Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 6-9
ГЛАВА I. ШШЮТОКСИШ. Обзор литературы 10-58
1.1.. Использование антител в качестве векторов
ищуно токсинов 10-12
-
Особенности использования поликлональных антител, их F(ab)2- и Раь-фрагментов . Ю-ІІ
-
Новые возможности, связанные с применением моноклональных антител 12
1.2. Токсины, использующиеся для конъюгации с
антителами 12-18
-
Преимущества токсинов белковой природы . 13-14
-
Структура белковых токсинов 14-15
-
Механизм действия токсинов 15-18
1.3. Методы конъюгации белковых токсинов и анти
тел 18-29
-
Методы конъюгирования целых токсинов и антител 19-25
-
Методы получения конъюгатов, содержащих А-цепь токсинов 25-28
-
Другие способы получения иммунотоксинов 29
1.4. Механизм проникновения внутрь клетки А-це-
пи 29—33
1.5. Изучение действия иммунотоксинов в культу
ре клеток 33-45
I.5.I. Действие ИТ, содержащих антитела к целым
клеткам 39-40
Стр.
-
Цитотоксические свойства ИТ, содержащих поликлональные антитела к антигенам клеточной поверхности 40-43
-
Ингибирующая активность ИТ, содержащих моноклональные антитела к отдельным цепям ig и искусственным антигенам, расположенным на поверхности клеток-мишеней . 43
-
Действие ИТ, содержащих моноклональные антитела к опухолево-специфическим, диф-ференцировочным и другим антигенам . . . 44-45
1.6. Использование иммунотоксинов для ингибиро-
вания опухолевого роста 45-54
1.6.1. Удаление опухолевых клеток из смеси об
работкой ИТ с последующим возвращением
донору 46-48
1.6.2. Действие ИТ на раковые клетки у безтимус-
ных мышей 48-49
1.6.3. Применение ИТ при прямом подавлении роста
опухоли 49-54
-
Модуляция специфического иммунного ответа с помощью иммунотоксина 54-55
-
Что ограничивает эффективность действия иммунотоксинов 56-57
1.9. Заключение 57-58
ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 59-70
2.1. Получение рицина и его А- и В-цепей .... 59-62
Стр.
2.2. Получение препаратов антител для конъю
гации с А-цепыо рицина 62-64
-
Поликлональные антитела к клеткам шеломы Х-63 62
-
Поликлональные антитела к l -цепям igG человека 63
-
Моноклональные антитела к дифференциро-вочному антигену эритробластов мыши ... 64
2.3. Поликлональные антитела к А- и В-цепям
рицина 64-65
2.3.1. Получение иммуносорбентов 65
-
Получеіше конъюгата между А-цепью рицина и антителами 65-66
-
Определение цитотоксических свойств полученных препаратов рицина, его изолированных субъединиц, антител и конъюгатов . . . 66-68
-
Подавление роста клеток в культуре . . . 66-67
-
йнгибирование включения 4С -лейцина в белки, синтезируемые клетками-мишенями . 67-68
-
Подавление роста колоний 68
2.6. Анализ распределения популяции клеток-ми
шеней по клеточному циклу 68-69
-
Ищунофтооресценция 69
-
Бесклеточная белок синтезирующая система
из ретикулоцитов кролика 69-70
ГЛАВА Ш. ПОЛУЧЕНИЕ КОНЫГАТОВ ЇЖШДУ А-ЦЕПЬЮ РИЦИНА И
АНТИТЕЛАМИ 71-85
Стр.
-
Эффективность конъюгирования 71-75
-
Требования к антителам и А-цепи рицина, используемых при конъюгировании с помощью
СІЩІ 75-76
-
Отделение конъюгата от непрореагировавших компонентов при получении препарата иммуно-токсина 76-77
-
Анализ состава конъюгата 77-80
-
Проверка свойств составных частей иммуно-токсина 80-85
-
Выводы 85
ГЛАВА 17. ИЗБИРАТЕЛЬНАЯ ЩТОТОКСМНОСТЬ КОНШГАТОВ
А-ЦЕПИ РИЦИНА И РАЗНЫХ ПРЕПАРАТОВ ПОЛИ-
КЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ 86-103
-
Модельная система: клетки-мишени + иммуно-токсин, содержащий антитела против целых клеток 86-90
-
Цитотоксические свойства конъюгата А-цепи рицина и поликлональных антител к l-цепям.
igG человека 90-91
-
Зависимость активности конъюгата от времени инкубации с клетками-мишенями . . . 91-93
-
Специфичность действия ИТ 93-96
-
Увеличение активности ИТ с помощью различных препаратов, содержащих В-цепь рицина 97-99
Стр.
