Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 11
1.1. Свойства церулоплазмина 11
1.1.1. Фармакологические свойства церулоплазмина 11
1.1.2. Структура молекулы церулоплазмина и его основные биохимические свойства 13
1.1.3. Физиологическая роль церулоплазмина в организме 19
1.1.4. Регуляция обмена меди в организме 20
1.1.5. Антиоксидантные свойства церулоплазмина 23
1.2. Способы выделения церулоплазмина 26
1.3. Термодинамические и кинетические особенности взаимодействия белковых макромолекул с лигандами 30
Глава 2. Экспериментальная часть 53
2.1. Получение и свойства церулоплазмина 53
2.1.1. Количественное определение белка в препарате Церулоплазмин 53
2.1.2. Определение степени очистки 53
2.1.3. Электрофорез на плёнках из ацетата целлюлозы 53
2.1.4. Иммуноэлектрофорез по методу Grabar (Grabar, Williams, 1953)[97] 54
2.1.5. Гель-проникающая хроматография низкого давления 54
2.1.6. Определение ферментативной активности 55
2.1.7. Количественное определение содержания ЦП 55
2.2. Физиологически активные вещества 62
2.2.1. Доксорубицин 62
2.2.2. Дигидрокверцетин 62
2.2.3. Лецитин 64
2.3. Очистка растворителей 66
2.4. Спектрофотометрические измерения 66
2.5. Исследования методом ЭПР 66
2.6. Измерения рН растворов 67
2.7. Измерение поверхностного натяжения 67
2.8. Исследования на модельных системах 68
2.8.1. Модифицированная поверхность полипиромеллитимида 68
2.8.2. Изучение адсорбции 70
2.8.3. Модельные системы на основе монослоев Ленгмюра 70
2.8.4. Получение дисперсии везикул 72
2.9. Измерение краевого угла смачивания 73
2.10. Атомно-силовая микроскопия 75
Глава 3. Обсуждение результатов 76
3.1. Комплексообразование ДР с ионами меди каталитического центра ЦП 76
3.1.1. Характеристика реакционной смеси ДР и ЦП в воде 78
3.1.2. Изучение свойств комплексов Си -ДР на моделях биомембран 87
3.2. Ассоциация полифенольного флавоноида - ДКВ с ЦП 93
3.2.1. Обоснование выбора дигидрокверцетина как протекторного лиганда 94
3.2.2. Исследование комплексообразования ДКВ с ионами меди (И) каталитического центра ЦП ... 105
3.2.3. Кинетические особенности взаимодействия ДКВ и Си2+610'ЦП 115
3.2.4. Комплексное воздействие физиологичеки активных веществ на ЦП 117
3.3. Защита активных центров ЦП при химиотерапии ДР комплексами лецитин-ВМС 118
3.3.1. Исследование свойств тонких пленок смеси лецитинаи ВМС 119
3.3.2. Адсорбция ДР на поверхности тонкой пленки сополимера Ст-ЫВПД 122
3.3.3. Адсорбция ДР на поверхности модифицированных полиамидокислот 124
Выводы 127
Список литературы 130
Список печатных трудов 144
- Структура молекулы церулоплазмина и его основные биохимические свойства
- Термодинамические и кинетические особенности взаимодействия белковых макромолекул с лигандами
- Количественное определение белка в препарате Церулоплазмин
- Исследование комплексообразования ДКВ с ионами меди (И) каталитического центра ЦП
Введение к работе
Актуальность темы
Медьсодержащие ферменты участвуют в различных биологических процессах и необходимы для роста организма, нормального функционирования иммунной системы, метаболизма углеводов и липидов. Одним из важных ферментов плазмы крови человека является медьсодержащий белок - церулоплазмин, относящийся к классу «голубых» оксидаз. Церулоплазмин регулирует обмен меди в организме, обеспечивает эффективный транспорт меди к тканям и выведения её из организма. Кроме того, он проявляет антиоксидантные свойства и является своего рода «функциональным депо» для безопасного хранения меди. В случае острых и хронических заболеваний отмечается высвобождение больших количеств меди, тогда как потребность организма в медьсодержащих факторах возрастает.
Недостаток ионов меди в организме может быть вызван нежелательным хелатированием ионов меди физиологически активными веществами, используемыми в терапии. Особенно этот эффект проявляется при использовании токсических противоопухолевых препаратов. В связи с этим, возникает проблема защиты медьсодержащих каталитических центров церулоплазмина и сохранения его антиоксидантных свойств.
