Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9
1.1 Хитина и хитозан - биогенные элиситоры 9
1.2 Хитин и хитозан: химическое строение и свойства 9
1.3 Взаимодействие хитина с растительным организмом 11
1.4 Взаимодействие хитозана с растительным организмом . 13
1.5 Элиситорная активность хитина и хитозана 14
1.5.1 Ионные потоки 14
1.5.2 Активные формы кислорода и азота 15
1.5.3 Вторичные метаболиты 16
1.5.4 Ферменты 17
1.6 Элиситорная активность хитина и хитозана в отношении грибных заболеваний 18
1.7 Биопрепараты на основе хитина и хитозана в защите растений от грибов 20
1.8 Элиситорная активность хитина и хитозана в отношении вирусных заболеваний 20
1.9 Биологическая активность хитозана, связь с химической структурой 23
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 33
2.1 Материалы и методы 33
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 44
3.1 Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде 44
3.2 Полевые испытания препаратов 46
3.2.1 Биометрические показатели посевов картофеля 46
3.2.2 Микологический анализ почвы 49
3.2.3 Распространённость и развитие заболеваний растений 52
3.2.4 Структура комплекса микромицетов филлосферы 55
3.2.5 Микологический анализ клубней картофеля 58
3.2.6 Продуктивность картофеля и качество урожая 61
3.3 Противовирусная активность хитозана на растениях 65
3.3.1 Противовирусная активность хитозана на растениях фасоли 65
3.3.2 Противовирусная активность хитозана на растениях табака N. tabacum cv. Samsun nn 72
3.3.3 Противовирусная активность хитозана на растениях табака N. tabacum cv. Samsun NN 74
3.3.4 Индукция хитозаном РНК-зависимой РНК- полимеразной активности в изолированных протопластах табака 77
3.3.5 Противовирусная активность МРЗ-белка и РНКазы в комплексе с хитозаном на растениях табака 79
ВЫВОДЫ 85
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 86
- Хитин и хитозан: химическое строение и свойства
- Материалы и методы
- Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде
Введение к работе
Одним из важнейших достижений мирового биотехнологического прогресса в области изыскания новых перспективных веществ за последние годы стало получение, изучение и внедрение в практику биополимеров хитина, хитозана и их производных. Особенности структуры хитозана обуславливают ряд привлекательных свойств этого поликатиона -гипоаллергенность, биодеградируемость, биосовместимость, а также иммуномодулирующие свойства.
Актуальность темы. Метод индуцирования неспецифической устойчивости у растений с помощью хитозановых элиситоров является одним из перспективных способов защиты сельскохозяйственных культр от грибных болезней. Метод основан на индуцировании врождённых защитных механизмов растения. Под действием хитозана происходит фенотипическая иммунокоррекция растений, в результате чего изменяется функционирование растительной ткани, связанное с уровнем экспрессии защитных генов. Такой механизм действия хитозанового элиситора в наименьшей степени влияет на полезную микрофлору агроценоза и обуславливает его экологическую безопасность.
Одной из уникальных биологических активностей хитозана является его способность индуцировать устойчивость у растений к вирусным заболеваниям.
Для хитозана, который является сополимером глюкозамина и N-ацетилглюкозамина, а также в силу специфики его получения характерна структурная неоднородность. Это обстоятельство существенно сказывается на его иммуномодулирующих свойствах, зависящих от особенностей структуры биополимера. До настоящего времени данные о связи между физико-химическими характеристиками хитозана и его биологическими свойствами носят разрозненный и не систематический характер.
Целью настоящей работы являлось изучение свойств низкомолекулярного хитозана и препаратов на его основе как индукторов устойчивости к грибным и вирусным заболеваниям.
Для достижения поставленной цели были определены следующие основные задачи: оценить влияние препарата АгроХит на основе низкомолекулярного хитозана на патогенную и сапротрофную микофлору картофельных посадок; провести сравнительный анализ влияния препарата АгроХит на микоценоз картофельных посадок в сравнении с другими препаратами; оценить влияние физико-химических свойств хитозана на его противовирусную активность в растениях; выявить возможные механизмы противовирусной защиты растений, индуцируемые хитозаном.
