Введение к работе
Актуальность проблемы. Химический синтез фрагментов нуклеиновых кислот относится к числу важнейших проблем биоорганической химии. Синтетические олигодезоксирибонуклеотида сегодня стали универсальными инструментами для решения широкого круга задач молекулярной биологии, генетической инженерии, биотехнологии. Поэтому разработка эффективных методов синтеза, выделения и очистки олигонуклэотидов привлекает внимание широкого круга исследователей. Известен ряд методов синтеза олигонуклеоткдоа: фосфодиэфирный, фосфотриэфирный, фосфитамидный и гидрофосфорильный (Н-фосфонатный). Исторически первый фосфодиэфирный метод имел целый ряд недостатков, куда прежде всего следует отнести низкие выходы и утомительную процедуру очистки интермедиатов, и в настоящее время не используется для синтеза олигонуклеоткдов. Фосфотриэфирный, фосфитамидный и Н-фосфонатный метода активноприменяются в практике слигонуклеотид-ного синтеза, причем каждый из этих методов имеет свои специфические- особенности, которые обуславливают выбор исследователем того или иного метода синтеза. Фосфитамидннй метод является предпочтительным при синтезе протяженных фрагментов ДНК. Н-фосфонатный метод незаменим при получении широкого спектра аналогов олкгоиуклеотидов с модифицированными меянуклеотидными фосфатными группами. Фосфотриэфирный метод, в его классическом исполнении, уступал фосфитамкднсму и К-фссфснатному в скорости образования мекнуклэотидной связи, однако он имеет ряд привлекательных черт. Это простота получения и стабильность мономеров, высокая надеп-ность. Кроко того, фосфотриэфирный метод в отличие от фосфит-амидясго и К-фосфотагного, которые используются только в твердофазном варианте, в одинаковой степени эффективно работает как в растворе, так и на полимерных носителях. Таким образом, дальнейшее соверпэнствовапие фосфотриэфирнсго метода представляется нам весьма актуальной задачей.
Цель работы. Настоящая работа является частью исследований в области химического синтеза олигонуклеотидоЕ, проводимых з лабораторій биогашенарил генов Института биоорганической химии им. Н.М.Шемякина АН СССР. Цель работы заключалась в создании новой высокоэффективной модификации фосфстриэфирного метода синтеза олигонуклаотйдоз с использованием внутримолекулярного 0-нукпзо-фильного катализа, а таете в разработке эффективного способа полного деблокирования получаемых олкгодэзокскрибонуклеэтидов
Научная новизна и фактическая ценность работы. Показано, что
использование повыз: фосфатзашитных груш, являющихся производными Н-окиси пиридина и лутидпна, которые одновременно выполняют роль внутримолекулярного 0-нуклеофильного катализатора, приводе к резкому увеличеіпш скорости образования межнуклеотиднсЯ фосфотш--афирной связи, а также позволяет снизить уровень протекания побочных реакций. Применение 0-нуклеофильшх каталитическихфосфатзащит-isa групп позволило существенно повысить эффективность фосфотри-эфирного метода синтеза олигонуклоотидоз и довести скорость послод-нэго (в его твердофазном исполнении) до скорости, обеспечиваемой наиболее распространенным в настоящее время фосфятамидным методом. Разработанная методология щригодва для работы с большинством современных автоматических синтезаторов.
Разработан таюке эффективный способ полного удаления защитных групп с синтетических олигонуклеотидов.
Практическая ценность разработанных методов была продемонстрирована на примере услвЕного синтеза большого числа олигонуклеотидов, представляющих собой фрагменты генов ряда пептидов и белков и регуляторних участков ДНК, а также праймеры для установления первичной структуры нуклеиновых кислот.
Структура диссертации. Диссертация состоит . из введения, литературного обсора (глава I), обсуждения результатов (глава II), экспериментальной части (глава III), вывода и списка цитируемой литературы.