Одним из путей защиты медьсодержащих активных центров фермента является ассоциация ионов меди с физиологически активными веществами, не проявляющими токсического действия. Требования к выбору защитных физиологически активных веществ определяются:
термодинамикой конкурентного комплексообразования токсического противоопухолевого лекарственного вещества и выбранного защитного вещества (константы ассоциации или устойчивости комплексов),
кинетическими особенностями ассоциации нетоксичного физиологически активного вещества с ионами меди активного центра церулоплазмина,
взаимодействием физиологически активных веществ и их
медьсодержащих -комплексов с липофильными и гидрофильными
фрагментами биомембран.
К ' лекарственным веществам, способным защищать медьсодержащие каталитические центры ферментов, относятся полифенольные флавоноиды.
Защитное действие флавоноидов связывают с их высокими антиоксидантными свойствами и способностью полифенолов образовывать хелатные комплексы с ионами металлов. Из полифенольных флавоноидов в медицинской практике наиболее широко применяется природный антиоксидант - дигидрокверцетин, не проявляющий токсического действия в терапевтических дозах.
В связи с вышеизложенным, образование комплексов физиологически активных веществ с ионами меди, способных защищать или ингибировать активные центры ЦП, является актуальной проблемой.
Целью настоящей работы является исследование защитного действия полифенольным флавоноидом - дигидрокверцетином (ДКВ), активных центров церулоплазмина (ЦП) при противоопухолевой терапии доксорубицином (ДР), а также выявление путей снижения токсического действия ДР.
В задачи исследования входило:
исследование термодинамики комплексообразования и ассоциации ДР и ДКВ'с ионами меди каталитического центра ЦП в водном растворе, а также кинетических особенностей взаимодействия ДКВ с ЦП;
оценка специфической активности ЦП в присутствии ДР и ДКВ;
разработка методики анализа комплексов ДР и ДКВ с ионами меди каталитического центра ЦП;
изучение характера межмолекулярного взаимодействия ДР и Си2+ -ионов водных растворов солей и ЦП на моделях липидных и гидрофильных фрагментов биомембран;
разработка полимерсодержащей липосомальной формы препаратов ДР, ослабляющей унос ионов меди ЦП.
Научная новизна
Впервые доказано образование комплексных соединений ДР и ДКВ с ионами меди каталитического центра ЦП. Предложен методологический подход с привлечением теории Скечарда и использованием безразмерной величины R - ответа системы, позволяющий в первом приближении количественно оценить термодинамическую константу ассоциации ДКВ Ка с ионами меди активного центра ЦП.
Разработана методика анализа комплексов ДР с ионами меди, рассчитана термодинамическая константа устойчивости Кр комплексов ДР с ионами меди каталитического центра при стехиометрии 1:1. Показано, что величина Кр значительно превышает (в«1000раз) величину Ка.
Впервые на основе изучения межфазного и поверхностного натяжения реакционных смесей ЦП и физиологически активных веществ оценено гидрофильно-липофильное соотношение ЦП до и после его взаимодействия с ДР и ДКВ, а также дан анализ характера межмолекулярного взаимодействия ДР и Си2+ на простейших моделях биомембран.
Показано, что при комплексном взаимодействии ДР, ДКВ и ЦП в реакционной смеси концентрация наиболее токсических комплексов ДР с ионами меди минимальна. Клиническими испытаниями установлено, что сочетанная химиотерпия ДР, ЦП, ДКВ обуславливает снижение токсических явлений и улучшение показателей по гемоглобину, количеству эритроцитов и специфической активности ЦП.
Предложена липосомальная форма препаратов, снижающая токсическое действие ДР.
Практическая значимость.
Показана возможность использования ДКВ в качестве протектора Си2+ каталитического центра ЦП при терапии онкологических заболеваний ДР. Разработанные методики изучения комплексного
действия лекарственных веществ позволяют прогнозировать свойства
препаратов, в том числе фармацевтическую несовместимость,
иммобилизацию комплексов лекарственных веществ с ионами Си2+ в
липофильный и гидрофильный фрагменты мембраны. Разработана
липосомальная форма доксорубицина, стабилизированная
статистическими сополимерами стирола.
Результаты работы используются в испытаниях препарата
церулоплазмина по фармацевтической несовместимости с
доксорубицином. Экспериментальные результаты по
комплексообразованию ДР и ДКВ с ионами меди использованы в учебном процессе НГМА в дисциплине фармацевтическая химия.
