Содержание к диссертации
Список нестандартный сокращений I. ВВЕДЕНИЕ
И. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
«Агрегация в твердофазном пептидном синтезе»
Введение к работе
Принцип ТФПС
Проблемы ТФПС
Конформации полипептидных цепей
П. Способы обнаружения и методы изучения агрегации в ТФПС
II. 1. Аналитические методы косвенного обнаружения агрегации пептидилполимера
II.2. Неспецифические аналитические методы, косвенно и ретроспективно свидетельствующие о наступлении агрегации
П.З. Физико-химические методы, косвенно регистрирующие агрегацию в реальном масштабе времени
П.4. Физико-химические методы, детектирующие коллапс ПП
II. 5. Физико-химические методы, дающие прямую информацию о структуре агрегатов ПП (идентифицирующие Р-складчатую структуру)
Ш. Методы подавления агрегации пептидилполимера страницы 6
III. 1. Оптимизация свойств полимерной матрицы 26
Ш.2. Изменение условий протекания реакций деблою.. аания и конденсаций 32
4III.2.A. Влияние природы растворителей и их смесей на агрегацию 32
Ш.2.Б. Хаотропные добавки 41
Ш.2.В. Влияние температуры 44
Ш.З. Влияние замены стандартных защитных групп боковой цепи аминокислот на альтернативные 46
Ш.4. Блокирование H-Na - связей основной полипептидной цепи 49
III. 5. Оптимизация ключевых химических стадий ТФПС и другие неспецифические для агрегации воздействия на ПП 56
IV. Прогнозирование априори «трудных» для синтеза участков аминокислотных последовательностей 60
Таблица I . 62
III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 73
I. Свеллографический метод 74
П. Признаки агрегации, регистрируемые свеллографическим методом: 76 Ш. Синтез фрагмента 125-145 а-субъединицы ацетилхолинового рецептора 80
IV. Синтез фрагмента 65-74 ацилпереносящего белка 83 V. Свеллографический метод как инструмент исследования разнообразных аспектов явления агрегации 87 VI. Оценка предрасположенности аминокислот к агрегации с применением подхода «гость-хозяин» 89 VQ. Степень агрегации AD как универсальный количественный критерий интенсивности агрегации 93 \ТД. Корреляция значений ADe с другими параметрами,
5 характеризующими предрасположенность аминокислот к образованию
Р-складчатой структуры 96
IV. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 99
Приборы и материалы 99
Методики 101 V. ВЫВОДЫ 126 VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК НЕСТАНДАРТНЫХ СОКРАЩЕНИЙ PS (1%DVB) TG (PEG-PS)
ОМРОА
Ви'ОН «MAGIC.MIX» твердофазный синтез твердофазный пептидный синтез сополимер стирола с 1% дивинилбензола тентагель(полиэтиленгликоль-полистирол) пептидилполимер (-оксиметил)-фенилацетил- (-оксиметил)-феноксиацетил- диметилформамид трет-бутиловый спирт
2,2,2-трифторэтанол хлористый метилен тетрагидрофуран диметилсульфоксид гексаметилфосфорный триамид
1,1,1,3,3,3 -гексафтор-2-пропанол N-метилпирролидон N-метилморфолин триметилфосфат диизопропилэтиламин
1% Triton Х-100, 2М этилен карбонат в смеси DMF/NMP/DCM (1/1/1) диметиламинопиридин
1 -гидроксибензтриазол
2-(Ш-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3,-тетраметилуроний- HOAT PyBOP ACP (65-74) vy-Pro
ОлигоАІа Dmob- Tmob- гексафторфосфат дициклогексилкарбодиимид
К-[(диметиламино)-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-Ь]пиридин-1- ил метил єн]-N-метилметанамин N-оксида гексафторфосфата гидроксиазобензтриазол бензотриазол-1 -ил-окси-трис(пирролидин)фосфоний гексафторфосфат этиленкарбонат трифторуксусная кислота
1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен пиперидин пиридин фрагмент 65-74 ацилпереносящего белка псевдопролин тонкослойная хроматография высокоэффективная жидкостная хроматография олигоаланиновая последовательность N, N-диметилпропилен мочевина этилоксиметил-фенилтиометил-метилоксиметил-бензилоксиметил-2-гидрокси-4-метоксибензил-2,4-диметоксибензил-2,4,6-триметоксибензил-
8 В тексте диссертации также использованы типовые сокращения, рекомендованные
Объединенной Комиссией по биохимической номенклатуре Международного общества чистой и прикладной химии и Международного биохимического общества.
I. ВВЕДЕНИЕ
Целью белкового и пептидного синтеза является получение чистых соединений хорошо известной структуры. Существует две фундаментальные стратегии для синтеза этих соединений: известный с начала прошлого века синтез в растворе («классический») и пошаговый твердофазный пептидный синтез (ТФПС), появившийся значительно позднее -в 1962 и приобретший большую популярность ввиду своей технологичности и высокой эффективности. Однако как для «классического», іак и для ТФПС однозначный синтез произвольной аминокислотной последовательности до сих пор остается одной из самых главных проблем. Это связано с существованием синтетических сложностей, зависящих от аминокислотной последовательности (так называемые "трудные" пептиды).
Причиной этих проблем является межмолекулярная ассоциация пептидных цепей (аналогичная проблеме нерастворимости в «классическом» варианте) внутри полимерной матрицы по типу частичной Р-складчатой структуры или агрегация, в результате которой происходит резкое сжатие пептидилполимера и значительное уменьшение выхода реакций на стадии конденсации и деблокирования. Несмотря на неослабевающий интерес к этому явлению в ТФПС со стороны пептидных химиков, ряд проблем в данной области сохраняют свою остроту. Это, в первую очередь, проблема создания универсального неинвазивного метода детектирования агрегации в реальном масштабе времени ТФПС. Вторая фундаментальная проблема - это прогнозирование агрегации реальных пептидов в условиях ТФПС.
Настоящая работа посвящена изучению агрегации пептидилполимера с использованием свеллографического мониторинга. Метод был разработан в Филиале института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова и позволяет регистрировать изменение объема пептидилполимера в ходе синтеза.