4.3. Действие ИТ на распределение популяции
клеток-мишеней по клеточному циклу .... 99-102
4.4. Выводы 103
ГЛАВА У. НАПРАВЛЕННАЯ ЭЛИМИНАЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ
ЭРИТРОБЛАСТБЫХ КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ ИММУНО-
ТОКСИНА I04-II2
5.1. Модельная система: опухолевые эритробласт-
ные клетки мыши + коиъюгат А-цепи рицина и
моноклональных антител к дифференцировоч-
ному антигену эритробластов 104-105
-
Получение специфического иммунотоксина . . 105-106
-
Цитотоксические свойства конъюгата
МАЕ-15-Рд I06-II4
5.4. Перспективы использования конъюгатов А-це
пи рицина и антител против дифференциро-
вочного антигена эритробластов 115
5.5. Выводы 116
ЗАКЛЮЧЕНИЕ II6-I22
ВЫВОДА 123-124
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ 125
ЛИТЕРАТУРА 126-137
Введение к работе
Пауль Эрлих был первым, кто указал на возможность использования антител как векторов для направленного транспорта к клеткам фармакологических агентов / I /. Разновидностью такого транспорта является избирательное взаимодействие клеток с антителом, которое связано с токсином. Такие искусственно созданные молекулы получили название иммунотоксинов (ИТ). ИТ -это конъюгаты растительных или бактериальных токсинов с антителами, которые связываются со специфическими рецепторами на поверхности клеток-мишеней. За последнее время достигнуты значительные успехи в создании и применении таких конъюгатов in vitro И in vivo.
Большинство токсинов растительной или бактериальной природы, которые используют для конъюгирования с антителами, содержат одну или несколько связывающих В-субъединиц, отвечающих за взаимодействие токсина с клеткой, и одну ферментативно активную А-цепь, проникающую внутрь клетки и определяющую ци-тотоксичность. Основная задача, которую надо решить при приготовлении ИТ состоит в том, что необходимо заменить В-цепь токсина, реагирующую с поверхностью практически любой клетки, на молекулу антитела, способную реагировать только с определенными клетками-мишенями. Наиболее простой способ решения этой задачи - прямая замена В-цепи на молекулу антитела. В качестве векторов ИТ используют поли- или моноклональные антитела против дифферещировочных и опухолево-специфических антигенов. Характер химической связи между молекулой антитела и А-цепыо в составе конъюгата должен быть подобен связи между А- и В- цепями в нативном токсине.
Основным требованием к способу получения конъюгата является сохранение активностей составных частей иммунотокси-на после конъюгирования. Значительный прогресс в этой области достигнут благодаря использованию в качестве "сшивающего" агента n -сзгкцинимидил-3-/2-пиридилдитРіо/пропионата (СЦЩІ). Способы тестирования активностей антител, А-цепи рицина, анализ качественного состава получаемых конъюгатов с помощью СПДП изложены в Главе Ш.
Наиболее простой модельной системой для изучения цито-токсических свойств иммунотоксинов является система, состоящая из клеток-мишеней + конъюгат, содержащий суммарную фракцию igG из антисыворотки против этих клеток. В данном случае происходит максимально возможное насыщение поверхности клеток ИТ, что позволяет установить максимально возможную активность ИТ. Результаты, полученные при изучении такой системы, содержащей в качестве клеток-мишеней миеломные клетки мыши линии РЗ-Х63. Ад 8.653, изложены в Главе ІУ.
Однако такой конъюгат обладает невысокой избирательностью действия по отношению к другим клеткам. Поэтому для получения более специфичного ИТ использовали аффинно выделенные кроличьи антитела к l -цепям igG человека. Конъюгат таких антител с А-цепью рицина обладает специфическим цитотоксическим действием на опухолевые клетки лимфюмы Беркитта ЕВ-3, несущие на поверхности ig , но не активен для клеток, не несущих специфического антигена. Изучено действие данного ИТ на распределение по клеточному циклу популяции клеток ЕВ-3. Предложен эффективный способ усиления действия полученного ИТ с по- мощью конъюгата, содержащего В-цепь рицина и антитела против igG кролика. Результаты изложены в Главе ІУ.
Во многих случаях опухолевые клетки не несут специфических маркеров. Однако часто на их поверхности имеются дифферен-цировочные антигены. Одним из наиболее изучаемых видов ИТ являются конъюгаты, содержащие антитела к таким антигенам. В данной работе описана модельная система, состоящая из опухолевых эритробластных клеток мыши и конъюгата А-цепи рицина и моноклональных антител против дифференцировочного антигена эритробластов. Этот антиген присутствует на поверхности нормальных и опухолевых эритробластов и ретикулоцитов, но отсутствует у эритроцитов и стволовых кроветворных клеток. Это белок с мол. массой 69 кД. Аналогичный антиген обнаружен и у других млекопитающих, в том числе и человека. Обработка опухолевых клеток in vitro конъюгатом А-цепи рицина и антител против антигена эритробластов эффективно ингибирует синтез белка в этих клетках в культуре клеток и подавляет рост селезеночных колоний in vivo . При этом данный конъюгат обладает высокой специфичностью действия и не оказывает заметного действия на клетки, у которых этот антиген отсутствует, в том числе и на стволовые кроветворные клетки. Результаты этих исследований изложены в Главе У. Впервые показана возможность высокоэффективной элиминации опухолевых эритробластных клеток с помощью ИТ, что составляет практическую ценность данной работы.
Кроме того, ИТ являются эффективным и перспективным инструментом для изучения: а) взаимоотношений различных клеточ- ных популяций; б) поверхностных рецепторов; и в) процессов, связанных с проникновением внутрь клетки различных биологически активных веществ. Освоение методов получения и тестирования активности таких гибридов представляет как научную, так и практическую ценность работы.
![Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс]](/i/i/4283/202634.png "Изучение белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител [Электронный ресурс] Вечканов Евгений Михайлович")
