Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. род лопух (Arctium L.) перспективный источник биологически активных веществ 9
1.1. Систематика, ботаническая характеристика, ареал, местообитание, сырьевые ресурсы видов рода лопух (Arctium L.) 9
1.2. Степень изученности химического состава лопуха 12
1.3. Применение лопуха в официнальной и народной медицине 16
1.4. Сведения об экспериментальном изучении биологической активности препаратов лопуха 19
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 23
2.1 .Обьекты исследования 23
2.2. Методы исследования 23
2.2.1. Методы химического исследования 23
2.2.2. Методики морфологического и микроскопического исследования 41
2.2.3. Методики товароведческого исследования 41
2.2.4. Методики фармакологического исследования 42
2.2.4. Статистическая обработка результатов 47
ГЛАВА 3. Химическое исследование биологически активных веществ корней лопуха 48
3.1. Качественный и количественный анализ основных групп биологически активных веществ 48
3.2. Выделение р-аспарагина из водного экстракта корней лопуха и установление его структуры
ГЛАВА 4. Исследование фармакологических свойств и безвредности водного экстракта лопуха и выделенного из него р-аспарагина 66
4.1. Оценка острой токсичности 66
4.2. Исследование апоптозиндуцирующей активности in vitro 67
4.3. Исследование противоопухолевой активности in vitro 68
4.4. Исследование воздействия водного экстракта корней лопуха и аспарагина на перевиваемые опухоли животным 73
ГЛАВА 5. Разработка методик стандартизации корней лопуха свежих по р-аспарагину 83
5.1. Методики качественного обнаружения р-аспарагина в сырье лопуха 83
5.2. Разработка методик количественного определения Р-аспарагина в
корнях лопуха 83
5.3-Разработка приемов культивирования лопуха большого 87
5.4. Изучение динамики накопления р-аспарагина в листьях и корнях лопуха в зависимости от фазы вегетации и места сбора растения 92
5.5. Определение товароведческих показателей корней лопуха свежего 96
5.6. Исследование морфологических и анатомических признаков корней лопуха 98
Выводы 101
Список литературы
- Степень изученности химического состава лопуха
- Методы химического исследования
- Выделение р-аспарагина из водного экстракта корней лопуха и установление его структуры
- Исследование противоопухолевой активности in vitro
Степень изученности химического состава лопуха
Лопух большой (Arctium lappa L.) - монокарпик из семейства сложноцветных с мясистым стержневым корнем и прямостоячим ребристым стеблем 60-180 см высотой. Розеточные листья черешковые, широко сердцевидно-яйцевидные. зубчатые, сверху с редкими короткими волосками или голые, зеленые, снизу серовато-войлочные, до 70 см длиной. Цветки в шаровидных корзинках 3-3,5 см в диаметре, собранных в верхушечную щитковидную метелку. Листочки обертки голые или слегка паутинистые, черепитчато расположенные, линейные, жесткие, крючковато-изогнутые. Цветоложе густо усажено жесткими, линейно-шиловидными прицветниками. Все цветки трубчатые, обоеполые, с лилово-пурпурным венчиком, чашечка в виде хохолка. Семянки 5-7 мм длиной, серо-коричневые (пятнистые), продольно-ребристые, продолговатые, голые, хохолок короче семянки. Цветет в июле-августе, плоды созревают в августе-сентябре. Вес 1000 семянок около 9,5г [43, 51, 74].
На первом году развития побег достигает 5.5 см за 2 месяца развития и продолжает вегетатировать ещё 4 месяца. Фактически побег представляет собой розетку с плохо выраженными междоузлиями. На второй год в середине марта на корневище появляются первые 2 листа, при этом сам побег зачаточен. Таким он остаётся до середины апреля, когда на нем заложены уже 6 листьев. Далее заложение каждого последующего листа происходит до 25 мая, при этом сам побег удлиняется незначительно. Рост побега завершается в середине июля. На первом году развития на конусе нарастания закладывается до 8 вегетирующих листьев. Первый лист начинает своё развитие в начале апреля, последний закладывается в начале августа. Общий период функционирования первых четырёх и последнего на побеге листа 1-2 месяца, средних до 4 месяцев. Наибольших размеров достигает пятый лист на побеге. Он же достигает максимальную скорость роста, до 6мм в сутки, тогда как у первого и последнего она составляет 0,8 и 1,0мм в сутки.