Апробация работы.
Основные результаты работы были представлены на II Международном симпозиуме «Molecular design and synthesis of supramolecular architectures» (Казань, 2002г), на VII сессии молодых ученых (Н. Новгород, 2002г), VI Всероссийской конференции молодых ученых (Саратов, 2003 г), V Всероссийский научный семинар и Молодежная научная школа «Химия и медицина» (Уфа, 2005г), International conference «From molecules towards materials» (H. Новгород, 2005г).
По результатам исследований опубликовано 4 статьи и 6 тезисов научных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов и списка цитируемой литературы. Первая глава работы содержит обзор литературы по свойствам медьсодержащего фермента ЦП и методам изучения свойств коллоидных ферментных систем. Вторая глава работы посвящена методу получения ЦП, его фармацевтическому анализу, анализу специфической активности церулоплазмина, экспериментальным методикам изучения свойств церулоплазмина, доксорубицина и его комплексов с ионами меди (II),
дигидрокверцетина и его комплексов с церулоплазмином, анализу состояния модельных мембран на основе лецитина и арахиновой кислоты. В третьей главе диссертации представлены и обсуждены результаты исследования комплексов доксорубицина с ионами меди солей и с церулоплазмином, церулоплазмина с дигидрокверцетином, представлены расчеты термодинамической константы устойчивости Кр и ассоциации Ка образующихся комплексных соединений, на примере дигидрокверцетина рассмотрены кинетические особенности его комплексообразования с «голубыми» ионами каталитического центра церулоплазмина, рассмотрены данные по адсорбции доксорубицина на сополимерах, выступающих в качестве компонентов липосом.
Работа изложена на 145 страницах, включая 35 рисунков, 7 таблиц и 144 ссылки.
* В руководстве диссертационной работой принимала участие доктор фармацевтических наук Кононова Светлана Владимировна.
Структура молекулы церулоплазмина и его основные биохимические свойства
Церулоплазмин (ЦП) - медь-содержащая оксидаза (КФ 1.16.3.1), принадлежащая к семейству мульти-медных оксидаз, которое включает лакказы растений и грибов, растительную аскорбат-оксидазу и дрожжевой Fet-3 (De"Silva D. et al., 1997; Malmstrom B.G., 1997)[16,17]. Субстратами таких оксидаз являются марганец, железо, нитраты, билирубин, фенолы, аскорбиновая кислота. Отличительной чертой всех этих ферментов является присутствие различных медь-содержащих участков, подразделенных на 3 типа на основании спектроскопических характеристик (Malkin R., Malmstrom B.G., 1970)[18] (табл.1.1.; рис. 1.1.). Ионы меди I типа также называют «синими», поскольку именно они обуславливают характерную окраску белка из-за сильной электронной абсорбции при длине волны около 600 нм, вызванной переносом заряда между серой цистеина и ионами меди. Они расположены в составе тетраэдрической структуры, образованной при связывании с двумя молекулами гистидина и цистеина. Редокс-потенциал участков связывания зависит от расстояния от четвертого аксиального лиганда, обычно метионина (Wittung-Stafshede P. et al., 1998)[19], или от растворимости и ориентации протеиновых диполей, окружающих участок связывания меди (Olsson М.Н., Ryde U., 1999)[20]. Ионы меди II типа, тетрагонально координирование четырьмя атомами азота имидазольной группы, не обладают абсорбцией в видимом диапазоне спектра. Они находятся в тесной близости к ионам меди III типа, представленным парой антиферромагнитно связанных ионов меди, характеризующихся электронной абсорбцией при длине волны около 330 нм. Ионы меди II и III типа составляют уникальную структуру, называемую тринуклеарным кластером (Calabrese L., Mattescu М. et al., 1988; Messerschmidt A. et al., 1989; Holm R.H. et al., 1996)[22,23,24]. Различные медь-содержащие участки созданы для переноса электронов от субстрата к акцептору по контролируемому пути, т.е. без образования потенциально токсичных интермедиатов (02% Н2О2).
