Введение к работе
Актуальность проблемы. Флуоресценция используется для визуализации процессов клеточной биологии на различных уровнях, от отдельных молекул до целых организмов. Традиционные методы, основанные на флуоресцентных красителях, часто требуют дополнительной очистки меченых соединений и их инвазивного введения внутрь клетки. Эти ограничения можно преодолеть благодаря использованию зеленого флуоресцирующего белка GFP и его гомологов. При этом присоединение их к интересующим белкам, благодаря их относительно небольшой и компактной структуре, слабо или совершенно не влияет на исходные свойства изучаемых белков. Использование флуоресцирующих белков позволяет вести неинвазивное наблюдение экспрессии репортерных генов, внутриклеточного перемещения белков и динамики биохимических сигналов в живых клетках и организмах. Открытие фотопереключаемых белков существенно расширило возможности применения флуоресцирующих белков в молекулярной и клеточной биологии и явилось основой для разработки микроскопии сверхвысокого разрешения. Одним из фотопереключаемых белков является красный белок asCP (использованный, в частности, для метода RESOLFT, достигающего разрешения 50-100 нм), который обладает способностью обратимого фотопереключения между флуоресцирующей и нефлуоресцирующей формами. Однако механизм фотопереключения (разгорания флуоресценции) asCP и его мутантной формы KFP (kindling fluorescent protein, asCP A143G) с оптимизированными свойствами разгорания всё ещё остаётся невыясненным.
Использование методов, основанных на индуктивно-резонансном переносе энергии (FRET) между двумя флуоресцирующими белками позволило существенно увеличить возможности применения этих белков в качестве маркеров в живых клетках для наблюдения за биологическими механизмами и физиологическими функциями клетки. FRET-биосенсоры на основе флуоресцирующих белков имеют ряд преимуществ по сравнению с другими методами, в которых используется конъюгация с синтетическими красителями. Во-первых, они могут быть сконструированы путем генетических манипуляций и доставлены в клетки с помощью трансфекции и последующей экспрессии; во-вторых, им можно придать сигналы внутриклеточной или тканевой локализации, что позволяет вести наблюдение как за органеллами и отдельными клетками, так и за целыми организмами.
Одним из подходов для скрининга противоопухолевых препаратов in vivo является детекция апоптоза в клетках мишенях. Для визуализации процессов in vivo на уровне одной клетки перспективным объектом является семейство каспаз, а именно, каспаза-3, как один из ключевых ферментов, участвующих в развитии процесса апоптоза в клетке. Белковые сенсоры, в основу которых положен принцип индуктивно-резонансного переноса энергии между двумя красными белками, одним из которых является KFP,
наиболее отвечают задачам увеличения эффективности детекции активности каспазы-3 in vitro и in vivo. Измерение кинетик затухания флуоресценции позволяет решить проблему калибровки сенсора, а использование нефлуоресцирующего акцептора избавляет от спектральной контаминации, т.е. попадания эмиссии донора в канал регистрации акцептора, характерную для стандартной методики измерения по интенсивности флуоресценции. Применение красных флуоресцирующих белков позволяет уменьшить автофлуоресценцию тканей и увеличить проницаемость света вглубь тканей.
Таким образом, изучение и характеристика спектрально-флуоресцентных свойств белка KFP является актуальной задачей при разработке новых методов субдифракционной флуоресцентной микроскопии и создании новых сенсоров для детекции ферментативной активности в живых клетках и организмах.
Цели и задачи работы. Целями настоящей работы было изучение спектральных и физико-химических свойств KFP, а также создание и характеристика FRET-сенсора на его основе для детекции активации каспазы-3 in vivo.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
изучить рН-зависимость флуоресценции и положения максимумов эмиссии, возбуждения и поглощения KFP;
определить влияние рН на эффективность разгорания и тушения KFP;
изучить спектральные свойства и оценить эффективность переноса энергии во FRET-сенсоре на основе двух красных белков;
определить эффективность расщепления конструкции под действием каспазы-3;
Научная новизна. Впервые было показано, что флуоресцентные свойства KFP обусловлены набором конформеров, равновесие между которыми определяется значением рН. Исследована зависимость свойства разгорания и тушения флуоресценции KFP в зависимости от рН. Установлено существование в щелочной области рН двух флуоресцирующих конформеров по-разному реагирующих на действие синего света.
Разработана модель для детекции ферментативной активности каспазы-3 in vitro методом флуоресцентной спектроскопии с временным разрешением. Предлагаемый подход основан на применении красного флуоресцирующего белка TagRFP в качестве донора и хромопротеина KFP в качестве акцептора, в результате чего затухание флуоресценции такой конструкции происходит гораздо быстрее, чем для индивидуального донора. Эффективность переноса энергии в созданной генно-инженерной конструкции составила 51.1%. Методом планарного имиджинга с временным разрешением показана возможность детекции активации апоптоза у животных in vivo. Данная методика позволяет различать флуоресцентные метки с близкими максимумами эмиссии, такие как DsRed2 и TagRFP, что невозможно при использовании обычного метода регистрации по интенсивности.
Практическая значимость. Установленные зависимости разгорания и тушения флуоресценции KFP позволяют расширить применение данного белка в качестве маркера в клеточной и молекулярной биологии, а также в микроскопии сверхвысокого разрешения. Созданная генно-инженерная конструкция на основе двух красных флуоресцирующих белков даёт возможность регистрации ферментативной активности каспазы-3 на клеточном уровне методом флуоресцентной микроскопии с временным разрешением.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (201 ссылка). Диссертация содержит 123 страницы печатного текста, включает 53 рисунка и 5 таблиц.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: V Съезд Российского фотобиологического общества (Пущино, 2008,), XVI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2009), II International symposium Topical problems of biophotonics - 2009 (Nizhny Novgorod - Samara - Nizhny Novgorod, 2009), Школа-конференция Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины 2010 (Москва, 2010), XII International Conference on Laser Applications in Life Sciences 2010 (Oulu, Finland, 2010).
