Введение к работе
Ак'туальностъпр^С>лемы
Изучение механизма поддержания стабильности генома является одной из
важнейших проблем в современной биологии Генетический гомеостаз
предопределяет сохранение отобранных форм и успешное наследование полезных признаков организма
Среди процессов, влияющих на стабильность генома в клетках эукариот важное место занимает процесс стабильного хромосомного наследования Дестабилизация хромосом приводит либо к анеуплоидии. то есть изменению числа хромосом в клетке, либо к хромосомным перестройкам и является не только интересным с научной точки зрения феноменом, но и фактором, играющим роль в патологии Например, у человека анеуплоидия является характерным признаком злокачественных новообразований, синдрома Дауна, Кляйнфельтера и других заболеваний с изменением кариотипа (Griffiths, Miller et al. 1993)
Стабильность хромосомного наследования зависит от многих факторов, таких как процессы репликации, рекомбинации, репарации и расхождения хромосом, а также от состояния хроматина, ядерного и цитоплазматического скелета Анализ этих факторов позволяет изучить детали комплексного процесса хромосомного наследования и понять причины дестабилизации хромосом в патологии
Генетический анализ факторов, влияющих на стабильность хромосом, явился плодоворным методом изоляции и изучения цис- и транс-факторов, контролирующих хромсхюмное наследование, а также их взаимодействия между собой в процессе поддержания стабильной хромосомной передачи Однако, для более глубокого изучения процесса, необходимо продолжить исследования, используя молекулярно-биологические, биохимические и цитологические методы В результате такого комплексного анализа мы надеемся получить близкую к реальности модель, отражающую детали механизма поддержания стабильного хромосомного наследования
С точки зрения анализа нерасхождения хромосом, дрожжи сахаромицеты являются удобным экспериментальным организмом Во-первых, дрожжи, в отличие от многих других эукариот, лучше выдерживают анеуплоидию, возникающую в результате ошибок хромосомного наследования Во-вторых, дрожжи совмещают удобства ведения культуры микроорганизма с наличием большинства фундаментальных черт, присущих клеткам Еикагуош Поэтому
детали механизма хромосомной стабильности, изученные в дрожжах, могут иметі непосредственное отношение к клеткам высших эукариот В третьих, в отличие о-высших эукариот, цис-факторы, необходимые для поддержания стабильності хромосом (центромер, область начала репликации и теломер), не толькс функционально определены, но и их иуклеотидиая последовательность известна і изучена К концу 1996 года дрожжи Saccharomyces cerevisiae будут первш эукариотическим организмом, генетическая последовательность которого буде полностью определена. Вообще, дрожжи являются генетически и морфологическі хорошо изученным объектом, что позволяет рассматривать физиологически процессы в клетке как совокупность взаимодействующих генных продуктов, V возможно, в дальнейшем позволит рассматривать клетку как единое целое
К числу недостатков этой экспериментальной системы нужно отнести то факт, что митотические хромосомы дрожжей-сахаромицетов не наблюдаемы световой микроскоп В связи с этим до настоящего времени представляло*: невозможным изучение морфологии дрожжевых хромосом Однако, недавно дл дрожжей-сахаромицетов был адаптирован метод флуоресцентной гибридизации і situ (FISH) и применен для наблюдения отдельных районов дрожжевых хромосої .(Guacei. Hogan et al. 1994) В частности, в этой работе метод FISH используется дл наблюдения нерасхождения центромерных участков сестринских хроматид митозе у мутанта ch!12.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы является дальнейшая характеристика механизм поддержания стабильности хромосом в митозе у дрожжей Мы надеялис получить результаты, раскрывающие некоторые детали и особенности этог механизма Методология работы состоит в отборе и изучении мутанто дефектных в стабильном поддержании хромосом, изучении одного из гено который эти мутации определяют, и изучение функции белка, кодируемого эти геном, с помощью биохимических, генетических и цитологических методов Бы/ поставлены следующие задачи:
1 Характеристика и сравнение фенотипов мутаций, определяющих локус СНІ. 12 в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Изучение гена CHL12, и его последовательности, конструирование штамма, лишенного этого гена, изучение его фенотипа
2 Изучение целостности теломерюв у мутантов М12 в различных
условиях, а также возможности влияния дефектных теломеров в М12 на
стабильность хромосом
-
Скрининг неаллельных мутаций, влияющих на стабильность хромосом у дрожжей, на взаимодействие с геном СНЫ2
-
Изучение поведения клеток штамма, лишенного гена CHL12, в клеточном цикле Определение точки исполнения функции (времени действия) CHL12 в клеточном цикле Сравнение кинетики репликации ДНК у штаммов дикого типа и несущего делецию М12Л с помощью проточного цитометрического анализа синхронизированных культур. Определение наличия репликативных интермедиатов в штамме М12Л.
5 Изучение морфологии клеточного блока с помощью
иммунофлуоресцентного анализа митотического веретена у клеток, несущих
делецию chll2A, а также метода флуоресцентной гибридизации in suu
6 Определение мотивов в пептидной последовательности белка СЫ12
Поиск белков, гомологичных белку СЫ12 в GenBank и других базах данных
Экспрессия части белка Chll2 в E.coh, выделение и аффинная очистка пептида,
получение поликлональных антител Характеристика пептида СЫ12 с помощью
антител к нему. Локализация белка СЫ12 в клетке с помощью непрямой
иммунофлуоресценции
Научная новизна работы
В результате изучения механизма поддержания стабильности хромосом изолирован и охарактеризован новый ген, контролирующий хромосомное наследование у дрожжей S.cerevisiae
Разработан новый тип генетического скрининга, основанный на комбинировании экспресии интересующего гена (пробного гена) на фоне неаллельных мутаций (целевых мутаций), на взаимодействующие с интересующим геном мутанты Такой скрининг специфичен и обнаруживает большее количество взаимодействующих мутантов по сравнению со скринингом на дозовую суп[>ессию
Сконструирована система новых модульных векторов для экспрессии в
дрожжах, которые маркируют экспрессируемый белок пептидной
последовательностью ("тагом"), на которую имеется поликлональная сыворотка
Экспрессия генов проверена с помощью Вестерн-анализа и
иммунофлюоресцентного анализа
Впервые показано, что существует мутант у дрожжей, имеющий дефект в анафазе митоза
Представлена непротиворечащая полученным данным модель, просто тестируемая и позволяющая расширить наши знания о цикле хромосомного наследования уэукариот
Апробация 1>аботы
Материалы диссертации были представлены на Гордоновской кондеренции по эписомам и хромосомной динамике (Gordon Conference: Episomes and Chromosome Dynamics). Бостон, США, 1993 г, EX Международной конференции по биологии дрожжей (International Yeast conference), Сиэттл, США. 1994. Был сделан доклад на коференции "Mid-Atlantic Yeast Conference" в Принстоне, США. 1995 г Работа была представлена на межлабораторном семинаре в Институте цитологии РАН, 1995 г.
Публикации
Материалы диссертации опубликованы в четырех научных статьях.
Объем габоты
Диссертация состоит из Введения, Материалов и методов исследования, Результатов, Выводов и Списка литературы. Общий объем диссертации составляет ПО страниц, содержит 20 рисунков и фотографий и 5 таблиц Список цитируемой литературы содержит 130 ссылок.
Похожие диссертации на Роль гена CHL12 (CTF18) в хромосомном цикле дрожжей Saccharomyces cerevisiae