Научная новизна работы. Проанализировано влияние препарата на основе низкомолеклярного хитозана на патогенную и сапротрофную микофлору картофельных посадок. Проведён сравнительный анализ влияния элиситорного препарата на основе низкомолекулярного хитозана на микоценоз картофельных посадок в сравнении с препаратами, обладающих другими механаизмами действия. Показано, что в сравнении с биопрепаратом Триходермин и химическими пестицидами, элиситорный препарат на основе хитозана в большей степени влияет на патогенные грибы поражающие наземные части растений картофеля - Phytophthora sp. и Alternaria sp. и наиболее щадящим образом воздействует на непатогенную сапротрофную микрофлору, обнаруживая тем самым наименьший побочный эффект.
Показана способность хитозана индуцировать устойчивость у растений фасоли к заражению вирусом мягкой мозаики фасоли (ВММФ). Установлена молекулярная масса полимера хитозана, обладающая наибольшей противовирусной акивностью.
Проведена оценка влияния молекулярной массы и степени деацетилирования хитозана на его противовирусные свойства в растениях табака при заражении их вирусом табачной мозаики (ВТМ). В изолированных протопластах табака показан, индукцированный хитозаном, синтез белка с молекулярной массой 125-130 кДа, предположительно РНК-зависимой РНК-полимеразы, и усиление данной ферментативной активности. Что позволяет предположить механизм противовирусной защиты растений как хитозан индуцируемое замалчивание генов.
Практическая значимость работы. Предложена оригинальная схема получения низкомолекулярного хитозана в бессолевых условиях для производства препарата АгроХит.
Показано, что элиситорный препарат АгроХит на основе хитозана снижает численность таких грибных вредителей картофеля как Phytophthora, Alternaria и Oospora, одновременно оказывая минимальное воздействие на непатогенную сапротрофную микофлору картофельных посадок. Предложено применять элиситорные препараты на основе хитозана для обработки сельскохозяйственных культур для уменьшения масштабов применения синтетических фунгицидов.
Способность хитозана индуцировать устойчивость у растений к заражению вирусами является предпосылкой к созданию противовирусных препаратов. Выяснение механизмов защиты растений от вирусов позволит осознанно создавать эффективные антивирусные препараты.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах.
7 Структура и объём диссертации. Диссертация содержит введение, обзор литературы, методическую часть, раздел с обсуждением экспериментальных результатов, выводы, список литературы, приложение.
Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и 4 рисунка, библиографию из 125 наименований.
8 Список сокращений:
АГА - N-ацетилглюкозамин
АФК - активные формы кислорода
ВММФ - вирус мягкой мозаики фасоли
ВТМ - вирус табачной мозаики
ГА - глюкозамин
ПААГ - полиакриламидный гель
СА - степень ацетилирования
СД - степень деацетилирования
СП - степень полимеризации сП - сантипуаз
ФААЛ - фенилаланин аммоний лиаза
ЦПМ - цитоплазматитческая мембрана
Ip (Mw/Mn) - индекс полидисперсности MF3 - microbial factor З Mn - среднечисловая молекулярная масса Mv - средневязкостная молекулярная масса Mw - средневесовая молекулярная масса NOD-фактор - nodulating factor
Хитин и хитозан: химическое строение и свойства
Хитин - линейный полисахарид состоящий из остатков N-ацетилглюкозамина связанных Р-1,4 связью (рис.1). Количество сахарных остатков определяет степень полимеризации (СП) хитинового полимера, и может достигать значительной величины - 5000 Форму. и более, что соответствует молекулярной массе 10 порядка 1000 кДа. Подобно целлюлозе хитин является амфифильным и довольно инертным веществом, практически нерастворим в воде, за исключением самых небольших олигомеров со СП до 10. Относительное количество глюкозаминных остатков в молекуле полимера определяет его степень деацетилирования (СД), а доля N-ацетилглюкозаминных остатков его степень ацетилирования (СА). Типичным для хитозана является СА менее 50%.
