Введение к работе
Актуальность теми диссертации. Цитохром Р-450 (Р-450) является
терминальной оксндазой п мої'іооксіїгеїіазиоГі системе, которая широко распространена п природе и участвует в детоксикації» ксенобиотиков, биосинтезе стероидных гормонов, простагландшюв, ленкотрнснов, желчных кислот и витаминов группы D3 Значимость процессов трансформации этих соединений ставит его в один ряд с такими гемопротендами, как гемоглобин и многлобин, каталаза и пероксидаза.
Развитие в последние годы микробиологического способа получения белка с использованием в качестве продуцента клеток дрожжей и бактерий позволяет нарабатывать в больших масштабах ферменты монооксигеназиой системы. D связи с этим большие надежды возлагаются также на использование Р-450 для контроля за загрязнением окружающей среды, окисления химических соединении, используемых в производстве пищевых продуктов, и синтеза новых лекарств.
Особенный интерес представляет исследование Р-450-зависимых ферментов, участвующих в биосинтезе стероидных гормонов, поскольку это позволяет выяснить молекулярные основы ряда тяжелых наследственных заболеваний, связанных с нарушением гормонального гомеостаза и открывает перспективу их' пренаталыюй диагностики. К настоящему времени имеется информация о взаимосвязи структуры и функций Р-450: определены С-концевон гем-связываюшин пептид, установлены предположительные области связывания стероидных субстратов, а также N-концевой фрагмент, выполняющий роль "якоря" в лнпндной мембране (Nelson D.R., 1988; Gotoh О., 1992). Однако, до сих пор остается дискуссионным ряд вопросов: какова общая схема организации иитохромов Р-450 в мембране, какова природа взаимодействия между белками-партнераміі вовлеченными п стероидогенез, чем обусловлена субстратная специфичность?
Связь работы с крупными научными программами. темами.
Диссертационная работа выполнялась в- рамках плановой темы Института
биоорганической химии ЛИ Беларуси "Исследование молекулярных механизмов и
структурных основ функционирования мопооксигеназных систем с участием Р-450"
(№ гос. регистрации 19941428) ив рамках Международного сотрудничества с
Институтом Молекулярной Биологии п Тайване, а также представляет собой
логическое продолжение структурно-функциональных 'исследований
стероидгидроксилируюших ферментных систем, проводимых в НБОХ АНБ.
Нель и задачи исследования. Основная задача работы - изучение'молекулпрной организации цитохрома Р-150с21 (Р-450с21) в растворе и в составе лнпндной мембраны, а также установление структурно-функциональных взаимоотношений между отдельными компонентами митохондриальной и микросомальней мопооксигеназных систем клеток коры надпочечников.
2 Научная новизна полученных результатов. Впервые показано, что
адренодоксинредуктаза стимулнрует как 17а-, так и 21-гндроксилазные активности
микросом коры надпочечников быка, в то время как цитохром b5 ингибпруст их как в
присутствии адренодоксинредуктазы, так и в ее отсутствие. Установлено, что
ограниченный трипсшюлнз Р-450с21 как в мембране, так и в растворе приводит к
образованию двух полнпептндных фрагментов с молекулярными массами 25 и 29 кДа,
которые жестко связаны с мембраной. Зарегистрировано уменьшение ферментативной
активности и частичный переход Р-450с21 в форму с максимумом поглощения при 420
им после проведения ограниченного трипеннолнза. Осуществлена гетерологнческая
экспрессия Р-450с21 человека в клетках бактерии Escherichia coli (Е. coli) и разработан
метод выделения и очистки 21-гндроксилазы из бактериальных мембран с помощью
металло-аффиннон хроматографии.
Практическая значимость полученных результатнії. Установленные структурно-функциональные взаимоотношения в ряду Р-450-завнснмих монооксигеназ являются основой для понимания действия сложных, многокомпонентных систем на молекулярном уровне, а также тонких механизмов регуляции процессов биосинтеза стсрондних гормонов. Создание на базе полученных результатов простих шунтированных систем, содержащих ыитохондриальные и микросомальные моноокенгеназы и их вспомогательные белки, открывает возможность их практического использования для биосинтеза физиологически активных соединений.
Экономическая значимость полученных результатоп. Подходы, применяемые для гетерологической экспрессии и очистки Р-450с21, могут быть также использованы при выделении других лабильных белков из биомассы различных микроорганизмов и тканей. Полученные стерондгндроксилирующие ферменты могут использоваться при создании биокатализаторов для получения стероидных гормонов и их аналогов. Основные положения диссертации, выносимые на зашиту.
-
Изучение взаимоотношений мнкросомальных и митохондриальных систем гидрокенлирования стероидов локализованных в коре надпочечников быка.
-
Разработка высокоэффективного метода выделения и очистки до гомогенного состояния Р-450с21 из коры надпочечников быка.
-
Установление физико-химических, спектральных и каталитических характеристик Р-450с21 из надпочечников быка.
-
Исследование иммунохимических свойств 21-гндроксмлазы.
-
Определение топологии Р-450с21 в липидной мембране с использованием ограниченного прйтеолнза и иммунохимических подходов.
-
Осуществление гетерологической экспрессии Р-450с21 человека в клетках Е. coli.
7. Разработка метода очистки Р-450с2|, экспрессированного о Е. coll с
использованием металло-аффніпюй хроматографии, и изучение физико-химических свойств очищенного белка.
Личный вклад соискателя. Результаты по исследованию взаимоотношений мнкросомальных и мигохондрнальных систем гидроксшшровзння стероидов и очистке Р-450с21 получены лично автором диссертации. В изучении влияния ограниченного трнпсинолнза на ферментативные и спектральные свойства Р-450с21 принимала участие инженер С.А. Былинская. В разработке метода гетерологической экспрессии 21-гидроксилазы и ее очистки из бактериальных мембран оказывал помощь научный сотрудник, кандидат химических наук В.М. Гузов. Кроме того, п постановке темы диссертационного исследования и обсуждении полученных результатов принимал участие главный научный сотрудник, доктор химических наук С.Л. Усапов.
Апробации результатов диссертации. Материалы диссертации доложены на 7-ой Международной конференции "Цнтохром Р-450: биохимия и биофизика", Москва (1991 г.), 8-ой Международной конференции "Цнтохром Р-450: биохимия, биофизика и молекулярная биология", Португалия (1993 г.), 9-ом Международном симпозиуме "Микросомы її окисление лекарств", Израиль, Иерусалим, (1992 г.). .
Опубликопаииость результатов. Основные результаты диссертационной работы изложены в 3-х статьях, 1 сборнике, 3-х тезисах конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, экспериментальной части, материалов и методов, списка цитируемой литературы и приложения. Работа изложена на 150 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка и 11 таблиц. Библиография включает 254 наименования.
Похожие диссертации на Молекулярная организация и структурно-функциональная характеристика природного и рекомбинантного цитохрома Р-450с21
