осложнений и снизить затраты на лечение данного контингента больных, а также расширить показания к использованию комплексной терапии при различных нозологических формах воспалительных заболеваний местных тканей челюстно-лицевой области.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Одонтогенные абсцессы и флегмоны протекают на фоне снижения внутриклеточного радикалообразования, что обеспечивает длительную персистенцию возбудителей заболевания.
-
Исследование динамики активности антиоксидантной емкости плазмы крови больных с одонтогенными абсцессами и флегмонами показало, что вслед за адаптивным всплеском их активности в первые сутки на фоне начала терапии происходит спад уровня, сохраняющийся вплоть до конца срока наблюдения в группах пациентов с более тяжелыми формами гнойной инфекции.
-
Полимикробный характер микробной флоры с высокой антибиотикорезистентностью и персистентным потенциалом возбудителей одонтогенных абсцессов и флегмон определяет характер и тяжесть гнойного процесса.
-
Доказано, что применение локальной иммунотерапии с помощью препарата «Суперлимф» при одонтогенных флегмонах увеличивает уровень внутриклеточных радикалов и фагоцитарную активность лейкоцитов пациентов с флегмонами.
-
Применение препарата «БиоРекс»в комплексном лечении одонтогенных флегмон создает оптимальные условия для очищения раны от микробов, токсинов бактериального происхождения и снижает опасность распространения гнойной инфекции у больных с одонтогенными флегмонами.
-
Препарат «Иммуджен» компенсирует спад антиоксидантной емкости плазмы крови и является эффективным дополнением к комплексной терапии больных с гнойно-воспалительными заболеваниями, сокращая сроки репарации раневой поверхности.
-
Комплексный метод лечения с применением препаратов, одновременно воздействующих на разные звенья патогенеза, оказывает более выраженный лечебный эффект вследствие активации процессов противомикробной защиты и регенерации в мягких тканях челюстно-лицевой области.
Внедрение в практику. Результаты диссертационной работы доложены на научно-практических конференциях, конгрессах, опубликованы в печати.
Результаты исследования внедрены в практику работы отделения челюстно-лицевой хирургии Республиканской клинической больницы и в учебный процесс кафедры хирургической стоматологии ГОУ ВПО «Кабардино-Балкарский государственный университет им.Х.М. Бербекова».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ:
в журналах, рекомендованных ВАК – 3 статьи; в сборниках международных конференций и симпозиумов – 4 статьи; в местной печати – 3 научные работы.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспектива-2004», Нальчик, 2004, Всероссийской конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Перспектива-2009», Нальчик, 2009, на X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», Москва, 2009, XVI Российском национальном конгрессе «Человек и здоровье», Москва, 2009, Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины», Нальчик, 2010, X Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, Саратов, 2010, Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной хирургии», Нальчик, 2010, Научно-практической конференции, посвященной 45-летию медицинского факультета КБГУ, Нальчик,2011. На совместном заседании кафедр хирургической, ортопедической, терапевтической стоматологии, детской стоматологии, кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Кабардино-Балкарский государственный университет им.Х.М. Бербекова».
Объем и структура диссертации. Изложена на 127 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследования, двух глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Список литературы включает 225 источника, в том числе 175 отечественных и 50 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 11 рисунками, 32 таблицами, 2 схемами.
Особенности этиологии и патогенеза одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваний
Проблема лечения острой одонтогенной инфекции многие годы остается в центре внимания исследователей и клиницистов [11, 16, 24, 41, 51]. Несмотря на совершенствование методов хирургического и медикаментозного лечения и применение средств нефармакологического характера, количество больных с абсцессами и флегмонами в челюстно-лицевых отделениях колеблется от 30-70 % от общего числа госпитализируемых [15, 113]. Применение при лечении больных с абсцессами и флегмонами лица и шеи современных методов (гипербарическая оксигенация [55], лазер [1, 13, 15, 140], ультразвук [161], озон [166], введение антибиотиков [89, 142, 149, 163], в том числе внутривенно, внутриартериально и через лимфатические пути) существенно повысило лечебный эффект, однако не позволило избежать осложнений (менингит, тромбоз вен лица, сепсис и др.) [76]. Осложнения при флегмонах челюстно-лицевой области наблюдаются в 2—7 % [52]. Кроме того, отмечается тенденция увеличения количества пациентов с атипичным течением заболевания, склонностью к прогрессированию и генерализации гнойно-воспалительного процесса [122].
