Введение к работе
Актуальность работы. Направленное конструирование модифицированных олигонуклеотидов с заданными свойствами - одна из перспективных задач биоорганической химии. Создание новых модифицированных олигонуклеотидов необходимо для проведения молекулярно-биологических и медико-биологических фундаментальных исследований, для развития и совершенствования методов ДНК-диагностики наследственных и инфекционных заболеваний, разработки новых высокоизбирательных лекарств. В настоящее время описан широкий круг производных ДНК, модифицированных по гетероциклическим основаниям, сахаро-фосфатному остову, несущих в своем составе метки и ненуклеотидные звенья (Киггеск, 2003; Sacca, 2005).
Особенностью настоящей работы является конструирование потенциально биосовместимых функциональных производных олигомеров с заданными свойствами, к ним относятся: способность встраиваться в мембрану живой клетки, и стабильность в плазме крови и др.
Согласно литературным данным в ряде случаев дополнительные свойства олигонуклеотидам можно придавать введением в структуру молекулы концевых заместителей, например, меток или функциональных групп. В настоящей работе такой прием был использован для получения аминоалкильных и флуоресцентных олигомеров. Кроме того, были синтезированы новые, амфифильные производные олигомеров для создания универсального метода нековалентной фиксации олигонуклеотидов на внешней мембране живых клеток.
Перспективность использования ДНК-мечения поверхности клеток для их
направленной иммобилизации на твердом носителе была показана в работе
{Chandra, 2006). Однако реализация этой идеи ограничена необходимостью
использования небезопасных абиогенных интермедиатов и длительностью
процедуры ДНК-модификации клеток. Поэтому для создания нового способа
быстрой и безопасной для жизнеспособности клеток ассоциации ДНК с
плазматической мембраной в настоящей работе были сконструированы и получены
производные олигонуклеотидов, содержащие концевые остатки стеариновой и
пальмитиновой кислот.
Выбор стратегии введения модификаций в состав олигомеров определяется на основе анализа структуры олигонуклеотидов. В области поиска эффективных ДНК-лекарств актуальной остается проблема быстрой биодеградации фосфодиэфирных фрагментов полинуклеотидов in vivo. Поэтому для антисмысловых олигомеров, действие которых основано на комплементарных взаимодействиях с полинуклеотидной мишенью, был предложен ряд эффективных решений, основанных на введении стабилизирующих модификаций сахаро-фосфатного остова олигомеров. Сегодня одним из наиболее изученных приемов является замена фосфодиэфирных межнуклеотидных связей на тиофосфорильные (Han S., 2000; Dias N.. 2002; Herbert B.S., 2002). Такие тиоолигомеры, хотя и обладают заметной системной токсичностью (Dias, 2002; Han, 2000), однако уже применяются в практике современной медицины. При конструировании биологически активных олигомеров, функциональность которых зависит от их стерической организации, важно учитывать, что введение модификаций может приводить к конформационным искажениям исходной структуры ДНК (Chandra, 2006; King, 2002; Besschetnova, 2005; Besschetnova, 2006, Meyers, 2004; Smirnov, 2000).
Наиболее перспективными для дальнейшего применения в молекулярно-медицинских исследованиях свойствами обладают олигонуклеотиды, содержащие G-квадруплексы - структуры ДНК, состоящие из сложенной вчетверо (вследствие взаимодействия четырех гуанинов), одной молекулы или четырех нитей различных молекул. Чрезвычайно высока биологическая роль G-квадруплексов, так более 40% промоторов в человеческом геноме содержит по крайней мере один квадруплекс (Huppert, 2005; Todd, 2007) а у онкогенов же 69% имеют такие мотивы (Huppert, 2008). Также найдены G-квадруплексные биологически активные аптамеры (олигонуклеотиды, отобранные по сродству к молекулярным или иным мишеням), однако их применение in vivo также ограничено низкой устойчивостью к нуклеазному гидролизу. В настоящей работе для поиска структуры более стабильного функционального G-квадруплексного олигомера была выбрана
стратегия введения в его состав локальных тиофосфорильных связей. В работе был
исследован ТВА (Thrombin binding aptamer -тромбинсвязывающего ДНК-аптамера состава GGTTGGTGTGGTTGG, Griffin, 1993; Padmanabhan, 1996) и его тиоаналоги. Проведение системного анализа влияния тиофосфорильных замен в составе ДНК G-квадруплексов на их конформацию и биологические свойства необходимо при создании новых эффективных лекарств нуклеотидной природы. В связи с этим, нами был проведен анализ термодинамических и биологических свойств тиогомологов ТВА, синтезированных с помощью разработанного нами метода, что позволило выявить ряд закономерностей и найти оптимальные структуры.