На втором году развития побег за 4 месяца вегетации достигает окончательного размера. К середине июля на 11-12 пазушных побегах развивается до 43 листьев, на главном - порядка 20. Листья нижних ярусов, имея незначительные размеры, имют значительный период роста. Листья средних ярусов, развивая наибольшие листовые пластинки, достигают своих размеров в значительно короткий период. Максимально развитый 12-й лист на побеге достигает окончательного размера за 9 суток, развиваясь, в среднем, со скоростью 3-4 см в сутки. При этом лист продолжает функционировать чуть больше двух месяцев. Значительное ускорение онтогенеза на втором году развития объясняется накоплением пластического материала в корневище после первого года вегетации [29].
Наряду с лопухом большим (Arctium lappa L.) широко распространен лопух войлочный (паутинистый) (Arctium tomentosum Mill). Лопух большой и лопух войлочный произрастают по всей европейской части бывшего СССР и Сибири. 8 Средней Азии, Западной и Восточной Сибири встречается лопух гладко-семянный, лопух малый (Arctium minus Bernh). На Кавказе растут лопухи широкочешуйчатый, Палладина, скребница. На Урале встречается разновидность лопухов с белыми цветочными корзинками. Белоцветущие экземпляры часто растут рядом с обычными [45]. Как овощное растение лопух культурный (Arctium edule) выращивается в Бельгии, Франции, Китае, Японии, США [78, 105, 121, 131].
Виды этого рода - широколиственные мезоморфные травы, преимущественно сорные, рудеральные, распространенные весьма широко, главным образом в более северных, умеренно - влажных лесных областях, некоторые обитают во влажных и тенистых лесах, и никогда не встречаются в засушливых условиях [63].
Распространен лопух почти во всей европейской части СНГ, в Западной и Восточной Сибири, в Центральной Азии, во всей Европе, в Гималаях, Китае, Японии, а также в Аргентине, Уругвае, США. В Сибири произрастают три вида: лопух большой, л.войлочный и л.малый. Наиболее распространен лопух большой [74]. Произрастают лопухи в самых разных экологических условиях. Растет на лесных опушках, полянах, лугах, по оврагам, канавам, окраинам полей, около жилья в лесной, лесостепной и степной зонах, нередко образует значительные заросли. Заготовку ведут от дикорастущих растений [45]. Однако для промышленной переработки лекарственного растительного сырья наиболее целесообразно вводить лекарственные растения в культуру. Это особенно актуально для растений, лекарственным сырьем которых являются подземные органы. Лопух, как сорное растение, хорошо отзывается на условия выращивания, создавая при этом достаточїгую биомассу в значительно более короткие сроки, чем в природе.
Состав биологически активных веществ лопуха достаточно широко изучается учеными России, Украины, Японии, Китая и США, но данные противоречивы.
По данным литературы корни лопуха содержат полисахарид инулин (до 45%); протеины (12,34%); эфирное бардановое масло (до 0,17%) с плотностью при 20 "С 0,96, удельное оптическое вращение +1,32, кислотное число 13,5-109,0, эфирное число 109,0-236,6, йодное число 63,0-69, жирное масло (0,82%) состоящее из олеиновой, линолевой, пальмитиновой стеариновой кислот, углеводород С26Н54. дубильные вещества, кумарины, оксикоричные кислоты, органические кислоты, полиацетилены, сесквитерпеновые лактоны, витамины. Установлено что в корнях лопуха содержится витамины С и PP. [16, 33, 46, 47, 70, 71,74,79,80,116, 117,123, 133]
Японские исследователи выделили полифенолоксидазу из корней съедобного лопуха A. lappa [114]. Украинскими и японскими учёными из корней лопуха выделен пектин и предложен метод его получения [58, 35].
Методы химического исследования
Результаты экспериментальных исследований показали, что настойка семянок (40% этанол) лопуха войлочного Arctium tomentosum на всех имеющихся моделях язвообразования (нейрогенная, резерпиновая, аспириновая, бутадиеновая) проявила выраженное гастрозащитное действие, снижала содержание пепсина в желудочном соке, ускоряла эвакуацию кишечного содержимого [15, 60, 67].
Извлечения из листьев и корней лопуха проявляют высокую гепатопро-текторную активность на различных моделях повреждения печени крыс [87, 98, 113, 124]. Тайваньские исследователи предположили, что гепатопротекторная активность экстракта корня лопуха обусловлена его высокой антиоксидантной активностью [87].
Выявлено, что извлечения из лопуха войлочного (ИЛВ) проявляют антитоксические свойства при отравлении этанолом. Обнаружена способность изменять развитие толерантности к наркотическому эффекту этанола. Установлено, что ИЛВ обладают противогипоксическои активностью. Выявлены адапто-генные свойства ИЛВ [32, 62].