В возрастном отношении имеется два пика заболеваемости абсцессами и флегмонами челюстно-лицевой области (ЧЛО): 9-12 и 20-35 лет [11, 120, 160]. Первый пик приходится на период сменного прикуса, когда интенсивность поражения молочных зубов сочетается с высокой поражаемостью кариесом первых моляров. Второй пик связан с ростом интенсивности кариеса постоянных зубов и частыми осложнениями при прорезывании нижних восьмых зубов.
1. Клинически при возникновении абсцессов наблюдается уплотнение тканей, которое сопровождается появлением припухлости лица и шеи. Над областью гнойника нередко появляется гиперемия кожи. Если гнойный процесс расположен в глубоких участках челюстно-лицевой области (крыловидно-нижнечелюстное и окологлоточное пространства, крылонёбная и подви 11 сочная ямка и др.), то воспалительные изменения со стороны кожных покровов отсутствуют. Важным признаком абсцесса является симптом флюктуации. Он возникает в результате наличия гноя, заключенного в полость с эластичными стенками, которые передают толчок от одной стенки по всем направлениям. Этот симптом отсутствует при локализации абсцесса на большой глубине, особенно под слоем мышц [160].
2. При ограниченном гнойном воспалении мягких тканей челюстно-лицевой области и шеи клинические симптомы интоксикации выражены обычно умеренно, а при вяло развивающемся процессе они могут отсутствовать. Это является особенностью абсцесса как гнойного процесса, отграниченного от окружающих тканей пиогенной мембраной — внутренней стенкой гнойника, выстланной грануляционной тканью. Пиогенная оболочка отграничивает гнойно-некротический процесс и продуцирует экссудат. Способность окружающих мягких тканей создавать грануляционный вал является проявлением нормальной защитной реакции организма, направленной на изолирование гнойного воспаления, и неспецифической реактивности, которая определяется нормальным состоянием физиологических систем здорового организма. В тканях челюстно-лицевой области пиогенная мембрана тонкая и не везде чётко определяется [160].
В отличие от абсцесса, при флегмоне происходит разлитое распространение воспалительного процесса. Флегмона — гнойное разлитое воспаление клетчатки, расположенной под кожей, слизистой оболочкой, между мышцами и фасциями [79, 122]. Угроза развившейся флегмоны челюстно-лицевой области заключается в высокой степени интоксикации, сказывающейся на функционировании систем организма, а также развитии тяжелых осложнений, таких, как сепсис, токсико-инфекционный шок, септический менинго-энцефалит, абсцесс головного мозга, тромбоз мозговых сосудов, септический эндо- и миокардит [52, 76, 137]. В зависимости от соотношения основных компонентов воспалительной реакции различают флегмоны с преобладанием экссудации (серозная, гнойная) и флегмоны с преобладанием альтерации (гнойно-некротическая). Для первого вида характерен выраженный отек клетчатки с диффузной инфильтрацией лейкоцитами, кроме тога, в пораженной ткани встречаются множественные участки некроза клетчатки с признаками гнойного расплавления. Четкой демаркационной зоны распространения инфекционного процесса нет. При гнойно-некротических флегмонах ведущими в картине воспаления являются некротические изменения в виде сливных участков некроза клетчатки, фасций и иногда прилегающих мышц. Встречаются множественные очаги кровоизлияний, резкий отек сопровождается умеренной клеточной инфильтрацией. Течение и исход гнойно-воспалительных заболеваний в значительной степени зависит от иммунологической реактивности организма больного. Клиническое течение флегмон челюстно-лицевой области может быть различно по степени выраженности симптомов воспаления: гиперактивно (с развитием тяжелых местных и общих проявлений), умеренно активно, гипореактивно (длительно, вяло, без существенных общих и местных проявлений) [56, 101, 134]. Вероятность возникновения инфекционно-воспалительного процесса зависит от вирулентности возбудителя (патогенных свойств микроорганизмов и их количества), а также от состояния системы неспецифической антимикробной резистентности и уровня иммунологической реактивности макроорганизма, т.