Электроны воспринимаются ионами меди первого типа и переносятся к тринуклеарному кластеру, где происходит восстановление кислорода и высвобождение образующейся воды. 4 иона меди - «синий» ион и тринуклеарный кластер - представляют минимальную функциональную единицу медь-содержащей оксидазы. ЦП уникален по общей стехиометрии меди. Он содержит 5-6 атомов меди на молекулу белка (Calabrese L., Musci G., 1997)[25]. Было показано, что ЦП содержит 3 «синих» иона, расположенных в трех доменах (Zaitseva I. et al., 1996)[26], которые частично редуцированы в покоящемся ферменте (Musci G., Bonaccorsi di Patti M.C., Calabrese L., 1993)[27]. Причина переизбытка «синих» ионов меди в ЦП остается неясной. Предполагают, что один из этих ионов постоянно редуцируется и таким образом, функционально неактивен (Machonkin Т.Е. et al., 1998)[28]. Установлено, что «синие» ионы могут быть обратимо удалены без ущерба для ферментативных свойств ЦП (Musci G. et al., 1999)[29]. При этом удаляться может любой из трех ионов I типа, поэтому все эти ионы эквивалентны с точки зрения вклада в каталитический цикл. У здоровых взрослых индивидуумов около 10% от общего ЦП находится в форме апо-протеина, который быстро катаболизируется, с периодом полураспада около 5 часов. При нормальных условиях пул меди в печени не ограничивает скорость синтеза голо-ЦП. При инфекции, травме и беременности, а также при использовании эстрогенов концентрация ЦП возрастает, тогда как соотношение апо- и голо-ЦП остается постоянным (Matsuda I. et al., 1974; Laurell C.B. et al., 1968)[30,31]. ЦП - гликопротеин, относящийся к а2-глобулиновой фракции плазмы крови. Углеводный компонент составляет 2-8% от массы молекулы и включает 9 олигосахаридных цепей, содержащих глюкозамин (15,7-19,2%), маннозу (14,2%), галактозу (12,3%о), фукозу (1,6%) и сиаловые кислоты (Ryden L., 1971)[32]. Удаление ионов меди из голофермента ведет к высвобождению гидрофобных участков, которые, по-видимому, участвуют в формировании активного центра молекулы (Васильев В.Б., Качурин A.M. и др., 1996; De Filippis V., Vassiliev V.B. et al., 1996)[33,34]. Кроме того, лигандами меди являются SH-группы цистеина, атомы азота, остатки гистидина и метионина (Moshkov К.A. et al., 1979)[35]. Молекулярная масса ЦП равна 130-138 кД (Kingston LB. et al., 1980; Manolis A., Cox D.W., 1980; Calabrese L. et al., 1981)[36,37,38]. Имеются данные о генетическом полиморфизме ЦП и о его вариантах у различных этнических групп (Neel I.V., 1979; Sato М. et al., 1990)[39,40]. Электрофоретические варианты ЦП являются причиной различий его концентрации в плазме (Mohrenweiser H.W., Decker R.S., 1982)[41]. Помимо различий в последовательности полипептидной цепи, у разных индивидуумов наблюдаются вариации и углеводных цепей ЦП. При этом изменения углеводных компонентов могут возникать и при острофазовом ответе (Endo М. et al., 1982; Mackiewicz A. et al., 1987)[42,43]. Хотя гликозилирование не требуется для включения меди во время биосинтеза ЦП, изменения в углеводной структуре могут иметь функциональное значение для его метаболизма и ферроксидазной активности (Sato М, Gitlin J.D., 1991)[44].
Термодинамические и кинетические особенности взаимодействия белковых макромолекул с лигандами
Межмолекулярные взаимодействия белковых молекул с низкомолекулярнымй лигандами обычно характеризуются вандерваальсовыми силами, электростатическими взаимодействиями, водородными связями и гидрофобными силами. Количественными характеристиками суммарного действия всех сил являются константа равновесия и изменение функций AG, АН,. AS системы (Мецлер Д., 1980)[94] Прочность связи между двумя частицами можно охарактеризовать с помощью константы образования Кр Рассмотрим присоединение молекулы X к другой молекуле Р, которая может представлять собой молекулу белка, нуклеиновой кислоты, ион металла или любую другую частицу. Если на поверхности Р имеется лишь один центр связывания для X, то взаимодействие может быть описано уравнением 1.З., а константа равновесия Kf определяется уравнением 1.4. (Мецлер Д., 1980)[94]: Константа образования выражается обычно в литрах на моль (или М"1); она является прямой мерой прочности связи - чем больше константа, тем сильнее взаимодействие. Прочность связи характеризуется также изменением стандартной энергии Гиббса AG реакции - чем более отрицательна AG0, тем прочнее связь (Мецлер Д., 1980)[94]. Чтобы избежать недоразумения, важно помнить, что наряду с константой образования (ассоциации) часто (особенно в энзимологии и при определении кислотности) используют константу диссоциации Kd: Часто удобнее пользоваться не самими константами образования, а их логарифмами, поскольку они пропорциональны соответствующим изменениям энергии Гиббса. Логарифм константы образования равен pKd и характеризует уменьшение стандартной энергии Гиббса в ходе реакции ассоциации. Заметим далее, что изменение стандартной энергии Гиббса AG, соответствующее изменению lgKp и pKd на единицу, составляет - 5,7кДж-моль .