В присутствии кислот свободные аминогруппы хитозана акцептируют протоны, приобретая положительный заряд, и хитозан образует водорастворимые соли аналогично другим аминам. При этом в первую очередь от степени протонирования его свободных аминогрупп зависит растворимость хитозанового полимера. В среднем, хитозан хорошо растворяется, когда протонированы по крайней мере половина его свободных аминогрупп, то есть когда рН раствора соответствует значению рК полимера. Для образцов хитозана с молекулярной массой 10-100 кДа и СД 80-90% величина рК лежит в районе 6,2-6,5 (рК ГА равно 8,1). С увеличением молекулярной массы и С А хитозана значение рК снижается. Таким образом, для растворения высокомолекулярных образцов с высокой СА требуются более кислые условия, а снижение молекулярной массы и увеличение СД полимера позволяет им растворяться при нейтральном рН. При высоких значениях рН хитозан теряет положительный заряд и выпадает в осадок, за исключением самых небольших олигомеров со СП до 10. На практике при работе с хитозаном предпочтение отдаётся низкомолекулярным формам, поскольку высокомолекулярные образцы при растворении, даже в концентрации меньше 0,1 мг/мл, образуют очень вязкие растворы. Превращение высокомолекулярного хитозана в низкомолекулярный осуществляют путем физической, химической или ферментативной деполимеризации [1,2].
Материалы и методы
Получение низкомолекулярного хитозана. Низкомолекулярный хитозан получали из крабового высокомолекулярного хитозана с помощью ферментативного гидролиза. Для гидролиза использовали хитинолитический комплекс Streptomyces kurssanovii и промышленный ферментный препарат Целловиридин Г20х на основе штамма Trichoderma viride. Деполимеризацию высокомолекулярного хитозана проводили в 0,1-0,2 М Na-ацетатном буфере. При использовании хитинолитического комплекса S. kurssanovii гидролиз хитозана вели при рН 5,4 и температуре 45С, согласно [ПО], при использовании ферментного препарата Целловиридин Г20х гидролиз вели при рН 5,2 и температуре 55С, согласно [1]. Реакцию останавливали кипячением в течение 10 минут. Добавляли NaOH для осаждения хитозана. Полученных образцы низкомолекулярного хитозана диализовали против дистиллированной воды и высушивали лиофильно. Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде.
Получали переосаждённый крабовый высокомолекулярный хитозан. Для этого хитозан растворяли в уксусной кислоте, нейтрализовали кислоту NaOH, диализовали хитозан от солей и избытка щёлочи. К переосаждённому хитозану, растворяя его, добавляли соляную, молочную или уксусную кислоты, до рН 5,2. Для гидролиза использовали ферментный препарат Целловиридин Г20х на основе штамма Т. viride. Деполимеризацию вели при при температуре 55С, согласно [1]. Реакцию останавливали кипячением в течение 10 минут Определение динамической вязкости. Определение динамической вязкости растворов хитозана полученых гидролизом в бессолевой среде проводили на ротационном вискозиметре Брукфильда с цилиндрическим ротором 6/RPM при 30С согласно [114]. Для определения вязкости отбирались аликвоты раствора из реакционной смеси во время гидролиза в различное время. Реакцию останавливали кипячением отобранной аликвоты в течение 10 минут. Степень гидролиза оценивали по падению динамической вязкости в зависимости от времени гидролиза.
