Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1. Белки, содержащиеся в молоке 7
2.1.1. Полиморфизм белков молока 8
2.1.2. Полиморфизм aSl- казеина 8
2.1.3. Полиморфизм aS2- казеина 9
2.1.4. Полиморфизм р-казеина 9
2.1.5. Полиморфизм каппа-казеина 9
2.1.5.1. Частота встречаемости аллельных вариантов гена каппа-казеина у крупного рогатого скота 14
2.2. Влияние полиморфизма каппа-казеина на молочную продуктивность и качество молока 19
2.3. Методы изучения полиморфизма гена каппа-казеина 2 9
2.4. Дифференциация пород крупного ругатого скота по днк-маркерам 35
3. Материалы и методы исследования 41
3.1. Объекты исследований 41
3.2. Выделение ДНК 42
3.3. Определение концентрации ДНК 43
3.4. Проведение полимеразной цепной реакции 43
3.5. Проведение ПЦР для амплификации гена каппа-казеина 44
3.6. Типирование А- и ^-аллелей гена CSN3 с использованием рестрикционного анализа (метод ПЦР-ПДРФ) 45
3.7. Типирование А- и ^-аллелей гена CSN3 с помощью аллель-специфичной ПЦР 46
3.8. Проведение ISSR-анализа 47
3.9. Статистический анализ данных 47
4. Результаты исследования 49
4.1. Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина (csn3) у российских пород крупного рогатого скота 49
4.1.1.Типирование аллелей гена каппа-казеина у исследуемых животных 49
4.1.2. Оценка частот встречаемости А- и В-аллелей гена каппа-казеина
у исследуемых пород крупного рогатого скота 51
4.1.3. Обсуждение результатов 51
4.2. Дифференциация пород крупного рогатого скота и яков с помощью молекулярного мультилокусного анализа (issr- анализ) 55
4.2.1. Спектры ISSR-полиморфизма у исследуемых животных 55
4.2.2. Дифференциация пород крупного рогатого скота и яков по AG-ISSRH GA-ISSR- маркерам 58
4.2.2.1. Характеристика исследуемых популяций по числу и частотам встречаемости А G-ISSR-фрагментов 58
4.2.2.2. Характеристика исследуемых популяций по числу и частотам встречаемости GA-ISSR-фрагментов 67
4.2.2.3. Сравнительный анализ исследуемых выборок животных по AG- и GA-ISSR-маркерам (доля полиморфных фрагментов, коэффи циент внутригруппового сходства и уровень гетерозиготности) 71
4.2.3 Характеристика AG-ISSR- и GA-ISSR-маркеров и возможности их использования для дифференциации пород крупного рогатого скота 75
4.2.3.1. Дифференциация пород крупного рогатого скота на основе AG-ISSR-маркера 75
4.2.3.2. Дифференциация пород крупного рогатого скота на основе GA-lSSR-маркера 78
4.23.3. Дифференциация пород турано-монгольского корня с использованием AG-ISSR и GA-ISSR-маркеров 80
4.2.4. Дифференциация стад и линий ярославской породы по AG-ISSR
и GA-ISSR-маркерам 86
4.2.5 Обсуждение результатов 98
5. Выводы 102
6. Список цитированной литературы
- Полиморфизм белков молока
- Методы изучения полиморфизма гена каппа-казеина
- Проведение ПЦР для амплификации гена каппа-казеина
- Характеристика исследуемых популяций по числу и частотам встречаемости А G-ISSR-фрагментов
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Общественные отношения, складывающиеся в современном российском государстве, нуждаются в универсальном правовом регуляторе, позволяющем развиваться этим отношениям и управлять асоциальными явлениями. Ломка сложившихся стереотипов негативно отразилась на всех сферах жизнедеятельности общества, ее последствия затронули подрастающее поколение страны, актуализировав тем самым проблему криминализации подростковой среды. Проблема защиты прав ребенка существовала в России во все времена, к сожалению, она не решена и сегодня. Социально-экономическая ситуация в стране диктует острую необходимость разработки научно обоснованного комплекса мер, создающих систему правовых условий для реализации прав ребенка.
Дети - не только будущее, но и настоящее, не только национальная, но и общечеловеческая ценность. Это особая, со своими интересами, социально-демографическая группа, нуждающаяся в силу умственной и физической незрелости в специальной заботе государства и общества.
Защита прав ребенка, признанного отечественным законодательством самостоятельным участником правовых отношений, связана с множеством проблем теоретического и практического характера. О гражданских, семейных правах, возникающих проблемах в данных сферах написано достаточно много литературы. Что же касается права ребенка на информацию и ее защиту, то эта проблема находится на стадии развития, так как законодательное направление политики государства в сфере защиты информации особенно важно на современном этапе развития общества, поскольку процессы формирования и сохранности информационных ресурсов все еще остаются без достаточной правовой охраны и фактической защиты. Информация пронизывает все сферы человеческой жизни и деятельности. Моральные и этические суждения о событиях, фактах, лицах зависят от качества информации о них, от надежности источника информации, от своевременности ее получения и использования. Информация в целом составляет основу мировосприятия личности, ее поведения, реакции на
4 действия, события, факты. Информационный вакуум или дезинформация порождает неуверенность, сомнения у личности, ее неадекватную реакцию в жизненных ситуациях, в том числе и тех, которые влекут за собой определенные правоотношения. Отсутствие информации или ее плохое качество ведет и к тому, что человек, основываясь на такой информации, может принять неправильное решение. Конституционное право личности на информацию является важнейшим элементом всей системы прав и свобод и во многом характеризует степень цивилизованности общества и государства, тот уровень личной свободы, который достигнут в данном обществе и обеспечивается государством. Однако характер теоретического осмысления проблемы обеспечения права личности на информацию отстает не только от существующих потребностей практики, но и от самих происходящих в обществе процессов. Возникающие в последнее время проблемные ситуации во взаимоотношениях государства и средств массовой информации свидетельствуют о наличии серьезных пробелов в законодательстве, регламентирующем эту сферу общественных отношений, а также о недостаточной концептуальной проработке роли государственных органов в механизме реализации права личности на информацию.