е. его способности ответить на действие патогена защитными реакциями. Микробы, внедрившиеся в ткани, приспосабливаются к новым условиям существования, продуцируют экзотоксины — вещества, обладающие ферментативными свойствами и способные избирательно поражать клеточные и межклеточные тканевые структуры макроорганизма. Из поврежденных клеток высвобождается ряд лизосомальных ферментов: протеолитических, гликолитических, липолитических. Указанные ферменты, в свою очередь, повреждают клеточные мембраны и такие структурные элементы соединительной ткани, как коллаген, протеогликаны, гликозаминогликаны. При этом высвобождаются медиаторы воспаления, основной мишенью которых становится микроцир-куляторное звено сосудистого русла [64, 67]. Под влиянием медиаторов воспаления возникает кратковременный спазм приводящих артериол, сменяющийся вскоре их длительным расширением, как в зоне первичного повреждения, так и вокруг нее, что клинически проявляется в виде гиперемии покровных тканей (кожа, слизистая оболочка). Затем наступает следующая фаза сосудистой реакции, характеризующаяся миопаралитическим расширением прекапилляров и капилляров, которая может перейти в венозную гиперемию с исходом в престаз, стаз (полное прекращение кровотока) и тромбоз сосудов. Замедление кровотока сопровождается нарастанием концентрации факторов, повышающих проницаемость стенок микрососудистого русла (про-стагландины, лейкотриены, интерлейкины, калликреин, коллагеназа, эласта-за), что обусловливает выход плазмы в ткани очага воспаления — экссудацию [145, 156, 175]. Направленная миграция лейкоцитов (хемотаксис) в зону повреждения приводит к появлению лейкоцитарного инфильтрата, состоящего преимущественно из полиморфноядерных лейкоцитов, которые обладают способностью к фагоцитозу и выделению медиаторов воспаления. В очаге воспаления полиморфноядерные лейкоциты в тесной кооперации с другими клетками (лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, тучными и плазматическими клетками) фагоцитируют микроорганизмы. Одновременно с этим процессом активно развивается следующий этап воспаления — пролиферация, обеспечивающая ограничение инфекционно-воспалительного очага и возмещение возникшего дефекта тканей. Из инфекционно-воспалительного очага микроорганизмы могут с током лимфы достигать регионарных лимфатических узлов, где происходит их фиксация и уничтожение.
Таким образом, при возникновении гнойно-воспалительных заболеваний играют роль особенности возбудителей и механизмов защиты макроорганизма, от итога взаимодействия которых зависит распространенность и тяжесть патологического процесса.
Лабораторные методы исследования
Выделение нейтрофилов из периферической крови человека. Для выделения нейтрофилов использовали венозную кровь, взятую утром натощак путем пункции локтевой вены больных и доноров в строго асептических условиях. Кровь собирали в стерильные силиконизированные пробирки, содержащие 1,0 мл антикоагулянта — раствора гепарина («Richter» Венгрия) (25 единиц на 1.0 мл крови). Количество используемой крови на одно исследование составляло от 5 до 10 мл. Нейтрофилы выделяли по стандартной методике на двойном градиенте плотности. Для отого в силиконизированные пробирки поэтапно наслаивали равные объемы растворов фиколлверографина (удельная плотность 1,199 гр\см и 1,080 гр\см ) и периферическую кровь. Затем пробирки центрифугировали в течение 40 минут при 800g в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования нейтрофилы концентрировались в интерфазном кольце. Взвесь нейтрофилов переносили в силиконизированные пробирки и дважды отмывали раствором Хен-кса (рН 7, 4). Режим центрифугирования - 10 минут при 400g. Подсчитывали и доводили до рабочей концентрации (см. ниже).
Выделение лейкоцитов из периферической крови человека. Для выделения лейкоцитов использовали венозную кровь, взятую, как описано выше. Количество используемой крови на одно исследование также составляло от 5 до 10 мл. Кровь наслаивали на равный объем градиента плотности фиколлверографина (удельная плотность 1,199 гр\см ) и центрифугировали 40минут при 400g. Взвесь лейкоцитов концентрировалась в интерфазном кольце. Клетки собирали в силиконизированную пробирку и дважды отмывали путем центрифугирования (10 минут, 400g), подсчитывали и доводили до рабочей концентрации (см. ниже).