Введение экстракта из семянок лопуха войлочного приводило к значительным изменениям функциональной активности желудка собак и слизистой оболочки тонкого кишечника у крыс. Наблюдалось значительное повышение защитных свойств надэпителиального слизистого слоя тонкого кишечника, что делает препарат перспективным средством коррекции нарушений функционального состояния тонкой кишки [12].
Установлено, что водные экстракты лопуха обладают антиоксидантными свойствами [8, 37].
Препарат «Бердок» (капсулированный измельченный сухой корень лопуха) оказывает выраженный клинический эффект при лечении псориаза у детей [56].
Инулиновую фракцию из корня лопуха большого используют для профилактики и лечения сахарного диабета, нормализации функции поджелудочной железы и в качестве заменителя сахара; доказана ее иммуностимулирующая активность [42, 84, 107, 125].
Полисахар и дная фракция из листьев лопуха проявляет антиоксидантную активность[104].
В экспериментах на животных выявлена высокая ранозаживляющая активность сухого экстракта листьев лопуха войлочного, приготовленного на 25%-ном этаноле. Сухой экстракт корней, приготовленный на 70%-ном этаноле, оказал выраженное антиэкссудативное и антипролиферативное действия при моделировании хронического воспаления. У животных с острым воспалением сухие экстракты листьев, приготовленные на 70, 40 и 25%-ном этаноле, оказывали умеренное противовоспалительное действие. Анальгетическая активность в эксперименте обнаружена при введении экстракта корней на 40%-ном этаноле и экстрактов листьев на 70 и 25%-ном этаноле [66].
Из сухих корней лопуха выделены полисахариды, относящиеся к классу пектиновых веществ и/или кислых арабиногалактанов. Показано, что полисаха-ридные фракции обладают способностью связывать в сыворотке крови атеро-генные липопротеиды низкой плотности. Эти данные могут указывать на анти-атеросклеротическое действие изучаемых полисахаридов [64].
В эксперименте на белых мышах и крысах выявлено, что настойка на 40% этаноле из листьев лопуха войлочного обладает выраженной гастрозащитной активностью на различных острых и хронических моделях язв желудка. Фармакологическая активность настойки из листьев лопуха не уступает по эффективности фармакопейным фитопрепаратам - плантоглюциду, бефунгину, экстракту левзей сафроловидной [67].
Бразильскими исследователями доказано, что извлечения из листьев лопуха большого проявляют высокую антибактериальную и антивирусную активность [88, 101, 124].
Корейские исследователи тестировали способность корня лопуха блокировать возникновение неопластов с помощью индукции хинонредуктазы, мар 22 керного фермента для химиопрофилактики, в клетках гепатомы мышей. Установлено, что метанольный экстракт лопуха значительно индуцировал активность хинонредуктазы и может использоваться для профилактики рака. [105].
Японскими и венгерскими учеными доказана противоопухолевая активность фракций сока и метанольного экстракта из корней лопуха [91, 93, 103, 106, 111, 112,122].
Цитотоксичность арктиина, его агликона арктигенина и других лигнанов, которые содержатся в плодах лопуха большого, доказана на культурах клеток и перевиваемых опухолях животным корейскими, японскими и китайскими учеными. [89, 92, 96, 127, 135]. Японские учёные предполагают, что антипролефе-ративная активность арктигенина обусловлена апаптозом клеток [110]. Выявлено, что арктигенин проявляет 100% цитотоксикность при вынужденном голодании опухолевых клеток (недостаток глюкозы и кислорода) [100].
Исследования по противоопухолевой активности препаратов корней лопуха представляют особый интерес. Именно данные свойства лопуха привлекли наше внимание и явились предметом исследования.
Выделение р-аспарагина из водного экстракта корней лопуха и установление его структуры
К полученному извлечению прибавляют 2 мл 10 % раствора свинца ацетата основного, перемешивают и оставляют на 10 мин. Затем прибавляют 2 мл 5 % раствора натрия фосфата, перемешивают, оставляют на 5 минут. Доводят объем раствора в колбе водой до метки, перемешивают. Фильтруют извлечение через бумажный складчатый фильтр, отбрасывая первые 10 - 15 мл фильтрата- 5 мл фильтрата помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки, перемешивают (раствор А).
В две конические колбы вместимостью 50 мл прибавляют по 5 мл 0,1 % этанольного раствора резорцина и по 10 мл 30 % раствора кислоты хлористоводородной. В первую колбу помещают 5 мл раствора А (анализируемый раствор), во вторую 5 мл воды (раствор сравнения). Обе колбы нагревают на водяной бане при температуре 80 С в течение 20 мин, охлаждают до комнатной температуры. Содержимое количественно переносят в мерные колбы вместимостью 25 мл, доводят объем растворов в колбах 30 % раствором кислоты хлористоводородной до метки, перемешивают.