В системе государственных органов, призванных обеспечивать и охранять право личности на информацию, органы внутренних дел занимают особое место, которое определяется непосредственной близостью к гражданам, а также совокупностью их полномочий. Их деятельность сопутствует реализации значительной части субъективных прав и свобод личности. Но в настоящее время ни на уровне нормативных актов, ни в специальной литературе не проработаны в достаточной мере вопросы их правоохранительной деятельности, присущие им формы и методы, специальные полномочия в плане обеспечения и охраны права личности на информацию. В силу этого в теории права и государства существует некоторая недооценка роли деятельности органов внутренних дел по обеспечению и охране права личности на информацию, поэтому вполне актуально общетеоретическое научное исследование реализации права личности на информацию применительно к деятельности органов внутренних дел. В этой
5 связи возникают проблемы угрозы безопасности информации, которые возникают в процессе расследования и предупреждения правонарушений несовершеннолетних в ОВД, ведь здесь происходит обмен информации различного уровня и ее нужно не только суметь добыть, но и правильно ею распорядиться, не нарушая при этом фундаментальных прав ребенка.
Это проблема возникает в силу различных обстоятельств, и, прежде всего, объясняется недостатками правовой регламентации, отсутствием единого подхода к вопросам реализации информационных прав ребенка, неприменением отдельных положений законов в области данного вида прав детей и др.
Как известно, в юридической литературе правонарушения в зависимости от степени вреда, наносимого обществу, и характера отношений, на которые они посягают, принято подразделять на преступления и проступки. К последним относятся административные правонарушения, гражданские и дисциплинарные проступки. Причем наиболее общественно опасными (вредными) из них традиционно считаются административные правонарушения.
Административные проступки, конечно, менее опасны, чем преступления. Именно поэтому они влекут не уголовную, а административную ответственность. Между тем, как описывает В.В. Лунеев в своей работе, а с его мнением нельзя не согласиться, административные правонарушения нередко являются формой преступного поведения, а в ряде случаев и сопутствуют преступлениям1. В России ежегодно привлекаются к административной ответственности десятки миллионов граждан, среди которых около 30% составляют лица, не достигшие 18 лет . Вступивший в законную силу с 1 июля 2002 года Кодекс Российской Федерации об административных правонарушениях коренным образом изменил подход по привлечению к административной ответственности несовершеннолетних правонарушителей. Государственная политика в отношении правонарушителей в целом и несовершеннолетних правонарушителей в ча- 1 См.: Лунев В.В.Преступность XX века: мировые, региональные и российские тенденции / В.В. Лунеев - 2-е изд. 2, перераб. и доп. - М: Волтерс Клувер, 2005. 2 См,; Послание Президента Российской Федерации Федеральному Собранию Российской Федерации от 26 мая 2004 года // Российская газета. 2004.27 мая. стности, основывается на принципах гуманизма и презумпции невиновности. Законодатель идет по пути расширения списка оснований освобождения от административной ответственности. То, что лицо является несовершеннолетним, в соответствии с ч. 2 ст. 2.3 КоАП РФ, фактически на практике означает возможность его освобождения от административной ответственности. При этом не учитывается принцип неотвратимости административной ответственности, данное обстоятельство свидетельствует о том, что в реальности не всегда несовершеннолетний правонарушитель отвечает за совершенное им деяние. В то же время, как показывает практика и подтверждается мнением 80% респондентов проведенного социологического исследования, вред от административных правонарушений, совершаемых несовершеннолетними, не меньше, а иногда и больше, чем от административных правонарушений, совершаемых взрослыми лицами.
В данном диссертационном исследовании рассматривается правонарушение как общее понятие, включающее в себя все нарушения закона со стороны несовершеннолетних, и одновременно защита их прав при расследовании и профилактике этих правонарушений, а именно защита прав на информацию и от информации, которая могла бы навредить нравственному и физическому здоровью подростков.
Степень разработанности темы исследования. Многоаспектный характер темы обусловливает необходимость обращения к различным отраслям знаний в области теории прав человека, конституционного права, административного права, философии, истории, социологии, педагогики, криминологии, уголовного права и др. Вопросы, связанные с правами несовершеннолетних на общетеоретическом и отраслевом уровнях, достаточно обстоятельно разработаны в монографических исследованиях и опубликованы в учебниках, сборниках и материалах научных конференций как международного, так и внутригосударственного уровней. В области теории и практики прав человека и гражданина тем или иным фундаментальным аспектам проблемы посвящены труды С.С. Алексеева, С.Н. Братуся, Н.В. Витрука, С.А, Комарова, А.В. Мацко, Н.И. Мату-
7 зова, А.С. Мордовец, B.C. Нарсесянца, И.В. Ростовщикова, В.П.Сальникова, Б.Н.Топорника и многих других авторов. Значительный вклад в исследование вопросов взаимоотношений несовершеннолетних граждан и государства, демократизации правоохранительной системы и соответствующего законодательства, действия права, обеспечения законности в работе государственных органов и должностных лиц, гуманизации и повышения эффективности их правоприменительной и других видов деятельности, прямо влияющих на осуществление человеком своих прав и свобод, внесли: Г.А. Аванесов, B.C. Афанасьев, Х.А. Андриашин, И.Л. Бачило, Н.И. Ветров, А.Ф. Волынский, В.В. Власенков, В.Ы. Григорьев, В.В. Гущин, А.В. Заряев, Н.М. Коршунов, СИ. Кириллов, В.А. Копылов, Б.В. Коробейников, В.П. Лавров, В.Н. Лопатин, Ю.И. Лялунов, С.Я. Лебедев, Ю.П. Новиков, А.С.Прудников, А.С. Подшибякин, В.А. Пожилых, Т.Н. Радько, Е.Р. Российская, СВ. Скрыль, Н.Г. Щурухнов, А.А.Фатьянов, Ю.А. Фисун и другие. При всем богатстве научного материала, касающегося прав и свобод несовершеннолетних, практически во всех трудах исследуются отдельные аспекты рассматриваемых явлений правовой действительности, без комплексного изучения отношений, возникающих при обеспечении их прав на информацию и защиты от вредной для них информации, что, на взгляд диссертанта, несколько обедняет весь спектр теоретического осмысления тенденций и закономерностей функционирования статистики и динамики процесса реализации и обеспечения прав личности в государстве. Требуется дальнейшая проработка и практическое закрепление возникающих отношений при обеспечении прав несовершеннолетних на информацию во всем многообразии их проявлений с учетом реалий правовой действительности, особенно когда эта защита осуществляется органами внутренних дел и субъектами, взаимодействующими с ними для полного и точного расследования правонарушений несовершеннолетних и при их профилактике.
