Введение к работе
з
Актуальность работы. Среди головоногих моллюсков особое промысловое значение имеют кальмары, мышечные ткани которых составляют до 52 %. Около 32 % массы приходится на отходы - печень, пищеварительную систему, гонады и ганглии. Известны технологии переработки внутренних органов кальмаров для получения лечебно-профилактических жиров как БАД к пище (Новгородцева и др., 2007), щелочных и кислых фосфатаз из гонад (Касьяненко и др., 1980; Розенгарт и др., 1993), БАД «Артротин» из хрящевой ткани (Клыч-кова, 2004; Пивненко и др., 2005), БАД «Тинростим» из ганглиев (Эпштейн и др., 1997). Известная технология получения БАД «Тинростим» (ТИ 36-278-05) из ганглиев кальмаров многостадийна, требует больших затрат ацетона, что предъявляет особые требования к организации производства.
Исследования последних лет показали наличие высокой холинэстеразной активности в нервной ткани у различных видов гидробионтов, в том числе кальмаров (Козловская и др., 1990; Jebali et al., 2006; Podolska, Napierska, 2006). Интерес к холинэстеразам (ХЭ) объясняется той ролью, которую играет фермент нервной ткани в быстропротекающих процессах синаптической передачи. Известно использование ХЭ как биохимического реактива при оценке эффективности инсектицидов и высокотоксичных фосфорорганических соединений, а также лекарственных средств (Садыков и др., 1976; Бресткин и др., 1997).
Несмотря на то что ранее фермент ацетилхолинэстераза (АХЭч) из эритроцитов донорской крови человека как биохимический реактив производился в России на нескольких предприятиях, ферменты из органов и тканей гидробионтов, в частности кальмаров, в промышленных масштабах не производятся. Повышенные требования к контролю безопасности производств и охраны окружающей среды привели к разработке ряда ферментных тест-систем с использованием ХЭ для оценки уровня загрязнений, в том числе промышленными и бытовыми ядами (Стойкова и др., 2000; Beljakova et al., 2001). Основываясь на знании различий в физико-химических свойствах БАВ нервной ткани, представляется актуальным создание комплексной технологии переработки нервной
4 ткани головоногих моллюсков для получения БАД «Тинростим» и препарата ХЭ из одного источника в одном технологическом процессе.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явились поиск и характеристика сырьевых источников, а также разработка биотехнологических способов получения фермента холинэстеразы и БАД «Тинростим» из нервной ткани гидробионтов в одном технологическом процессе.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
разработать модифицированный способ получения БАД «Тинростим»;
обосновать использование зрительных ганглиев головоногих моллюсков как сырья для производства ХЭ;
определить рациональные параметры экстракции ХЭ из нервной ткани кальмаров;
обосновать технологию выделения фермента по характеристике конечного продута (термостабильность, субстратная и ингибиторная специфичность);
обосновать технологию получения БАД «Тинростим» и препарата холинэстеразы в одном технологическом цикле.
Научная новизна работы. Определены рациональные параметры хранения и обработки сырья - нервных ганглиев кальмаров. Впервые:
— определена биологическая активность различных по молекулярной
массе белковых фракций БАД «Тинростим» и обоснована модификация метода
его получения;
установлено влияние детергента (тритона Х-100), целлюлолитических и протеолитических ферментов на экстрактивность ХЭ из мороженых и сублимированных ганглиев кальмаров;
определены субстратная и ингибиторная специфичности, термостабильность и электрофоретическая характеристика очищенного фермента ХЭ из ганглиев кальмаров;
из одного вида сырья в одном технологическом процессе выделены и охарактеризованы БАД «Тинростим» и препарат ХЭ;
научно обоснована технология получения ферментного препарата ХЭ из сублимированных ганглиев кальмаров.
Практическая значимость работы. Выполненные исследования послужили основанием для выбора наиболее перспективного источника получения фермента. Разработаны модификация способа получения БАД «Тинростим»; способ заготовки и хранения сырья - сублимированных ганглиев тихоокеанского кальмара; технология получения фермента холинэстеразы, в основу которой положен метод дробного высаливания сульфатом аммония; технологическая схема получения из одного вида сырья в одном технологическом цикле БАД «Тинростим» и препарата ХЭ. Разработана и утверждена нормативная документация на «Препарат фермента пропионил-холинэстеразы» (ТУ № 9289-295-00472012-05). Выпущена опытно-промышленная партия препарата фермента в количестве 10000 ед. Проведена опытно-промышленная проверка препаратов фермента во ФГУП ГосНИИОХТ, которая показала, что они могут быть использованы при разработке аналитических методик определения остаточного количества фосфорорганических соединений и служить основой разработки метода дифференциального определения различных по структуре фосфорорганических соединений в окружающей среде.
Защищаемые положения:
характеристика субстратной и ингибиторной специфичности является показателем пригодности сырья для получения фермента ХЭ;
модификация технологии БАД «Тинростим» на основе ультрафильтрации позволяет сохранить его биологическую активность;
способ получения холинэстеразы, включающий дробное фракционирование, позволяет получить термостабильный, высокочувствительный к ФОС фермент с высокой удельной активностью;
комплексная технология переработки ганглиев кальмаров на основе ограниченного протеолиза, с использованием мембранных технологий обеспечивает получение препарата ХЭ и БАД «Тинростим» в одном технологическом процессе.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на Первой международной научно-технической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2005); на XV ежегодной рабочей встрече North Pacific Marine Science Organization (PICES) (Иокогама, Япония, 2006); на научно-практической конференции «Современное состояние водных биоресурсов», посвященной 70-летию СМ. Коновалова (Владивосток, 2008); на Международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Владивосток, 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 работы.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы (156 наименований, в том числе 56 иностранных). Изложена на 123 стр., иллюстрирована 26 рисунками и 29 таблицами.
Похожие диссертации на Комплексная технология биологически активной добавки к пище "Тинростим" и препарата холинэстеразы из ганглиев кальмаров
