Нуклеозиды, модифицированные периленом и (фенилэтинил)пиренами по 2`-положению: синтез и спектральные свойства в составе флуоресцентных олигонуклеотидных зондов Астахова Ирина Владимировна

Содержание к диссертации

Список сокращений 6

Введение 8

Нуклеозиды, модифицированные по сахару флуоресцентными полициклическими углеводородами и другими метками: синтез и свойства в составе олигонуклеотидов

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 10

7. Аналоги нуклеозидов, модифицированные 1-шірсіінлметнльноії группой 12

1. Аналоги нуклсозидов, модифицированные через амидную, карбаматную и карбамидную связь 17

2. Аналоги нуклсозидов, модифицированные через тиольную группу 33

IV. Функционалнзнрованные производные конформационно-блокированных нуклеиновых
кислот (LNA) 34

V. Аналоги нуклсозидов, модифицированные через трназольную группу 37

Заключение 39

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Синтез 1-, 2- и 4-(фенилэтинил)пиреновых 2'-карбаматных производных
арабиноуридина и амидофосфитных реагентов на их основе; свойства
модифицированных олигонуклеотидов 41

1.1. Синтез 2- и 4-этнннлпиренов 42

1.2. Получение арабинонуклеозидов, меченных 1-, 2- и 4-(феіінлзтшшл)пнренамн через 2'-
карбаматную связь 43

3. Спектральные свойства арабинонуклеозидов, меченных 1-, 2- и 4-(феннлэтинил)пиренами через 2'-карбаматную связь 46

4. Синтез и свойства олигонуклеотидов, модифицированных остатками 1-, 2- и 4-(феннлзтііннл)пііренов через 2'-карбаматную связь 48

1. Влияние 1-РЕРу-2'-карбаматной модификации на стабильность дуплексов 50

2. Спектральные свойства модифицированных олигонуклеотидов и дуплексов 51

1.5. Заключение 64

Глава 2. Синтез 1-(фенилэтинил)пиреновых производных уридина и амидофосфитных
реагентов на их основе; спектральные свойства модифицированных
олигонуклеотидов 66

3. Синтез 2'-0-[3(4)-(пирен-1-илэтннил)бензнл]урндинов 66

4. Синтез олигонуклеотидов, модифицированных остатками мета- и пара-1-

(феннлзтіпінл)пиреііов через 2'-0-мстильньш линкер 68

2.3. Спектральные свойства конъюгатов, содержащих мета- и іш/7а-1-(феніілзтіінил)пиреньі,
присоединенные к урндину через 2'-0-метнльный линкер 70

2.4. Заключение 73

Глава 3. Синтез флуоресцентно-меченных 2'-aMHHO-LNA и амидофосфитных реагентов
на их основе; свойства модифицированных олигонуклеотидов 74

3.1. Синтез 2'-ІУ-(періілен-3-ііл)метнл- и 2 ^У-(пернлен-3-нл)карбоішл-2'-амшіо-ІЛЧА и
амидофосфитных реагентов на их основе; свойства модифицированных
олигонуклеотидов 74

5. Синтез олигонуклеотидов, содержащих 2'-Л'^,-(пернлен-3-ил)метил- и 2'-7У-(пернлсн-3-ил^арбоннл-З'-амнно-ІЛЧА 76

6. Влияние 2'-iV-(nepiLrieii-3-iLii)MeTiui- и 2'-ЛГ-(пернлсн-3-нл)карбоннл-2'-амино-1ЛЧА на стабильность дуплексов 76

7. Своііства конъюгатов, содержащих 2'-Л'-(пернлен-3-нл)метил-2^,-амнно-ЫЧА в качестве акцептора энергии для 2'-ЛЧпнрен-1-нл)метил-2'-амнно-1ЛЧА 79

8. Спектральные свойства in vitro конъюгатов, содержащих 2'-Л^г-(перилен-3-ил)карбоннл-2'-амино-LNA 83

9. Спектральные свойства зонда, модифицированного 2'-/У-(пернлен-3-ил)карбонил-2'-амнно-

LNA (эксперименты в клеточной культуре) 87

3.1.6 Заключение 89

3.2. Синтез 2'-Л^г-(фешілзтинііл)шіренметил- и 2'-7У-(фенилзтиннл)піірснкарбоннл- 2'-aMiino-LNA
и амидофосфитных реагента на их основе (флуорофор присоединен к LNA через арильную
группу); свойства модифицированных олигонуклеотидов 90