Объектом исследования является комплекс общественных отношений, складывающихся в сфере создания, распространения и потребления информа-
8 ции в неразрывной связи с гарантиями права несовершеннолетних на информацию как неотъемлемого фактора их реальности.
Предметом исследования служат вопросы реализации прав несовершеннолетних на информацию и на защиту информации при расследовании и предупреждении их правонарушений органами внутренними дел, а также субъектами, взаимодействующими с ОВД и обеспечивающими защиту прав несовершеннолетних.
Цель настоящего исследования состоит в теоретическом и прикладном исследовании и обоснованности путей эффективности форм и методов борьбы с нарушениями информационных прав несовершеннолетних в процессе расследования и предупреждения правонарушений органами внутренних дел путем совершенствования деятельности ОВД и деятельности субъектов, взаимодействующих с ОВД.
Для достижения указанной цели ставились следующие задачи: выделить и обосновать исходные теоретико-методологические предпосылки исследования права несовершеннолетнего на все виды информации; рассмотреть сущность, структуру и содержание права несовершеннолетнего на информацию; выявить основные источники угроз безопасности информации в процессе расследования и предупреждения правонарушений несовершеннолетних ОВД; проанализировать основные формы и методы деятельности органов внутренних дел по обеспечению и охране прав несовершеннолетних на информацию, ограждению несовершеннолетних от негативной информации в процессе их деятельности; проанализировать деятельность субъектов, взаимодействующих с ОВД при расследовании и профилактике правонарушений несовершеннолетних, по защите их информационных прав; определить основные направления совершенствования правового регулирования деятельности всех органов, обеспечивающих защиту информацион-
9 ных прав несовершеннолетних на стадиях расследования правонарушений и в процессе их профилактики.
Методологическая и источниковедческая основы исследования. Методологической основой исследования являются общенаучный диалектический метод познания, исторический, системный, комплексный, а также частнонауч-ные методы исследования: исторический, логический, системный, структурно-функциональный, сравнительно-правовой, формально-догматический и др. Применение различных методов в их сочетании позволило осмыслить и раскрыть предмет диссертационного исследования. В ходе работы диссертант использовал положения общей теории прав человека, систем социального управления, общепризнанные нормы международного права, положения теории права и государства, гражданского, уголовного, административного права и других юридических наук. Изучены материалы статей, докладов, посвященных анализу опыта работы различных служб органов внутренних дел по расследованию и профилактике правонарушений несовершеннолетних, а также деятельности различных субъектов, взаимодействующих с ОВД по вышеназванным направлениям.
Теоретическую основу диссертации составили труды отечественных и зарубежных правоведов по проблемам защиты информации, а также ученых по теории права, конституционного, административного, уголовного права, криминологии, науки управления и иных научных дисциплин, относящихся к теме исследования. Кроме этого, в работе использованы научные разработки по философии, социологии, политологии, что позволило избежать узкоспециального подхода к изучаемым проблемам.
Использование указанных способов и приемов познания послужило конечной цели — сведению всех полученных знаний и сделанных на их основе выводов и предложений в системное целое в рамках настоящей работы.
Положения, выносимые на защиту:
1. Защита прав ребенка, признанного отечественным законодателем самостоятельным участником правовых отношений, связана с множеством про-
10 блем теоретического и практического характера. Процессы формирования и сохранности информационных ресурсов в сфере расследования и предупреждения правонарушений несовершеннолетних все еще остаются без достаточной правовой охраны и фактической защиты.
2. Предложенный автором перечень источников угроз информацион ной безопасности при расследовании и предупреждении правонарушений несо вершеннолетних ОВД способствует эффективному развитию правовых основ исследуемой сферы, потому что необходимо четко представлять себе от чего или от кого нужно защищать информацию, имеющую конфиденциальный ха рактер, ставшую известной сотруднику органов внутренних дел или иному субъекту, взаимодействующему в ОВД в процессе расследования и профилак тики правонарушений несовершеннолетних.