Для выделения плазмы использовали периферическую венозную кровь, взятую утром натощак в асептических условиях путом пункции локтевой вены. Кровь собирали в стерильные силиконизированные пробирки, содержащие 1,0 мл антикоагулянта — раствора гепарина («Richter» Венгрия) (25 единиц на 1,0 мл крови). Немедленно перемешивали с антикоагулянтом, не допуская образования воздушных пузырей. Для приготовления плазмы стабилизированную кровь центрифугировали 5-7 минут при 400g и собирали супернатант. 2.2.2. Определение радикалобразующей способности нейтрофилов
Измерение хемилюминесценгщи (ХЛ). Для изучения продукции активных кислородных метаболитов традиционно используется хемилюминёс-центный анализ [38]. Измерение хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов производили на хемилюминометре ПХЛ-1, а также на LKB Luminometer (model 1251, Sweden) в термостатированных при 37 С стеклянных кюветах при постоянном перемешивании. Образец содержал 5x105 клеток в 1 мл раствора Хенкса, 2x10-5 люминола (или люцигенина). В качестве показателя степени активации фагоцитов принимали изменение амплитуды ХЛ ответа (I отн.ед.). Индекс предстимуляции иммуноцитокинами рассчитывали как отношение амплитуд ХЛ ответов стимулированных и контрольных клеток.
Измерение продукции супероксидрадикала нейтрофипами. Для измерения концентрации супероксидрадикала, генерируемого нейтрофилами, использовали метод, основанный на реакции восстановления супероксидом ци-тохрома с [213]. В работе исследовали спонтанную и индуцированную продукцию супероксидрадикала. В инкубационную смесь объемом 1 мл и содержащую 100 мкл суспензии нейтрофилов (106\мл) в растворе Хенкса (рН 7,4) и 50 мкл цитохрома с (12,5 мг\мл) добавляли Юмкл форболмиристатацетата (ФМА) (10"6М). Спонтанную продукцию супероксидного радикала измеряли путем добавления Юмкл диметилсульфоксида (99 %) вместо ФМА. Для выяснения вклада в реакцию восстановления цитохрома с именно супероксидного радикала в реакционную смесь добавляли 10 мкл Cu-Zn-СОД (0,5мг\мл). Приготовленные таким образом пробы инкубировали при периодическом перемешивании в течение 1 часа при 37 С. Затем суспензии центрифугировали 10 минут при 400 g, после чего измеряли оптическое поглощение суперна-танта при 550нм (А550) и выражали в нМ/мин. с учетом показателя экстинк-ции восстановления цитохрома с (є = 21 мМ"1 см"1).
Флюоресцентный метод измерения внутриклеточной продукции активных метаболитов кислорода. Внутриклеточную генерацию радикалов исследовали с помощью флуоресцентного красителя гидроэтидина [21]. Гид-роэтидин был любезно предоставлен В.И. Алексеевой (НИИ органических полупродуктов и красителей). Матричные растворы флюорохрома были приготовлены в диметилформамиде и хранились при —18 С.
Нейтрофилы инкубировали в растворе Хенкса (без фенолового красного, рН 7,4) 15 минут с 10"4 М гидроэтидина, отмывали центрифугированием (5минут при 800g и +4 С) в избытке раствора Хенкса и окончательно ресус-пендировали до концентрации 10бкл\мл. После этого клетки стимулировали форболмиристатацетатом (ФМА) 10 5М. Образование этидиума из гидроэтидина в клетках регистрировали, измеряя интенсивность флуоресценции этидиума при длинах волн A,B03G. = 473 нм, А,исп. = 610 нм на спектрофлуориметре MPF-44 (Perkin-Elmer) в сантиметровых кварцевых кюветах, термостатированных при 37С и постоянном перемешивании. Для рассчета изменения генерации АФК под действием изучаемых препаратов был введен параметр F: где Io - интенсивность люминесценции этидиума в опыте; Ik — интенсивность люминесценции этидиума в контроле.
Определение концентрации нитратов-нитритов в плазме крови больных и здоровых доноров. Общую концентрацию нитратов и нитритов в плазме крови больных и здоровых доноров (мкМ) определяли спектрофотометрически с использованием реактива Гриса (NitrateXNitrite Colorimetric Assay Kit) (Cayman, USA) [197]. Для этого в каждую пробу добавляли разбавленную в два раза буфером (Assay buffer) плазму крови, Юмкл энзимного кофактора и 10 мкл нитрат редуктазы. Инкубировали 1 час при комнатной температуре, вносили 50 мкл реактива Гриса R1 и 50 мкл реактива Гриса R2. Инкубировали 10 минут при комнатной температуре, измеряли оптическую плотность при 540 нм.