Измеряют оптическую плотность анализируемого раствора на спектрофотометре при длине волны 483 нм в кювете с толщиной слоя 10мм относительно раствора сравнения.
Содержание фруктозидов в пересчете на инулин и абсолютно сухое сырье в процентах(Х;) вычисляют по формуле: Рх 200x100 25x100x100 рх 1000000 498xlxl00x5xl0xmx(100-W) 498xmx(]O0-HO где D —- оптическая плотность анализируемого раствора; 498 — удельный показатель поглощения продуктов реакции взаимодействия инулина с резорцином в кислой среде; m — масса сырья в граммах; W— потеря в массе при высушивании сырья, %. Содержание фруктозанов в пересчете на инулин и абсолютно сухое сырье в процентах (Xi) вычисляют по формуле: Х, = Х X где X— содержание суммы фруктозидов и фруктозанов в пересчете на инулин и абсолютно сухое сырье в процентах; X] — содержание фруктозидов в пересчете на инулин и абсолютносухое сырье в процентах [81].
Алкалоиды Для обнаружения алкалоидов из сырья получали солянокислое извлечение, с которым проводили известные в фитохимии реакции с обще-осадительными реактивами Драгендорфа, Фреде, Вагнера, 1% раствором кислоты пикриновой. 1% раствором крем невольфрамовой кислоты, 1% раствором фосфорномолибденовой кислоты, 1% раствором фосфорновольфрамовой кислоты. Результат реакции оценивали по образованию окрашенного осадка [24].
Аскорбиновая кислота. Определение проводили методом титрования аликвоты водного извлечения раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия Р2].
Каротиноиды. Качественное и количественное определение каротинои-дов в сырье определяли по методике В.А. Девятнина спектрофотометрическим методом [27]. 50,0 (точная навеска) исследуемого сырья помещали в колбу для омыления, прибавляли 95 мл 5% спиртового раствора щелочи и нагревали на водяной бане с обратным холодильником в течение 1 часа. Затем раствор переносили в делительную воронку, прибавляли 30 мл гексана и несколько миллилитров воды (до разделения слоев). Смесь взбалтывали и отделяли гексановый слой. Извлекали несколько раз до получения бесцветных гексановых вытяжек. Оставшуюся в колбе после омыления массу промывали гексаном, полученные гекса-новые вытяжки прибавляли к основному раствору. Гексановый раствор сушили безводным натрия сульфатом при взбалтывании до исчезновения мутности раствора, экстракт фильтровали и сгущали в колбе до 5-10 мл. Сгущенный экстракт пропускали через колонку с алюминия оксидом (ПІ) в мерную колбу объемом 25 мл, доводили до метки гексаном (раствор А) и определяли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 440 нм. В качестве раствора сравнения использовали гексан. Концентрацию определяли по калибровочному графику, построенному по раствору р-каротина, а содержание каротиноидов в сырье (X), в мг %, вычисляли по формуле: _ CxFxlOOxlOO X = -, г— , где mx(\00-W) С - концентрация каротиноидов, найденная по калибровочному графику, построенному по известному образцу Р-каротина, мг/мл; т - навеска сырья, г; V- объем раствора А. мл; W— потеря в массе при высушивании сырья (влажность), %. Липиды. Корни лопуха измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями 0,5 мм. Пробу массой 30 г переносили в предварительно обезжиренный, высушенный до постоянной массы патрон из фильтровальной бумаги и помещали в аппарат Сокслета с объемом экстрактора 250 мл. Экстрагирование проводили диэтиловым эфиром на водяной бане в течение 10 ч. Полученный экстракт количественно переносили в круглодонную колбу объемом 500 мл и проводили отгонку растворителя на роторном испарителе. Содержание масла вычисляли по разности в массе колбы до экстракции масла и после. Эфирные масла. Количественное определение эфирного масла проводили методом перегонки с водяным паром. [22].
Исследование противоопухолевой активности in vitro
Как уже отмечалось в обзоре литературы, химический состав корня лопуха изучался многими авторами- По данным литературы наиболее значимыми биологически активными веществами (БАВ) дикорастущего лопуха большого являются полисахариды и аминокислоты. Фенольные соединения представлены, в основном, фенолокислотами. В связи с тем, что нами создана сырьевая база культивируемого лопуха большого, возникла необходимость изучения его химического состава в сравнении с дикорастущим. С этой целью нами проведен химический анализ корней лопуха на содержание наиболее значимых групп БАВ. Результаты представлены в таблице .