3.2.1. Синтез модифицированных олигонуклеотидов, содержащих 2'-N-
(феішлзтшшл)пііреиметил- и 2'-/У-(феннлзтиннл)пнренкарбоішл-2'-амино-ІЛЧА 91

3.2.2. Влияние 2'-ІУ-(феніілзтшінл)шіренметил- и 2'-Л'-(феннлэтинил)пнренкарбоннл-2'-амнно-
LNA на стабильность дуплексов 92

3.2.3. Спектральные свойства 2'-Л'-(фснилэтинил)пнренметил- и 2'-N-
(феішлзтнішл)пиренкарбоннл-2'-амино-ІЖА. в составе олигонуклеотидов и
дуплексов 94

3.2.4. Заключение 96

3.3. Синтез длинноволновых красителей - 2'-ЛЦфеіііілзтнннл)пнренкарбоннл- 2'-амино-КЧА - и
амидофосфитных реагентов на их основе (флуорофор присоединен к LNA через пиреноильную

группу); свойства модифицированных ол игоиуклсо гидов 97

3.3.1. Синтез модифицированных олигонуклеотидов, содержащих 2'-N-
(фeIIIIЛЭTIlIIИл)пIIpeнкapбoнIIЛ-2'-aмIIнo-LNA 100

3.3.2. Влияние 2'-7V-(^|)eni^3THinui)nHpeHKap6oniw-2'-aMiiiio-LNA на стабильность
дуплексов 101

3.3.3. Спектральные и фотофизические свойства 2'-ІУ-(фенилзтшіил)пиреіікарбоиил-2'-амино-
LNA в составе олигонуклеотидов 105

10. Спектральные и фотофизичсскис свойства моно-PEPyc-LNA в составе олигонуклеотидов >. 105

11. Спектральные и фотофизические свойства бис-PEPyc-LNA в составе олигонуклеотидов 107

12. Спектральные и фотофизические свойства трнс-PEPyc-LNA в составе олигонуклеотидов 109

3.3.3.4. Спектральные свойства дуплексов, содержащих PEPyc-LNA в двух комплементарных
цепях 113

3.3.4. Заключение 115

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава Э1. Синтез и введение в олигонуклеотиды фуоресцентно-меченных

производных арабиноуридина 116

Материалы и оборудование 116

Растворители 116

Реактивы 116

Оборудование 117

Методы 118

13. Синтез 2- и 4-(фенилэтинил)пиренов 119

14. Синтез 1-, 2- и 4-(фенилэтинил)пиреновых 2'-карбаматных производных арабиноуридина, амидофосфитных реагентов на их основе; получение модифицированных олигонуклеотидов 124

Рис. Э1-2-Э1-8. НМВС- и HMQC-ЯМР спектры модифицированных нуклеозидов 140

Получение модифицированных олигонуклеотидов 148

Таблица Э1. MALDI-TOF MS синтезированных олигонуклеотидов 149

Расчет молярных коэффициентов поглощения и концентрациіі растворов модифицированных

олигонуклеотидов 151

Таблица Э2. Молярные коэффициенты поглощения для 1-, 2- и 4-(фенилэтинил)пиренов 152

Глава Э2. Синтез 2'-0-(1-фенилэтинил)пиреновых производных уридина, амидофосфитных реагентов на их основе и модифицированных

олигонуклеотидов 153

Получение модифицированных олигонуклеотидов 160

Таблица ЭЗ. MALDI-TOF MS синтезированных олигонуклеотидов 161

Глава ЭЗ. Синтез и введение в олигонуклеотиды фуоресцентно-меченных

производных 2'-aMHHO-LNA 162

Материалы и оборудование 162

Растворители 162

Реактивы 162

Оборудование 163

Методы 163

15. Синтез 2'-Л/-(перилен-3-ил)метил- и 2'-Л/-(перилен-3-ил)карбонил-2'-амино-І_МА и амидофосфитных реагентов на их основе 164

16. Синтез 2'-Л/-(фенилэтинил)пиренметил- и 2'-Л/-(фенилэтинил)пиренкарбонил-2'-амино-LNA и амидофосфитных реагентов на их основе 167

17. Синтез моно-, бис- и трис-(фенилэтинил)пиренов, их присоединение по 2'-N-положению г'-амино-LNA и синтез амидофосфитных реагентов на основе полученных