Антиоксидантную активность (АОА) плазмы крови определяли по методике Клебанова Г. [148]. Для этого ЮОмкл желточной суспензии добавляли к 100 мкл плазмы и 100 мкл FeS04, доводя общий объем пробы до 1мл. Смесь инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Затем в пробирку вносили 0, 5мл 20 % трихлоруксусной кислоты и 0, 1мл 10"" М раствора ио-нола в спирте. Пробы центрифугировали 10 минут при 1500g и отбирают су-пернатант. К 0,7 мл супернатанта добавляют 0, 6мл 0.5 % тио барбитуровой кислоты и греют на водяной бане при 100 С 30 минут, после чего измеряют светопоглощение при А5з2- Антиоксидантную активность выражали в виде процента от контроля (проба без плазмы):
Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали стандартным ме-тодом в отношении бактерий Staphylococcus aureus, выделенных у каждого больного [92]. Для этого смешивали 1 мл суспензии нейтрофилов и 1 мл взвеси бактерий (10 кл) в растворе Хенкса (рН 7,4). Смесь инкубировали при помешивании 30 мин при 37 С. Приготавливали мазки на стекле, фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гимзе. В мазках на 100 клеток подсчитывали количество фагоцитирующих макрофагов. Полученные данные выражали в виде фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа.
Определение эффективности внутриклеточного кгишинга нейтрофи-лами бактерий. Оценку эффективности внутриклеточного киллинга оценивали по методу Nilsen [215]. После постановки фагоцитарной реакции (см. выше) взвесь центрифугировали 10 минут при 1500g, отбирали осадок, добавляли трехкратный объем Н20 и производили высев по методу Гольда на чашку Петри с мясо-пептонным агаром. Число выживших после фагоцитоза бактерий определяли по количеству колоний в секторах через 24 часа.
Клинико-лабораторное исследование эффективности локальной иммунотерапии препаратом «Суперлимф» больных одонтогенными флегмонами
Известно, что препараты рекомбинантных цитокинов и их комплексов увеличивают радикалообразование и, следовательно, эффективность фагоцитоза [9, 19, 199]. Учитывая полученные ранее данные, демонстрирующие наличие дисбаланса перераспределения радикалов в лейкоцитах больных с одонтогенными флегмонами, была поставлена задача изучения иммунокор-ригирующего влияния препарата «Суперлимф» (ООО «Центр иммунотерапии «Иммунохелп» при РГМУ, г. Москва, Россия,регистрационное удостоверение № 00516\01-2001). Препарат наносился местно в виде орошений. Клинико-лабораторное исследование было проведено в группе больных с распространенными флегмонами (3 и более клетчаточных пространства). Влияние препарата на течение раневого процесса в гнойной ране изучалось в динамике после хирургического вмешательства совместно с антибактериальной и дезинтоксикационой терапией. Для оценки клинической эффективности локальной иммуноцитокинотерапии наблюдали группу больных с наиболее тяжелыми формами одонтогенных гнойных заболеваний — пациенты с флегмонами, распространяющимися на 3 и более клетчаточных пространства. Клиническую эффективность терапии оценивали в 3-балльной системе по выраженности симптомов активности воспалительного процесса в мягких тканях (см. главу 2). Эффект препаратов считался выраженным при купировании признаков локального воспаления в мягких тканях до 4—5 баллов, умеренным — до 6 баллов, отсутствующим — до 7-8 баллов.
Больные групп «Суперлимф» и «Плацебо Суперлимф», поступали в стационар с одонтогенными околочелюстными флегмонами в экстренном порядке. Давность заболевания у больных с момента появления первых клинических признаков (небольшая припухлость, боль при дотрагивании, нарушение функций) составляла 2-5 суток. Одонтогенная околочелюстная флегмона распространялась на три и более клетчаточных пространства. Местно определялся болезненный инфильтрат с довольно четкими границами и умеренно выраженным церифо-кальным отеком, как правило, отчетливо определялся симптом флуктуации.
Выбор иммунокорригирующего препарата в комплексной терапии пациентов с распространенными одонтогенными флегмонами был основан на подборе лекарственного средства, компенсирующего дефицит внутриклеточных радикалов. При исследовании доли Rin в разных группах, действительно, было обнаружено, что с 2-3 суток комплексной терапии с подключением локальной иммунотерапии препаратом «Суперлимф», достоверно увеличивается внутриклеточная составляющая АФК (р 0,01). При исследовании показателей активности общего радикалообразования в лейкоцитах разных групп было обнаружено, что продукция АФК лейкоцитами увеличивается с 3 суток в группе «Суперлимф» (р 0,01) (табл. 22). В ранние сроки терапии наиболее важной задачей является очищение раны от микробов, микробных токсинов и погибших клеток, в связи с чем повышение радикалообразования является одним из механизмов улучшения ранозаживления на 1—7 сутки.