3. Обоснование положения о том, что нормы, касающиеся вопросов ре гулирования конфиденциальности информации в процессе профилактики и рас крытия правонарушений несовершеннолетних органами внутренних дел, не систематизированы, и содержатся только в отдельных положениях некоторых федеральных законах. Информационное законодательство в исследуемой об ласти страдает разобщенностью. Для ликвидации этого недостатка требуется кодификация рассматриваемого законодательства в рамках Информационного кодекса РФ с выделением в нем раздела, касающегося прав, интересов ребенка и семьи. По мнению автора, необходимо внести дополнения в положение главы 13 КоАП РФ составом административного правонарушения «Необоснованное истребование сведений, носящих конфиденциальный характер». Также назрела необходимость введения в Уголовный кодекс составов преступлений, связан ных с информацией, данную главу можно было бы назвать «Преступления про тив информационных прав в сферах жизнедеятельности человека и государст ва», в состав которой необходимо отнести все статьи, которые тем или иным образом отражали бы нарушенные права в сфере информации, информацион ных технологий и защиты информации.
Заключение о том, что в нашем государстве еще не сформировалась современная инфраструктура общей информатизации и, в частности, в сфере защиты информации о несовершеннолетнем и его самого от «вредной информации», в процессе расследования и профилактики правонарушений несовершеннолетних органами внутренних дел, способная удовлетворить потребности заинтересованных субъектов на требуемом уровне.
Разработанный автором перечень условий, способствующих неправомерному овладению информацией ограниченного доступа в процессе расследования и предупреждения правонарушений несовершеннолетних органами внутренних дел. Формирование данного перечня является одним из ключевых моментов в создании правовой основы, обеспечивающей защиту информации в исследуемой области.
Предложение о создании единого банка данных о беспризорниках как в каждом регионе, так и на федеральном уровне, который будет единой информационной системой учета всех детей, находящихся в социально-опасной ситуации, так как ведомства, работающие с детьми, имеют только свои специфические сведения.
Научная новизна исследования заключается в том, что впервые на основе нового законодательства Российской Федерации в сфере защиты информации, которое выразилось в принятии ФЗ «Об информации, информационных технологиях и о защите информации» 27.07.2006г., комплексно с позиций различных отраслей права, изучающих противоправную деятельность несовершеннолетних и информационного права исследованы проблемы информационной безопасности в процессе расследования и профилактики правонарушений несовершеннолетних органами внутренних дел, а также субъектов, взаимодействующих с ОВД в решении совместно поставленных целей. На основе анализа нормативных актов и правоприменительной практики проведено исследование системы информации, используемой в производстве по делам об административных правонарушениях, уголовных преступлениях, классифицированы и описаны различные виды информации, входящие в эту систему. Автор теоретически обосновал основные направления совершенствования защиты инфор-
12 мации в процессе расследования и предупреждения правонарушений несовершеннолетних, сформулировал предложения о внесении некоторых дополнений в КоАП, в информационное законодательство, в нормативно-правовую базу, регулирующие общественные отношения в сфере обеспечения защиты прав и интересов несовершеннолетнего как особой категории населения нашей страны.
Теоретическая и практическая значимость результатов исследования. В соответствии с поставленными целями и задачами диссертационного исследования все выводы и предложения могут быть использованы при совершенствовании действующего законодательства, регулирующего механизмы защиты информации, носящей конфиденциальный характер, при расследовании и профилактике правонарушений несовершеннолетних органами внутренних дел, а также при разработке новых нормативно-правовых актов, относящихся к данной сфере.
Автор предлагает свой взгляд на угрозы информационной безопасности и источники этих угроз при расследовании и профилактике правонарушений несовершеннолетних.
Диссертант предлагает дополнить новым составом главу 13 КоАП РФ «Административные правонарушения в области связи и информации», а также ввести главу в УК РФ, отнести в нее все статьи, которые тем или иным образом отражали бы нарушенные права в сфере информации, информационных технологий и защиты информации, в настоящее время они разбросаны по различным главам УК РФ.
Автор предлагает внести некоторые изменения и дополнения в отдельные федеральные законы, которые хотя бы частично затрагивают права несовершеннолетнего на информацию, защиту от «вредной» для него информации и защиту информации, которая стала известна сотрудникам органов внутренних дел и субъектам, взаимодействующим с ОВД в процессе профилактики и расследования правонарушений несовершеннолетних. Помимо этого предложены нормативно-правовые акты в целях систематизации законодательства о защите
13 информационных прав ребенка. В комплексе все это позволит определенным образом повысить уровень обеспечения защиты информации в деятельности ОВД и взаимодействующих с ними органов при предупреждении и расследовании правонарушений несовершеннолетних.
Теоретические и практические выводы диссертационного исследования, его содержательная часть могут быть использованы в системе высшего профессионального образования юридического профиля, повышения квалификации сотрудников правоохранительных органов и специалистов в области обеспечения защиты информационных прав ребенка.
Эмпирическую базу исследования составили анализ изучения результатов экспертного опроса 83 сотрудников органов внутренних дел (из которых 50 инспекторов ПДН) Воронежской области, статистические данные, материалы социологических исследований, опубликованные в открытой печати, а также публикации в средствах массовой информации.
Апробация работы и внедрение результатов исследования. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на кафедре конституционного права и административного права Воронежского института МВД России, на практических занятиях с адъюнктами очной формы обучения, на IV Всероссийской научно-практической конференции «Охрана, безопасность и связь» (г. Воронеж, 2004 г.), на Всероссийской научно-практической конференции курсантов, слушателей, студентов, адъюнктов и соискателей (юридические дисциплины) (г. Воронеж, 2004 г.), на Всероссийской научно-практической конференции «Охрана, безопасность и связь» (г. Воронеж, 2005 г.), на Всероссийской научно-практической конференции курсантов, слушателей, студентов, адъюнктов и соискателей (юридические дисциплины) (г. Воронеж, 2006 г.).