конъюгатов 175

Получение модифицированных олигонуклеотидов 188

Таблица Э4. MALDI-TOF MS синтезированных олигонуклеотидов 189

Таблица Э5. Молярные коэффициенты поглощения флуоресцентных LNA-нуклеотидов 193

Трансфскция клеток 195

Визуализация 195

Приложение 1. Кривые плавления дуплексов олигонуклеотидов, содержащих 2'-(перилен-3-

ил)карбонил-1>1А модификацию 196

Приложение 2. Спектры поглощения и возбуждения модифицированных олигонуклеотидов и

дуплексов 197

Приложение 3. Спектры флуоресценции модифицированных олигонуклеотидов и дуплексов 199

Приложение 4. Спектры КД модифицированных олигонуклеотидов и дуплексов 201

ВЫВОДЫ 205

БЛАГОДАРНОСТИ 206

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 207

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AIBN Ви Bz CDI

DAPI

DIPEA (DIEA)

БМА(ДМА)

DMSO

DMT (Dmt)

EI MS

ESI MS

FITC

Fmoc

FRET

HATU

HBTU

HMBC

HMQC

HRMS

MALDI-TOF

MMTr

2,2'-азодиизобутиронитрил

бутил

бензил

1,1'-карбонилдиимидазол

charge transfer (перенос заряда)

4',6-диамидино-2-фенилиндол

дибензилиденацетон

JV, JV'-дициклогексилкарбодиимид

дихлорметан

2,3-дихлор-5,6-дициан-1,4-бензохинон

7У,ІУ-диизопропилзтиламин

JV, JV-диметилацетамид

диметилформамид

диметилсульфоксид

4,4'-диметокситритил (4,4'-диметокситрифенилметил)

ІУ-(3-Диметиламинопропил)-ІУ'-зтилкарбодиимид

electronic ionization (electron impact) mass-spectrometry

electrospray ionization mass-spectrometry -этил

флуоресцеинизотиоционат

9-флуоренилметилоксикарбонил

fluorescence resonance energy transfer

гексафторфосфат 0-(7-азабензотриазол-1-ил)-Л^^ЛуУ'_гЛ^г'-тетраметилурония

гексафторфосфат 0-(бензотриазол-1-ил)-А^₅Л^,Л'⁷-тетраметилурония

heteronuclear multiple-bond correlation

heteronuclear multiple-quantum coherence

high resolution masspspectrometry

1-имидазолил

locked nucleic acid

matrix assisted laser dessorption ionization, time of flight -метил

4-монометокситритил (4-метокситрифенилметил)

Введение к работе

В последние годы стремительно развивается химия модифицированных нуклеиновых кислот, что в значительной степени вызвано расширением области их практического применения. Они все чаще используются в молекулярной и физико-химической биологии и смежных областях знания. Для исследования взаимодействий различных биомолекул, в том числе нуклеиновых кислот, все более широкое применение находят нерадиоизотопные люминесцентные метки. Их предел детекции на современном оборудовании сравним с таковым для радиоизотпных меток, и, кроме того, они обладают рядом преимуществ (неограниченная стабильность, возможность автоматизации процедур модификации и детекции, возможность определения в режиме реального времени и др.).

До недавнего времени модифицированные флуоресцентные метки редко использовались в качестве зондов для исследований нуклеиновых кислот, что во многом было связано с трудоемкостью синтеза и отсутствием стабильных конъюгатов красителей с НК. Создание химического автоматизированного синтеза НК подтолкнуло дальнейшее развитие химии модифицированных олиго- и полинуклеотидов - в настоящее время химические и ферментативные методы их синтеза разработаны в такой степени, что путем их комбинирования в короткие сроки могут быть получены фрагменты ДНК любой длины и практически любого состава. При этом возможно направленное введение меток в заданные положения синтезируемых нуклеотидных последовательностей.

Ранее в качестве люминесцентных меток для НК использовались в основном гидрофильные ксантеновые красители (флуоресцеин, родамин и др.). Их флуоресценция в водных растворах зависит от рзависит от полярности микроокружения. Более перспективными для непосредственной детекции гибридизации оказались полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), характеризующиеся стабильностью в условиях автоматизированного олигонуклеотидного синтеза, высокими молярными коэффициентами поглощения и квантовыми выходами флуоресценции. Кроме того, в водных растворах флуоресценция ПАУ в составе НК сильно зависит от ближайшего пространственного окружения, так как полициклические ароматические углеводороды способны к нековалентным взаимодействиям с НК. Например, ПАУ способны интеркалировать между парами оснований или связываться в бороздки двойной спирали ДНК. Их участие в стэкинг-взаимодействиях подтверждается увеличением стабильности дуплексов и изменением спектров флуоресценции. ПАУ могут образовать эксиплексы (сокращ. excited complex -возбужденный комплекс) с гетероциклическими основаниями НК. Помимо этого при