Фенольные соединения. Общепринятыми реакциями с растворами солей железа получили темно-зеленое окрашивание, свидетельствующее о присутствии в извлечении фенольных соединений в небольших количествах. Данные реакции обычно используются для обнаружения дубильных веществ в растительном сырье, но поскольку они являются общими и для других фенольных соединений, заключение о присутствии последних, как правило, бывает недостоверным.
Гидроксикоричные кислоты Реакцией на гидроксикоричные кислоты является взаимодействие с раствором аммиака. При добавлении к I мл спиртового извлечения из корней лопуха 1 мл 25% спиртового раствора аммиака наблюдалось желто-коричневое окрашивание. Полученные данные подтверждали тонкослойной хроматографи-ей.
Качественное обнаружение гидроксикоричных кислот проводили хрома-тографическим методом на бумаге в 2% кислоте уксусной. В УФ-свете при длине волны 360 нм отмечено несколько пятен голубой, голубовато-зеленой и голубовато-фиолетовой флюоресценции, которые после проявления хромато-граммы гидроксидом натрия и реактивом Паули (диазотированная сульфаиило-вая кислота) приобретали различную окраску в видимом свете (рис. 1). По хро-матографическому поведению (значению Rf при сравнении с заведомо известными веществами, окраске пятен в УФ-свете, окраске в видимом свете после проявления реактивом Паули,) нами идентифицированы кофейная, феруловая и хлорогеновая кислоты и одно не идентифицированное соединение. Характеристика кислот представлена в таблице 3.
Схема ТС-хроматограммы водно-спиртового извлечения лопуха большого Система растворителей: 2% кислота уксусная. 1 - хлорогеновая кислота; 2 -феруловая кислота; 3 -кофейная кислота; 4 - водно-спиртовый экстракт лопуха
Вещество Значение Rf Окраска пятен УФ-свет Видимый свет, реактив Паули феруловаякислота 0,28 светло-голубая коричневая кофейнаякислота 0,32 голубая фиолетовая хлорогеноваякислота 0,70 голубая желто-коричневая не идентиф. соединение 0,88 фиолетовая темно-коричневая Флавоноиды. Присутствие данной группы соединений выявляли с помощью известных реакций на флавоноиды. При этом одни из них, такие как с железа хлоридом и щелочами, являются общими для всех фенольных соединений. Заключение о наличии флавоноидов в сырье сделали на основании более специфичных реакций: цианидиновая проба с цинком в присутствии концентрированной кислоты хлороводородной и реакция со спиртовым раствором алюминия хлорида показали отсутствие какого-либо окрашивания испытуемого спиртового экстракта. Результаты реакций свидетельствовали о том, что флавоноиды в лопухе большом отсутствуют или содержатся в следовых количествах, неопределяемых общепринятыми реакциями.
Кумарины. Для выявления кумаринов использовали водно-спиртовое извлечение из анализируемого сырья, с которым затем проводили реакции диазо-тирования и лактонную пробу. О присутствии кумаринов свидетельствовала желто-оранжевая окраска, переходящая в оранжевую.
Дубильные вещества. Проведена реакция водного извлечения из сырья с раствором желатина. При этом наблюдали образование аморфного осадка. В результате реакции водного извлечения с раствором соли кодеина наблюдается помутнение раствора. На основании этого сделали заключение о наличии в корнях лопуха дубильных веществ.
Сапонины. Для обнаружения сапонинов в исследуемом объекте использовали несколько известных реакций: пенообразования, реакцию с раствором ацетата свинца. Водное извлечение при интенсивном встряхивании образовывало густую устойчивую пену, что свидетельствовало о присутствии сапонинов в извлечении. При добавлении в одну из пробирок раствора натрия гидроксида, а в другую - кислоты хлороводородной, наблюдали более высокий столб пены в пробирке с натрия гидроксидом, что позволяет отнести сапонины лопуха к тритерпеновым соединениям- В реакции с раствором ацетата свинца наблюдали образование белого осадка. Полисахариды. Полисахариды осаждали из водного извлечения 95% спиртом этиловым, в результате наблюдали появление хлопьевидных сгустков. Наличие полисахаридов подтверждали реакцией с тимолом и концентрированной кислотой серной, наблюдали коричнево-желтое окрашивание. Более достоверное обнаружение полисахаридов проводили методом тонкослойной хроматографии. Отмечено два пятна оранжево-красного цвета (рис. 2). По хромато-графическому поведению (значению Rf при сравнении с заведомо известными веществами, окраске пятен в видимом свете после проявления спиртовым раствором тимола) нами идентифицированы инулин и фруктоза. Характеристика веществ представлена в таблице 4.
