Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость Брянцев Антон Леонидович

Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость
<
Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Брянцев Антон Леонидович. Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость : регуляция и функциональная значимость : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.25 Москва, 2003 149 с. РГБ ОД, 61:04-3/378

Содержание к диссертации

ОГЛАВЛЕНИЕ . 2

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 8

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

ГИПЕРТЕРМИЯ 9

ВОЗДЕЙСТВИЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА НА КЛЕТОЧНЫЕ СТРУКТУРЫ И

КОМПАРТМЕНТЫ. ю

Мембраны 10

Цитоскелет 12

Цитозольи органеллы 12

Клеточное ядро 13

ВОЗДЕЙСТВИЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА НА КЛЕТОЧНЫЕ БЕЛКИ 14

Белковые повреждения в ядре 15

Белковые повреждения в цитоплазме 17

БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА 17

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ШАПЕРОНЫ 18

КО-ШАПЕРОНЫ-БЕЛКОВЫЕ МОДУЛЯТОРЫ ШАПЕРОНОВ. 21

КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЕМЕЙСТВ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА 24

Семейство HSP100 24

Семейство HSP90 25

Семейство HSP70 26

Семейство HSP60 21

Семейство малые БТШ (sHSP) 21

БЕЛОК ТЕПЛОВОГО ШОКА Hsp25/27

Структура 29

Олигомеризация 29

Фосфорилирование зо

Биологические функции 34

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ БЕЛКОВОЙ ДЕГРАДАЦИИ 38

ПРОТЕАСОМНАЯ СИСТЕМА ДЕГРАДАЦИИ БЕЛКОВ 40

Внутриклеточная локализация элементов протеасомной системы .41

УЧАСТИЕ БТШ В ДЕГРАДАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ БЕЛКОВ 43

Роль ко-шаперонов в опосредовании протеолиза .45

МОДЕЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ ДЕЙСТВИЯ ТЕПЛОВОГО

ШОКА НА КЛЕТОЧНЫЕ БЕЛКИ IN VIVO .47

ЛЮЦИФЕР АЗА КАК ЭКЗОГЕННЫЙ РЕПОРТЕР ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ

ПОВРЕЖДЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ БЕЛКОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ СТРЕССА 49

ЗЕЛЕНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК - НОВАЯ РЕПОРТЕРНАЯ CHCTEMAsi

ГЛАВА П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 54

МАТЕРИАЛЫ 54

КЛЕТОЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ 54

АНТИТЕЛА , 54

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОНСТРУКЦИИ 56

ХИМИЧЕСКИЕ РЕАГЕНТЫ 56

МЕТОДЫ 57

СОЗДАНИЕ СТРЕССОВЫХ УСЛОВИЙ 57

ОБРАБОТКИ КЛЕТОК ВЕЩЕСТВАМИ, ВЛИЯЮЩИМИ НА

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ HSP25 57

ТРАНСФЕКЦИЯ КЛЕТОК 58

ПОЛУЧЕНИЕЦИТОПЛАСТОВ 59

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КЛЕТОК И ЦИТОПЛАСТОВ 60

РАДИОИЗОТОПНОЕ МЕЧЕНИЕ И ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИЯ. 60

АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕФОЛДИНГА ПОСЛЕ ТЕПЛОВОГО ШОКА 61

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ, ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЕ ФОКУСИРОВАНИЕ И

ИММУНОБЛОТТИНГ. 62

ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНЦИЯ. 63

ТЕСТИРОВАНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ F-АКТИНА 65

КОМПЬЮТЕРНАЯ ОБРАБОТКА ИЗОБРАЖЕНИЙ 65

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ 67

Изменения внутриклеточной локализации Hsp25, вызванные действием

теплового шока и других стрессов 67

Стрессы различной этиологии вызывают специфические обратимые изменения

во внутриклеточной локализации Hsp25 67

Структура стресс-индуцируемых ядерных гранул Hsp25 72

РОЛЬ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ HSP25 В РЕГУЛЯЦИИ ЕГО ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ

ЛОКАЛИЗАЦИИ 75

Гиперфосфорилирование и изменение внутриклеточной локализации Hsp25 76

Роль фосфорилирования в процессе транспорта Нчр25 в ядро клетки 80

Участие фосфорилирования в ассоциации Hsp25 с актиновым цитоскелетом 85

Дополнительные факторы для перераспределения Hsp25 в клетке 88

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ СТРЕСС-ИНДУЦИРУЕМОГО ПЕРЕРАСПРЕДЕЛЕНИЯ

HSP25/27 90

Влияние ассоциации Hsp25 с актиновыми фибриллами на их стабильность 91

Ядерный Hsp25/27усиливает эффективность рефолдинга поврежденных белков в
ядре
93

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ 101

Изменения внутриклеточной локализации Hsp25, вызванные действием

теплового шока и других стрессов 103

роль фосфорилирования hsp25 в регуляции его внутриклеточной

локализации 105

функциональные последствия стресс-индуцируемого перераспределения
HSP25/27 112

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 117

ВЫВОДЫ 117

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 121

Введение к работе

Существование биологических систем, будь то бактерия или сложный многоклеточный организм возможно только в относительно узком диапазоне физико-химических параметров. Такие параметры как, например, температура и химический состав окружающей среды являются чрезвычайно лабильными и при этом оказывают прямое воздействие на жизнедеятельность и выживаемость организмов и их структурных единиц - клеток. Многоклеточные организмы высшего порядка частично решают проблему колебаний условий окружающей среды, создавая свой внутренний гомеостаз. Однако в процессе жизнедеятельности и, особенно, во время патофизиологических состояний организма (например, воспаление, отравление ядовитыми веществами, локальная дисфункция кровотока) возникают ситуации, когда клетки находятся в условиях, далеких от их физиологического оптимума. В мире постоянно меняющихся условий окружающей среды, выживание клеток становится возможным лишь благодаря хорошо отлаженным, отработанным в процессе эволюции молекулярным механизмам внутриклеточной защиты.

Важнейшим компонентом молекулярных механизмов внутриклеточной защиты являются белки теплового шока (БТШ). Название БТШ отражает историю их открытия, когда экспрессия этих белков впервые обнаружилась в клетках, подвергнутых кратковременному воздействию повышенной температуры (Ritossa 1962). Как оказалось впоследствии, БТШ экспрессируются во всех живых организмах от бактерии до человека и вовлечены в механизмы защиты клеток не только от изменений температурных условий, но также от повреждений, вызываемых воздействием свободных радикалов, нарушением энергетического баланса, изменением рН среды, действием токсинов и проч. Более того, многие белки, входящие в семейство БТШ, функционируют в клетках и при нормальных физиологических условиях, осуществляя поддержание других белковых молекул в клетке в функциональном состоянии. БТШ, выполняющие такого рода функцию, получили название молекулярных шаперонов. Таким образом, все молекулярные шапероны являются белками теплового шока, однако не все белки теплового шока -молекулярные шапероны.

Одним из представителей БТШ является белок Hsp25/27. В научной литературе для определения белка человека принято название Hsp27, тогда как для

гомологичных ему белков крысы и мыши используется аббревиатура Hsp25. Функционирование этого белка в нормальных физиологических условиях представляется неясным, хотя он конститутивно экспрессируется в достаточно больших количествах во многих мышечных тканях, особенно в сердце (Klemenz et al 1993; Knowlton et al 1998; Scheler et al 1997).

Избирательное увеличение количества белка Hsp25/27 в клетках защищает последние от действия теплого шока (Chretien and Landry 1988; Landry et al 1989), окислительного стресса (Mehlen et al 1995b; Rogalla et al 1999), ишемии/реперфузии (Vander Heide 2002; Loktionova et al 1998; Brar et al 1999), действия некоторых токсических веществ (Huot et al 1991; Garrido et al 1996; Wu and Welsh 1996). Более того, по последним данным Hsp25/27 может блокировать реализацию программы «клеточного самоубийства» - апоптоза (Wagstaff et al 1999; Brar et al 1999; Bruey et al 2000; Charette et al 2000; Garrido et al 1999; Guenal et al 1997), тем самым повышая выживаемость клеток в условиях патофизиологических состояний. Таким образом, было продемонстрировано важное действие белка Hsp25/27 в качестве защитного фактора.