сближении двух остатков ПАУ на расстояние ~ 3,5 А происходит образование эксимера (сокращ. excited dimer - возбужденный димер). Интеркаляция в двойную спираль ДНК, образование эксимеров и эксиплексов вносят существенные изменения в спектры флуоресценции конъюгатов ПАУ с нуклеиновыми кислотами, что делает ПАУ ценным инструментом для изучения изменений пространственной структуры НК в ходе гибридизации с образованием дуплексов и триплексов, взаимодействия с белками, пептидами и смешанными биополимерами. Систему я-сопряжения ПАУ легко расширить путем химической функционализации, что может привести к синтезу соединений с совершенно другими флуоресцентными свойствами, т. е. к новым красителям.

Среди ПАУ, использующихся для детекции взаимодействий НК, лидирующую позицию, бесспорно, занимает пирен — тетрациклический ароматический углеводород. Пирен характеризуется большим временем жизни возбужденного состояния (до нескольких сотен микросекунд в зависимости от окружения и полярности растворителя). В последние годы его все более активно используют для модификации как основания нуклеотида, так и различных положений фуранозного кольца.

Другим ПАУ, обладающим интересными спектральными свойствами, является перилен - пентациклический ароматический углеводород, характеризующийся высоким квантовым выходом флуоресценции, фотостабилыюстыо и длинноволновым сдвигом спектров поглощения и флуоресценции по сравнению с пиреном. Последнее свойство является особенно интересным, так как открывает возможность использования биомолекул, меченных периленом, для экспериментов in vivo.

Диссертация посвящена совершенствованию флуоресцентных меток — производных пирена и исследованию флуоресцентных свойств периленовой метки в ДНК. Получены три класса флуоресцентных реагентов для амидофосфитного автоматического твердофазного синтеза на основе а/?абг/ноуридин-2'-карбаматов, уридина и LNAQocked nucleic acid)-нуклеозидов, содержащих различные (фенилэтинил)пирены и перилен, присоединенные по положению 2 сахара (2'-положению нуклеозида). Эти реагенты позволяют получить олигонуклеотиды, при гибридизации которых с НК, красители с улучшенными по сравнению с пиреном спектральными характеристиками располагаются в большой или малой бороздке дуплексов. Целью работы был синтез олигонуклеотидных зондов с помощью данных реагентов и изучение спектральных свойств полученных конъюгатов.

Литературный обзор посвящен рассмотрению публикаций, в которых нуклеозиды модифицировали ПАУ и другими метками по сахару.

Похожие диссертации на Нуклеозиды, модифицированные периленом и (фенилэтинил)пиренами по 2`-положению: синтез и спектральные свойства в составе флуоресцентных олигонуклеотидных зондов

Флуоресцентные 5-алкинил-2''-дезоксиуридины: синтез, биологическая активность и спектральные свойства в составе ДНКСкоробогатый Михаил Валерьевич

Синтез модифицированных фосфо-, гликолипидов, липопептидов и изучение их свойств в составе искусственных мембранСебякин Юрий Львович

Синтез O- и S-гликозилдиглицеридов и изучение их свойств в составе модельных мембранДубовская, Светлана Игоревна

Синтез дейтеромеченных липидов с простой и сложной эфирной связью и изучение их свойств в составе мембранЧудиков, Михаил Васильевич

Синтез глико- и фосфолипидов, содержащих сульфгидрильные группы, и изучение их физико-химических свойств в составе липосомЛюбешкин, Александр Викторович

Модифицированные олигонуклеотиды, содержащие химически активные группы в 2'-положении углеводного фрагмента, и получение конъюгатов на их основеЗацепин Тимофей Сергеевич

Синтез аналогов тимидина, модифицированных по 3'-положению [Электронный ресурс]Серегин Кирилл Викторович

Синтез аналогов тимидина, модифицированных по 3`-положениюСерегин Кирилл Викторович

Синтез 14бета-гидроксипроизводных ряда эстрана с боковой цепью в положении С-17Карамян, Сюзанна Хачиковна

Синтез, свойства и биологическая активность аминоакридиновСувейздис, Ян Иванович