Определение степени деацетилирования хитозана. Степень деацетилирования хитозана определяли методом кондуктометрического титрования согласно [1]. Навеску образца хитозана (50-200 мг) растворяли в 100 мл 0,02 М НС1. Полученный раствор титровали 0,1 М NaOH, добавляя по 0,1 мл через каждые 30 секунд, при постоянном перемешивании. Количество щелочи, необходимое для титрования связанной с аминогруппами кислоты, определяли из графика зависимости электропроводности раствора от объёма щёлочи. Расчет СД вели по формуле:
СД=МхУМР+(Мх-Мхт) VN= 203VN/P+42 VN, где Мх - молекулярная масса звена хитина; Мхт - молекулярная масса звена хитозана; V -объём NaOH, необходимый для титрования связанной с аминогруппами кислоты, определяемая из графика, мл; N - нормальность NaOH; р - навеска хитозана, мг. Определение средневязкостной молекулярной массы хитозана. Средневязкостную молекулярную массу хитозана рассчитывали из уравнения Марка-Хаувинка для хитозанов с различной степенью деацетилирования согласно [115]: Л = к-Ма, где л — характеристическая вязкость, дл/г к и а - константы, рассчитывающиеся по формулам: к=1,64-10-30-СД14 а = -1,02-10-2-СД+1,82 СД - степень деацетилирования, %
Измерение вязкости растворов хитозана проводили в вискозиметре Уббелоде с диаметром капилляра 0,5 мм при температуре 30С. В качестве растворителя использовали 0,2 М раствор уксусной кислоты и 0,1 М раствор ацетата натрия в соотношении 1:1 по объёму. В основе метода лежит измерение времени истечения раствора полимера с последовательно уменьшающейся концентрацией его в растворе [116]. Величины удельной (гуд) и приведённой (гпр) вязкости растворов хитозана рассчитывали по формулам:
Получение низкомолекулярного хитозана в бессолевой среде
Ферментативную деполимеризацию высокомолекулярного хитозана (молекулярная масса 200-800 кДа) обычно осуществляют в 0,2-0,3 М натрий-ацетатных или натрий-лактатных буферных системах при рН 4,0-6,0. Это приводит к наличию в конечном продукте значительных количеств солей, удаление которых в масштабах промышленного производства требует длительного диализа и сопровождается существенными потерями наиболее низкомолекулярных фракций целевого продукта. Технология бессолевого гидролиза предполагает предварительное переосаждение исходного хитозана, которое позволяет избежать потерь вещества по причине его высокой молекулярной массы с последующим растворением в расчётном количестве кислоты до оптимального для ферментативной деполимеризации значения рН. Такая технологическая схема позволяет избавиться от присутствия солей во время гидролиза, а следовательно и в конечном продукте, и получать хитозан не требующий дополнительной очистки, с заданным противоионом - ацетатным, лактатным, хлоргидратным и другими. Для гидролиза высокомолекулярного хитозана нами использовался промышленный ферментный препарат Целловиридин Г20х на основе гидролитического комплекса микромицета Trichoderma viride. Гидролиз высокомолекулярного 1%-ного хитозана проводили при фермент-субстратном соотношении 1:400, рН 5,2 и температуре 55С. Для гидролиза использовали растворы высокомолекулярного хитозана с противоионами -ацетатным, лактатным и хлоргидратным. Находящийся в реакционной смеси хитозан, как слабое основание, в присутствии противоиона образует слабую буферную систему, позволяющую сохранять заданное рН на протяжении всего времени гидролиза, а подобранное фермент субстратное соотношение не оказывает влияния на кислотность раствора. Степень гидролиза определяли по падению динамической вязкости. Все исходные образцы имели вязкость более 1000 сП. После окончания гидролиза динамическая вязкость образцов падала более чем на два порядка и для образцов в форме ацетата, лактата и хлоргидрата составила 4,9; 5,9 и 7,5 сП соответственно (табл. 1).
Таким образом, показана эффективность деполимеризации хитозана при его гидролизе ферментативным комплексом микромицета Т. viride в бессолевых условиях. Данная технология получения низкомолекулярного хитозана может стать основой для получения препарата АгроХит -регулятора роста и индуктора болезнеустойчивости растений, а также ветеринарных биопрепаратов.