Материалы диссертационного исследования опубликованы в 10 научных статьях, 2 из которых размещены в «Сборнике научных статей юридической клиники Воронежского института МВД России», 1 из них опубликована в ведущем рецензируемом журнале, входящем в Перечень ВАК Минобразования и науки России «Наука - производству», в одном учебном пособии «Правовые
14 основы информационной безопасности», общий объем публикаций составил 12,6 п.л. Разработанные на основе диссертационного исследования методические рекомендации внедрены в практическую деятельность ПДН ГУВД Воронежской области, а также в учебный процесс Воронежского института МВД России.
Структура исследования. Диссертация состоит из введения, двух глав (включающих 6 параграфов), заключения, списка использованной литературы и приложения.
Полиморфизм белков молока
На основании данных различных исследователей доказано, что asl-Cn имеет девять генетических вариантов (Formaggioni et al., 1999), обнаруженных у В. taurus (А, В, С, D, F, G и Н), В grunniens (Eyak) (Grosclaude et al., 1974, 1976 ) и В javanicus (Еваїї) (Bell et al., 1981). Наиболее распространенный вариант aSl-Cn (B-вариант) состоит из 199 аминокислотных осадков с общей молекулярной массой 23614 дальтон (Mercier et al.,1971; Grosclaude et al., 1973). Он присутствует у всех пород с частотой 90-100%, и только у некоторых пород, таких как джерсейская, гернсейская и нормандская, его частота несколько меньше (75-85%) (Grosclaude et al., 1976), однако, у шведской голштинской породы значительную частоту имеет С-вариант (Lunden, et al., 1997). У зебу и яков С-вариант преобладает над В-вариантом (Grosclaude et al., 1976).
Этот казеин является семейством белков, состоящим из вариантов 2, 3, 4 и 6 с одинаковой аминокислотной последовательностью, но с разным числом фосфатных групп (13, 12, 11 и 10, соответственно). Известны четыре аллельных варианта для aS2-Cn: А, В, С и D. Они найдены у В taurus (А, В, D), В indicus (А, В) и В. grunniens (С) (Formaggioni et al., 1999). Наиболее распространенный вариант - otS2-CnA, состоит из 207 аминокислотных остатков с общей молекулярной массой от 25150 до 25390 дальтон в зависимости от числа фосфатных групп (Brignon et al., 1977).
Этот белок состоит из 209 аминокислотных остатков с общей молекулярной массой 23983 дальтон (Ribadeau-Dumas et al., 1972; Grosclaude et al.,1973 ). Его полиморфизм имеет сложный характер из-за его высокой генетической вариабельности и наличия большого числа не охарактеризованных или мало изученных вариантов. Согласно литературным данным А1 и А2 являются наиболее распространенными вариантами. Вариант В также широко распространен, но как правило, его частота ниже по сравнению с А1- и А2-вариантами. Нормандская и джерсейская породы имеют наиболее высокую частоту Р-казеина В (30-45%). Вариант С по сравнению с В-вариантом менее распространен и никогда не встречается у яков и зебу (Formaggioni et al., 1999).
Среди кластера казеиновых генов наиболее изучен ген каппа-казеина (Alexander et al., 1988; Leveziel et. al., 1988; Rogne et al., 1998; Городецкий и др., 1987; Капелинская и др., 1989; Кириленко и др., 1995). Семейство каппа-казеинов состоит из одного основного компонента со свободными углеводными группами и нескольких минорных гликозилированных компонентов с одинаковой аминокислотной последовательностью, но различающихся по характеру распределения и числу углеводных групп (MacKinlay & Wake, 1965). Все фракции казеинов расщепляются химозином: специфический сайт расщепления расположен между Phe (105) и Met (106). Первым этапом процесса коагуляции молока является это расщепление. С филогенетической точки зрения, очевидно, что все другие казенны произошли от одного общего предка (по наличию высокого уровня гомологии их последовательностей), однако, каппа-казеин резко отличается от них и сходен с у-фибриногеном крови (Jolles et al., 1978). Каппа-казеин был последним из молочных белков, для которого был обнаружен полиморфизм (Formaggioni et al„ 1999).
Полиморфизм каппа-казеина был открыт одновременно несколькими учеными (Neelin, 1964; Schmidt, 1964; Woychik, 1965). В основе белкового полиморфизма каппа-казеина лежит генетический полиморфизм последовательности гена каппа-казеина. Все аминокислотные замены в последовательности белка обусловлены нуклеотидными заменами в соответствующей кодирующей белок последовательности ДНК. Несколько других примеров полиморфизма были найдены авторами в некодирующих участках гена.
Ген каппа-казеина имеет размер 13 т.п.н. и состоит из 5 экзонов общей длиной 850 п.н. и 4-х интронов. Большая часть белок-кодирующей последовательности находится в одном большом экзоне IV. Информацию о 5 -нетранслируемой регуляторной последовательности содержит первый экзон. Второй и третий экзоны кодируют соответственно лидерный пептид и 11 кодонов N-конца белка. 5 -нетранслируемая область содержит несколько функционально-значимых последовательностей: ТАТА-бокс, СААТ-бокс, последовательность, сходную с опознаваемой фактором трансляции АР-1, и пурин-богатую последовательность, напоминающую таковую у других молочных белков. Другие регуляторные последовательности найдены в интроне перед экзоном IV, в частности последовательность АС(АТ)іо(АС)6(АТ)2(АС)зТС(АТ)4, облегчающую формирование z-конформации ДНК (Alexander et al., 1988).
Длина цепи каппа-казеина составляет около 169 аминокислот с молекулярной массой 19007. Локус каппа-казеина относится к синтенной группе U15 и находится на хромосоме 6. Гены расположены в следующем порядке: aSl-Cn , p-Cn , aS2-Cn , к-Cn. (Threadgile & Womack, 1990). Все четыре казеиновых гена находятся в тесном сцеплении, занимая участок ДНК общей протяжённостью 200 т.п.н. Генетическая детерминация полиморфизма каппа-казеина была установлена Grosclaude с соавторами (1965, 1972), и впервые ген (В-вариант) был секвенирован в 1973 г. (Mercier et al., 1973).