Цели и задачи исследования.
Цель настоящей работы состоит в разработке методов конструирования потенциально биосовместимых модифицированных олигонуклеотидов с заданными свойствами на примере жирнокислотных конъюгатов олигомеров и локально тиофосфорилированных аналогов ДНК.
При выполнении данной работы решались следующие задачи:
-оптимизация методов синтеза и очистки жирнокислотных конъюгатов фрагментов ДНК, флуоресцентномеченых олигомеров, локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов, а также олигомеров, содержащих концевые алифатические аминогруппы;
-разработка дизайна и наработка частичных тиоаналогов ТВА;
-сравнительное исследование ТВА и его тиоаналогов по физико-химическим (конформация, термодинамика и др.) и биологическим (антитромбиновые свойства и стабильность в плазме крови, кинетика нуклеазного гидролиза) параметрам.
Научная новизна и практическая значимость.
Оптимизированы методы синтеза и очистки жирнокислотных конъюгатов фрагментов ДНК, флуоресцентномеченых, локально тиофосфорилированных олигонуклеотидов, а также олигомеров, содержащих концевые алифатические аминогруппы. Использование полученных модифицированных олигонуклеотидов стало основой для проведения таких работ, как исследование ДНК-комплексов с
наночастицами никеля. Конъюгаты олигонуклеотидов с остатками стеариновой и пальмитиновой кислот, полученные в настоящей работе, использовались при разработке нового способа нековалентной иммобилизации фрагментов ДНК на поверхности живых клеток.
Для создания эффективных терапевтически значимых структур олигонуклеотидного типа впервые получен ряд аналогов ТВА, содержащих тиофосфорильные замены. Оценены антикоагуляционные свойства полученных аналогов ТВА, изучено влияние локальных тио-модификаций на их структурно-функциональные свойства, в том числе на стабильность в плазме крови и в отношении действия ДНК-нуклеаз. В результате исследования термодинамических параметров олигомеров получена зависимость устойчивости конформации структуры от локализации тиофосфорильной связи. Обнаружено, что модификация в «петлях» стабилизирует конформацию, а в «плоскостях» G-квадруплекса снижает его стабильность. Найден перспективный модифицированный олигонуклеотид (LL11), структура которого изменена только в Т-Т-петлях. Он сохраняет антитромбиновые свойства ТВА, и в то же время обладает большей устойчивостью к биодеградации.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации автором в соавторстве с
коллективом лабораторий опубликовано 6 печатных работ, статьи, каждая из них в
рецензируемых отечественных и международных журналах, рекомендованных
ВАК.
Материалы, включенные в диссертацию, докладывались на всероссийских и
международных конференциях и школах: на «III Международной конференции
"Фундаментальные науки - медицине", Новосибирск; на «XVIII Менделеевский
съезд по общей и прикладной химии», Москва; на «XIV Международной
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва; на
«XV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых
«Ломоносов», Москва; на «Second International Meeting on Quadruplex DNA»,
Louisville; на «Первой международной научной школе Нано-2009», Москва; на
конференции молодых ученых НИИ ФХМ, Москва.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение, выводы, список цитируемой литературы из 136 наименований. Диссертация изложена на 102 страницах, содержит 30 рисунка и 2 таблицы. Материалы и методы.