Однако повышенная радикальная нагрузка приводит к снижению анти-оксидантной активности плазмы крови (табл. 22). Наиболее объективным показателем эффективности фагоцитарной реакции является оценка внутрикле- точного киллинга. На фоне повышение общего числа фагоцитирующих лейкоцитов в группе «Суперлимф» выявлено достоверное снижение % выживших после фагоцитоза бактерий.
Результаты проведенных исследований клинической эффективности локальной иммунотерапии показали, что при поступлении выраженность симптомов воспаления составляла у пациентов группы «Суперлимф» - 11,3±0, 4; «Плацебо Суперлимф» - 11,4±0,4 (рис. 6). Ко 2-3 дню при местной терапии препаратом «Суперлимф» совместно с антибактериальной и дезинтоксикационной терапией значительно уменьшалась выраженность гноетечения и отека.
При этом отмечалось быстрое очищение раны от некротизированных тканей и уменьшение размеров инфильтрата (табл. 23). На пятые сутки у больных группы «Суперлимф 2» отмечалось почти полное купирование воспалительного процесса в ране: очищение от некротических тканей, отсутствие раневого отделяемого, заполнение раневой поверхности грануляционной тканью, уменьшение площади раны. Подобная картина раневой поверхности наблюдалась у пациентов группы «Суперлимф» на 6-7 сутки. У больных, получавших традиционную терапию, положительная динамика была менее выражена: на пятые сутки выраженность гнойно-воспалительного процесса достигала 7,0±0, 5 и 9, 2±0, 5 балла, соответственно (рис.6) (р 0,05 по сравнению с баллами группы «Суперлимф»). У пациентов исследуемых групп в острый период была выявлена лабораторная картина воспалительного процесса: СОЭ — 25±5; количество лейкоцитов - 27, 5±5,0; сдвиг лейкоцитарной формулы влево (табл. 24).
Отличий лабораторных показателей крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, уровень гемоглобина и др.) и мочи (белок, удельный вес) у пациентов разных групп при поступлении замечено не было. На 3—7 сутки признаки воспалительного процесса в группе «Суперлимф» достоверно уменьшились (р 0,05), на 14 сутки значения гемограмм больных группы «Суперлимф» близки к норме, лабораторные показатели больных группы «Плацебо Суперлимф» несколько выше нормальных (р 0,05).
Таким образом, препарат «Суперлимф» оказывает комплексное действие при лечении гнойно-воспалительных заболеваний ЧЛО локализации: ускоряет очищение воспалительного очага от гнойного содержимого и стимулирует восстановительные процессы, способствуя заживлению ран. Нежелательным признаком общей активации радикалообразования при локальной терапии комплексом цитокинов является понижение антиоксидантной емкости плазмы.
Клинико-лабораторное исследование комплексной терапии с одновременным воздействием на основные патогенетические звенья одонтогенной инфекции
Ранее было выявлено три основных патогенетических звена в развитии одонтогенных гнойно-воспалительных заболеваний: 1) снижение фагоцитарной активности по причине дефицита внутриклеточных радикалов; 2) анти-оксидантный спад на фоне повышенного суммарного радикалообразования; 3) полимикробный характер микрофлоры с высоким персистентным потенциалом и высокой антибиотикорезистентностью (см. главу 3).
В дополнение к комплексной стандартной терапии подбирались препараты, воздействующие на вышеперечисленные звенья патогенеза. Было исследовано, что комплекс иммуноцитокинов «Суперлимф» повышает долю внутриклеточных радикалов в лейкоцитах больных с флегмонами 3 и более клетчаточных пространств, что приводит к более быстрому очищению раны от микробов, бактериальных токсинов.
Фитопрепарат «БиоРекс» угнетает каталазу факультативно-анаэробной микрофлоры, имеет антиоксидантные свойства [148]. Было обнаружено, что «БиоРекс» способствует и очищению раневой поверхности, и ранозаживленшо.