Методы изучения полиморфизма гена каппа-казеина
Первые работы по изучению биохимического полиморфизма белков молока, в которых было показано их аллельное разнообразие, были выполнены с применением методов крахмального и полиакриламидного гель - электрофореза и изоэлектрофокусирования (Grosclaude et al., 1972). Электрофоретический анализ полиморфизма белков молока прост и удобен, позволяет в короткое время тестировать большое число образцов, доступен для выполнения в любой биохимической лаборатории. Самым эффективным, быстрым и надежным являлся метод изоэлектрического фокусирования, предложенный Seibert В. с соавторами (1987) и Bech A.M., Kristiansen K.R., (1990). Однако использовать полученные данные в практической селекции было невозможно, поскольку материалом для определения генотипа служило только молоко. Анализы можно было проводить только у коров при достижении возраста первой лактации. Тестирование молодняка с его помощью вообще невозможно. Другими сломами, типирование животных с использованием белков молока электрофоретическим методом строго обусловлено полом, поэтому генотипирование быков проводилось на основании множественных анализов проб молока женских предков и потомков и требовало около 5-6 лет. Цена и промежуток времени, необходимые для анализа быка-производителя, делали его непрактичным для использования в программах по увеличению частоты желательных аллелей в стадах животных.
В этом отношении наиболее перспективны исследования непосредственно на уровне геномной ДНК животных, в частности, по полиморфизму длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). Новыми методами на основе ДНК анализа, включая ПЦР-ПДРФ, возможно определить генотип животных независимо от пола и возраста (Medrano& Aguilar-Cordova, 1990; Denicourt et al., 1990).
Анализ ПДРФ нашел широкое применение в выявлении различных вариантов генов. Он выполняется как в сочетании с Саузерн-блот анализом, так и с ПЦР-анализом.
Для выполнения анализа ПДРФ необходимы ферменты, способные разрезать ДНК в специфических участках связывания - так называемые рестрикционные эндонуклеазы типа И. Аллели гена каппа-казеина А и В различаются присутствием или отсутствием участков распознавания для рестрикционных ферментов -рестриктаз. Они были идентифицированы с помощью метода ПДРФ путем использования двух рестрикционных эндонуклеаз Hindlll и Taql (Leveziel et al., 1988). Некоторые изменения были введены в этот протокол (Denicourt et al., 1990; Chikuni et al., 1991; Pinder, et al., 1991; Velmala, et al., 1993; Kaminski& Figiel, 1993; Сулимова и др., 1991).
Метод ПДРФ позволяет определять аллельные варианты гена независимо от пола и возраста животных, но первоначальный метод анализа с помощью блот-гибридизации трудоемок, требует применения радиоактивной метки, дорогостоящих реактивов и специального оборудования. Все это ограничивает сферу применения этого метода специально оборудованными лабораториями.
Огромное влияние на процесс генотипирования племенных животных и, особенно, быков-производителей оказала разработка полимеразной цепной реакции (ПЦР).
ПЦР - это осуществляемая in vitro специфическая амплификация нуклеиновых кислот, инициируемая синтетическими олигонуклеотидными праймерами (затравки, амплимеры). Метод разработан Saiki R.K. с соавторами (1985). Каждый цикл ПЦР состоит из тепловой денатурации ДНК (разделение двухцепочечной ДНК на одиночные цепи), ее отжига с праймером (соединение праймеров с комплементарными последовательностями) и удлинения цепи, т.е. достройка двухцепочечных последовательностей, заключенных между праймерами, до двухцепочечных ДНК-полимеразой (элонгации). Смена этих этапов проводится простым изменением температур.
К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке два синтетических олигонуклеотида - праймера размером около 25 нуклеотидов, каждый из которых комплементарен одному из 3 - концов антипараллельных цепей целевого сегмента ДНК. Праймеры в ПЦР служат начальными пунктами (затравками) синтеза ДНК термостабильной Taq-полимеразой, которая в присутствии ионов Mg2+ катализирует синтез новой цепи ДНК из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов в направлении 5 -3 (Saiki et al., 1988; Зиновьева и др., 2001). Поскольку праймеры гибридизуются с обеими цепями ДНК, то как нативная последовательность, так и синтезируемые продукты ПЦР могут служить матрицами в последующих циклах репликации. Вследствие этого последовательности, присутствующие в образце в минимальном количестве (одна или несколько копий) и не поддающиеся обнаружению никакими другими методами, легко выявляются с помощью ПЦР.
ДНК подвергают термической денатурации, а затем в процессе отжига (ренатурации) происходит эффективная гибридизация олигонуклеотидов-праймеров с комплементарными последовательностями на разных цепях ДНК. После этого добавляются ДНК-полимераза, дезоксирибо-нуклеотидтрифосфаты и осуществляется реакция полимеризации вторых цепей, инициируемая на праймерах (первый цикл). Реакция останавливается, и ДНК снова денатурируется прогреванием. В процессе охлаждения праймеры, находящиеся в избытке, вновь эффективно гибридизуются, но не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными цепями. Внесение в систему ДНК-полимеразы инициирует второй цикл полимеразной реакции.
ДНК-полимераза выделена из Thermus aquaticus. У этого фермента частота ошибок при считывании достигает 1/10000 нуклеотидов. Этой точности достаточно для того, чтобы возникающие при репликации последовательности-мишени ошибки не создавали особых проблем. Многократное повторение описанной процедуры позволяет провести 30 и более циклов ферментативного удлинения праймеров. В процессе реакции эффективно амплифицируется только та последовательность ДНК, которая задана олигонуклеотидами-праймерами.