Несмотря на то, что Hsp25/27 явно вовлечен в процессы клеточной защиты, конкретные механизмы его действия остаются нераскрытыми. Некоторые исследователи приводят данные о том, что этот белок способен связываться с различными элементами цитоскелета, особенно с актиновыми фибриллами (Benndorf et al 1994; Loktionova et al 1996; Bryantsev et al 2002). С другой стороны известно, что Hsp25/27 образует под действием стресса крупные внутриклеточные гранулы, локализация которых, по разным сведениям, может быть ядерной (Arrigo et al 1988а; Loktionova et al 1996), околоядерной или цитоплазматической (Collier and Schlesinger 1986; Collier et al 1988). Считается, что такие «стрессовые гранулы» функционируют в качестве комплексов, обладающих шаперонными свойствами (Ehrnsperger et al 1999; Ehrnsperger et al 1997). Действительно, in vitro, в экспериментах с очищенными белками была продемонстрирована способность Hsp25/27 специфически связывать денатурированные белки и частично восстанавливать их поврежденную структуру (производить рефолдинг), на основании чего этот белок был отнесен к категории молекулярных шаперонов (Ehrnsperger et al 1997; Jakob et al 1993; Merck et al 1993a). Тем не менее, имеющаяся к настоящему времени информация о структуре молекулы

Hsp25/27 не предполагает существования нуклеотид-связывающего домена, необходимого молекулярным шаперонам для осуществления рефолдинга. Равно не было опубликовано данных о существовании шаперонной активности Hsp25/27 in vivo, в живой клетке. Таким образом, предположение о функционировании этого белка в роли молекулярного шаперона в клетках в условиях стресса остается недоказанным.

Противоречивыми являются также имеющиеся в литературе сведения об участии фосфорилирования Hsp25/27 в механизмах клеточной защиты. Известно, что тепловой шок и другие стрессы вызывают быстрое фосфорилирование этого белка в клетках (Crete and Landry 1990; Barchowsky et al 1994; Loktionova et al 1996). Внутриклеточный сигнальный процесс, приводящий к фосфорилированию Hsp25/27 достаточно хорошо изучен и киназы, непосредственно фосфорилирующие этот белок, полно охарактеризованы. Однако свойства фосфо-изоформ белка Hsp25/27 остаются не вполне ясными. С одной стороны, в экспериментах in vitro показано, что: 1) за связывание с актиновыми микрофиламентами ответственны нефосфорилированные формы Hsp25/27 и 2) нефосфорилированный Hsp25/27 ингибирует полимеризацию актина (Benndorf et al 1994). С другой стороны, существуют противоречивые данные о том, что индукция фосфорилирования Hsp25/27 in vivo, с помощью химических агентов, вызывает усиление стабильности актинового цитоскелета к актин-депо лимеризующим воздействиям (Guay et al 1997). Кроме того, было показано, что во фракции актинового цитоскелета активированных тромбоцитов содержатся фосфорилированные формы Hsp25/27 (Zhu et al 1994). Несмотря на это, до сих пор не установлено четкой взаимосвязи между ассоциацией Hsp25/27 с акта новым цитоскелетом и защитой последнего. Например, в работах, демонстрирующих декорирование актиновых фибрилл белком Hsp25/27, не проводились функциональные тесты и наоборот, в экспериментах, демонстрирующих влияние этого белка на стабильность актиновой сети, не исследовалась его внутриклеточная локализация. Также остается непонятным, почему белок Hsp25/27 в момент стресса подвергается фосфорилированию. По данным экспериментов in vitro, фосфорилирование Hsp25/27 ведет к значительному снижению его шаперонных свойств, (Rogalla et al 1999) тогда, как именно эти свойства Hsp25/27 должны бы быть востребованы клеткой в случае стрессовых условий и в процессе восстановления.

Ситуация еще более усложняется, если учитывать имеющиеся в литературе косвенные предпосылки о том, что найденные в клетке стресс-индуцируемые гранулы состоят из дефосфорилированного Hsp25/27 (Loktionova et al 1996).

Учитывая все вышеизложенное, целью данной работы явилось исследование поведения белка теплового шока Hsp25/27 в подвергнутых стрессу клетках, для более детального выявления механизмов клеточной защитвы.

Для достижения данной цели были сформулированы следующие задачи:

  1. Выявить изменения внутриклеточного распределения белка Hsp25/27 в ответ на действие стрессов различной этиологии;

  2. Исследовать роль фосфорилирования во внутриклеточном перераспределении белка Hsp25/27;

  3. Изучить функциональные последствия перераспределения белка Hsp25/27.

Похожие диссертации на Внутриклеточное перераспределение белка Hsp25/27 под действием стресса: регуляция и функциональная значимость