«Иммуджен» в отличие от стандартных антиоксидантных препаратов вополняет антирадикальный потенциал, не уменьшая при этом способности к радикалообразованию [204]. При исследовании клинической эффективности препарата «Иммуджен» у больных с одонтогенными распространенными флегмонами было выявлено улучшение репаративных процессов.
Так как изученные препараты воздействуют на разные звенья патогене за, в дальнейшем была изучена клиническо-лабораторная эффективность их сочетанного-воздействия (в дополнение к стандартной терапии).
При оценке внутриклеточной генерации радикалов в группах «Суперлимф» и «Суперлимф+Иммуджен+БиоРекс» не было выявлено достоверных различий (р 0,01): доля АФК повышалась со вторых суток и нормализовыва-лась к 10-14 суткам (рис. 9). В других группах изменений % внутриклеточных радикалов не наблюдалось.
Аналогичные изменения зарегистрированы при -исследовании интенсивности ХЛ (данные не приведены).
Так как именно радикалообразование является одним из ведущих механизмов уничтожения бактерий, для оценки влияния на фагоцитарную активность совместного применения препаратов в качестве группы сравнения была выбрана группа «Суперлимф». Показатели эффективности фагоцитоза при комбинированной терапии достоверно выше по сравнению с группой «Плацебо» (р 0,01) (табл. 31). Однако стоит отметить разницу в параметрах антибактериальной защиты в группах «Суперлимф» и «Суперлимф+ Иммуд-жен+БиоРекс», проявляющуюся с 3 дня терапии (табл. 31). При комбинированном использовании препаратов, воздействующих на разные звенья патогенеза, улучшение эффективности фагоцитоза происходит за счет воздействия иммуноцитокинов и непрямого антибактериального эффекта фитопрепарата БиоРекс, а также, по-видимому, за счет уменьшения собственной радикальной нагрузки при восполнении дефицита антиоксидантов.
При исследовании влияния сочетанной терапии на антиоксидантную емкость плазмы крови обнаружено, что у пациентов группы «Суперлимф+ Иммуджен + БиоРекс» не наблюдался спад суммарной антиоксидантной активности, наиболее выраженной в группах «Плацебо» и «Суперлимф». При сравнительном анализ данных, полученных из групп «Иммуджен» и «Супер-лимф+Иммуджен+БиоРекс», выявлено достоверное увеличение этого параметра на 5-14 сутки (р 0,01). По видимому, коррекция антиоксидантного показателя более выраженная в группе «Суперлимф+Иммуджен+БиоРекс» связана с антиоксидантными компонентами препарата «Иммуджен» и биофла-воноидами препарата «БиоРекс».
Результаты проведенных исследований клинической эффективности комбинированной терапии показали, что при поступлении выраженность симптомов воспаления составляла у пациентов группы «Суперлимф+Иммуджен+БиоРекс» - 11,3±0,4; «Плацебо Суперлимф+ Иммуджен+ БиоРекс» —11, 4±0,4 (рис. 11). Клиническая эффективность, выраженная в баллах, проявлялась в купировании воспалительного процесса в ране, более быстром появлении признаков репарации (рис. 11).
У больных, получавших традиционную терапию, положительная динамика была менее выражена: на пятые сутки выраженность гнойно-воспалительного процесса достигала 6, 5±0, 5 и 10, 2±0, 5 балла, соответственно (рис. 11) (р 0,05 по сравнению с баллами группы «Плацебо»). Отличий лабораторных показателей крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, уровень гемоглобина и др.) и мочи (белок, удельный вес) у пациентов разных групп при поступлении замечено не было. На 2-5 сутки признаки воспалительного процесса в группе «Суперлимф+Иммуджен+БиоРекс» достоверно уменьшились (р 0,05), на 10 сутки значения гемограмм больных группы «Супер-лимф+Иммуджен+БиоРекс» близки к норме (данные не приведены).
Таким образом, комплексная терапия пациентов с распространенными флегмонами с подключением препаратов «Суперлимф», «Иммуджен», «БиоРекс» является наиболее эффективным методом и наряду с антибактериаль- ной и дезинтоксикационнои терапией направлена как на очистку раны от микробов, их токсинов и некротизированных тканей, так и на стимуляцию репаративных процессов. Кроме того, препараты «Суперлимф» и «БиоРекс» наносятся локально на раневую поверхность, что позволяет избежать возможных системных побочных эффектов, которые наблюдаются при парентеральном или энтеральном путях введения лекарственных средств.