При прохождении ПЦР температура является различной для каждого этапа. Денатурация происходит при температуре 90 - 95С, отжиг - 40-65С и удлинение праймеров происходит при 72С. Начальный нагрев происходит при 95С и длится 5 мин. Он обеспечивает полную денатурацию всех молекул ДНК в образце, и последующая денатурация в каждом цикле амплификации будет занимать меньше времени.
Проведение ПЦР для амплификации гена каппа-казеина
При изучении полиморфизма гена каппа-казеина амплифицировали фрагмент экзона 4 этого гена, размером 228 п.н. Для этого использовали смесь праймеров SGO и SGE (см. таб. 3).
Амплификацию с этими праймерами проводили в термоциклере фирмы «MJ Research» (США) "РТС-100" или в амплификаторе "Amply 4L" фирмы "BioCom" (Россия) в следующем режиме: 1-й цикл - предварительная денатурация - 2 мин при 95С ; циклы 2-34 - денатурация - 30 сек при 95С , отжиг праймеров 40 сек при 53-55С, синтез 30 сек при 72С; последний цикл - заключительный синтез - 72С в течении 7 мин. Количество циклов амплификации - 35.
В ряде случаев (например, для образцов ДНК якутского скота) для типирования аллельных вариантов гена CSN3 был использован также метод аллель-специфичной ПЦР с помощью набора «GenePak к-казеин А/В PCR test» («Isogene», Москва). Условия ПЦР были аналогичны описанным выше за исключением некоторых изменений: время и температура отжига и синтеза составляли 60 сек, 63С и 60 сек, 74С соответственно.
Во избежание загрязнения помещения продуктами амплификации их анализ проводили в комнате для проведения электрофореза. Результат ПЦР оценивали по электрофоретической подвижности амплификата в 2%-ном агарозном геле (120 В, 40 мин) в присутствии бромистого этидия.
Типирование аллелей А и В гена CSN3 проводили после рестрикции продуктов амплификации, полученных с помощью ПЦР с праймерами SGO и SGE. Рестрикцию проводили в стандартных условиях с применением рестриктаз Hinfi. и Taq\ (фирмы «Fermentas», Литва). Продукт амплификации, размером 228 п.н., инкубировали с рестриктазами Hinfl и Taql в течении 2 ч. при 37С и 65С соответственно. Число и длину полученных фрагментов рестрикции определяли электрофоретически в 6%-ном полиакриламидном геле с напряжением 120В и током 20-30 мА в течение 50-60 мин. В качестве маркера молекулярных масс использовали Mspl-фрагменты плазмиды pBR322. Для удобства генотипирования животных продукты рестрикции двух нуклеаз наносили в соседние лунки геля.
После электрофореза гели окрашивали бромистым этидием в течение 20 мин и затем фотографировали под УФ-светом.
Аллельные варианты гена каппа-казеина определяли по наличию или отсутствию сайтов рестрикции для указанных рестриктаз. Физическая карта аллельных вариантов амплифицируемого фрагмента экзона 4 гена каппа-казеина представлена на рис. 1.
На основе числа и размера фрагментов, полученных после рестрикции (в соответствии с наличием или отсутствием сайтов рестрикции) определяли генотип животных при использовании каждой рестриктазы согласно рис.1. Другими словами при использовании рестриктазы Hinjl наличие двух фрагментов размером 135 и 93 п.н. указывает на аллель А, в то время как наличие одного фрагмента размером 228 п.н. указывает на аллель В. При использовании рестриктазы Taq\ наличие двух фрагментов размером 128 и 100 п.н. указывает на аллель В, а наличие одного фрагмента размером 228 п.н. указывает на аллель А. Наличие трёх фрагментов при использовании любой из указанных рестриктаз соответствует наличию обоих аллелей А и В у животного. Ясно, что размер фрагментов зависит от используемой рестриктазы.
При типировании А- и 5-аллельных вариантов гена CSN3 методом аллель специфичной ПЦР рестрикция продуктов амплификации не проводится. После амплификации с использованием набора «GenePak к-казеин А/В PCR test» («Isogene», Москва) продукты ПЦР наносили на 2%-ный агарозный гель (в присутствии бромистого этидия) и определяли генотип животных на основе электрофоретических данных непосредственно. В качестве маркера молекулярных масс был использован маркер М50 («Isogene», Москва). Согласно прописи изготовителя наличие трех фрагментов размером 250, 174 и 122 п.н. указывает на генотип АВ, наличие двух фрагментов размером 250 и 174 п.н. или 250 и 122п.н. указывают на ВВ и Ак генотипы соответственно
Метод ISSR-PCR применяли с использованием праймеров (AG)9C и (GA)9C к микросателлитным локусам (ТС)П и (СТ)П как участков отжига праймеров. Амплификацию проводили в следующем режиме: начальная денатурация - 2 мин при 94-95 С, денатурация 30 сек при 94С , отжиг 30 сек при 55С, синтез 2 мин при 72С. Финальный синтез 7-Ю минут при 72С. Количество циклов амплификации - 35-37. Надо отметить, что при ISSR-анализе праймеры (AG C и (GA)QC были использованы отдельно в каждой реакции, т.е. в реакции использовался один праймер. Фракционирование продуктов амплификации проводили в 2%-ом агарозном геле с использованием в качестве маркера молекулярных масс GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus (MBI Fermentas) с напряжением 120 В в течение 100-110 мин. После электрофореза гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали в коротковолновом УФ-свете. Размер и количество фрагментов в полученных ISSR-ампликонах определяли с использованием программы «Onedscan». С помощью программы «Excel» были созданы бинарные матрицы, в которых наличие и отсутствие каждого фрагмента в паттерне животных каждой породы отмечены цифрами 1 и 0 соответственно.
Характеристика исследуемых популяций по числу и частотам встречаемости А G-ISSR-фрагментов
Исследуемые выборки пород КРС и монгольских яков различались по числу и частотам встречаемости фрагментов. Некоторые фрагменты встречались во всех исследованных выборках, хотя и с разными частотами. К ним относятся фрагменты: 4, 5, 6, 9, 10, 11, 12, 20, 21, 23 и 28. Фрагмент 15 присутствует с высокой частотой (0,700 -1,00) у всех исследованных пород КРС, но отсутствует у яков. У монгольских яков не выявлены также фрагменты 1, 3, 7, 8, 13, 14, 17, 18, 22,25 и 31. Некоторые из них являются редкими и для КРС и присутствуют только у одной (фрагменты 13 и 25 - норвежская красная), двух (фрагменты: 1- якутская и Хариана, 17 - норвежская красная и ярославская) или трех (фрагменты 18 -калмыцкая, бестужевская, норвежская красная) пород. Фрагменты 13 и 25 являются породоспецифичными для норвежского красного скота, но, к сожалению, они представлены в данной породе с недостаточно высокой частотой (0,1 и 0,233 соответственно) и потому не могут служить эффективными породоспецифичными маркерами.
Обращает на себя внимание тот факт, что профили частот фрагментов у разных пород имеют сходный характер (рис. 8).
Особенно четко это прослеживается на отдельных группах пород. Нами были сгруппированы породы турано-монгольского корня (подвид Bos tautus turano-mongolicus: якутская, калмыцкая и монгольская) и яки (рис.9а), зебувидные породы (Bos indicus: Тарпаркер, Хариана и Сахивал) (рис. 9Ь) и породы, имеющие фризские корни (голштино-фризская, новозеландская фризская и черно-пёстрая) (рис.9с). Две последние группы сформированы по остаточному принципу: в 4-ю группу включены две российские породы, для которых не прослеживаются общие корни, и нормандская, в 5-ю - норвежская красная, Н Дама и Монбельярд.
Изменения частот фрагментов в зависимости от их длины в сравниваемых породах КРС в значительной мере имеют сходный характер (рис. 9а-9е).
Уровень сходства по профилям частот AG-ISSR-фрагментов в турано-монгольской группе пород (без учета яков) достигает 65%. Яки заметно отличаются по профилю распределения частот фрагментов. Это относится, в первую очередь, к фрагментам средней длины (от 540 до 890 п.н., фрагменты 10-19) и фрагменту 5 (1300 п.н.), частота которого у всех пород КРС (кроме черно-пестрой) выше в 1,5-2 раза (от 0,793 до 1,0), чем у монгольского яка (0,455).
В группе зебувидных пород КРС (рис. 9Ь) уровень сходства профилей частот фрагментов составляет около 58%. Следует напомнить, что размеры выборок животных этой группы по сравнению с другими группами небольшой. Возможно, при увеличении размера выборок уровень синхронности в распределении частот фрагментов в этой группе пород также бы увеличился.
В группе фризских пород (рис. 9с) уровень сходства распределения частот фрагментов составляет около 64%. Более всего различаются частоты длинных фрагментов (1100 - 2400 п.н., фрагменты 1-7). Высокий уровень сходства профилей частот фрагментов в этой группе пород, как и в первой группе, вполне объясним общим происхождением, наличием родственных связей и указывает на слабую подразделенность данных пород.
В четвертой группе уровень сходства профилей частот фрагментов составляет около 55%, и, наконец в пятой группе уровень сходства составляет около 48%. В наибольшей степени в 5-й группе отличается от остальных норвежская красная. Случайный характер формирования вполне объясняет более низкий уровень синхронности в последних двух группах по сравнению с предыдущими. Скорее удивляет тот факт, что сходство профилей распределения частот фрагментов столь велико.
Породы КРС. и яков отличаются друг от друга по общему (наблюдаемому) числу фрагментов и среднему числу фрагментов на особь (таб.8). Наибольшее число тестируемых фрагментов в AG-ISSR-спектрах было выявлено у норвежской красной породы (26), наименьшее - у Н Дама и новозеландской фризской (16). Интересно отметить, что все российские аборигенные породы характеризуются высоким общим содержанием фрагментов в AG-ISSR-спектрах (23-25 фрагментов) и по этому параметру значительно превосходят зарубежные породы (общее число фрагментов 16-20). Надо полагать, что это отражает высокий уровень генетического разнообразия российских аборигенных пород. Только норвежская красная порода превосходит российские породы по данному признаку.
Наибольшее среднее число фрагментов на особь (16,500±0,287) было отмечено у якутской породы. По этому параметру она превосходит все другие исследованные породы с высоким уровнем достоверности (0.0001 р 0.029). Другие российские аборигенные породы также имеют высокие значения этого параметра: ярославская - 15,206±0,211, бестужевская - 14,702±0,383, калмыцкая -14,236±0,336. Наименьшее среднее число фрагментов на особь (12,047±0,394) было найдено у черно-пестрой породы, а также у новозеландской фризской (12,828±0,553) и нормандской (12,208±0,605) пород, которые недостоверно отличались от чёрно-пёстрой породы по этому параметру (р 0.097 и р 0.401 соответственно). Самое низкое среднее число фрагментов принадлежит якам (11,242± 0,622) и достоверно отличается от большинства пород КРС, за исключением чёрно-пёстрой (р 0.118), нормандской (р 0.134) и сахивал (р 0.091) (см. приложение таб. I).