Эту величину тоже следует запомнить. Средняя кинетическая энергия движения молекул в растворе равна 3 приблизительно -КГ, где к - константа Больцмана; для 1 моля при 25 3 эта величина составляет -RT, т. е. 3,7 кДж (0,89 ккал). Например, если Кр = 10 (AG=-5,7 кДж моль"1, или - 1,36 ккал моль"1), то энергия связи лишь незначительно превышает энергию теплового движения молекул и образующийся комплекс непрочен. Если концентрации X и Р в этом примере составляют 10"4 М (типичные значения концентраций для биологических систем), то это означает, что в виде комплекса будет находиться лишь 0,1% всех молекул ([комплекс] = Kt[X][P]). Если константа образования в 1000 раз больше, т. е. Кр = 104 (AG0 = -22,8 кДж-моль"1), то в составе комплекса находится 38% всех молекул, а при Кр = 107 (очень сильное взаимодействие, AG0 = -40 кДж-моль"1, или - 9,55 ккал-моль 1), эта величина составляет 97% (Мецлер Д., 1980)[94]. Следует особо отметить особую роль гидрофобного взаимодействия в белковых молекулах. Гидрофобные взаимодействия (4-8 кДж/моль) связаны с выталкиванием молекул воды из пространства между близко расположенными гидрофобными неполярными группами или молекулами. Это повышает дисперсионные взаимодействия последних и приводит к структурированию молекул воды в гидратной оболочке, повышая упорядоченность расположения частиц. Неспособность углеводородов и других неполярных молекул нарушать структуру воды лежит в основе так называемых гидрофобных взаимодействий, определяющих агрегацию неполярных групп в полярном окружении, например при образовании мицелл, клеточных мембран и т. п. Учитывая важность этих взаимодействий в биологии, остановимся подробнее на механизме их возникновения. Подчеркнем, однако, что понятие «гидрофобные взаимодействия», или «гидрофобная связь», не предполагает существования каких-либо новых сил межмолекулярного взаимодействия, каких-либо связей нового типа, кроме перечисленных выше, а представляет собой их проявление при взаимодействии полярных и неполярных молекул (Мецлер Д., 1980)[94]. При растворении углеводородов (или других неполярных, липофильных молекул) в воде энергия их сольватации невысока и не способна удалить сольватные молекулы воды из области притяжения их к другим молекулам воды. Поэтому энергетически выгоднее становится образование комплексов из липофильных молекул, приводящее к уменьшению числа молекул воды, участвующих в сольватации (рис. 1.5.). Таким образом, при комплексообразовании высвободится часть энергии, которая была затрачена на растворение молекул углеводорода в воде.
Количественное определение белка в препарате Церулоплазмин
Анализ осуществляли с использованием прибора для электрофореза ЭФПА-30 (Львовприбор, Украина), мембран "Владипор МФА-МА" (Владимир), разделение проводили в веронал-мединаловом буфере рН 8,6 (мединал-10,3 г, веронал 1,84 г, азид натрия 0,001 г), при напряжении 150В и силе тока 8-Ю мА, в течение 30 мин. В качестве контроля использовали стандартную сыворотку. Электрофореграммы окрашивали 5% раствором нигрозина водорастворимого ("Chemapol", Чехословакия) в 10% ТХУ, в течение 3 минут, затем отмывали в 1% растворе ТХУ.
Отмытые электрофореграммы смачивали в растворе, полученным при смешивании равных объёмов 90% этанола и ЛУК, и высушивали в термостате при температуре 80С до достижения прозрачности плёнки. Электрофореграммы денситометрировали на приборе АФ-1 (Львовприбор, Украина).
Анализ проводили с использованием комплекса приборов для электрофореза ПЭФ-3 (г. Фрунзе), при силе тока 40 мА и напряжении 220В в течение 1,0—1,5 часа, на пластинах из 1% агарового геля ("Difco", США), в веронал-мединаловом буфере рН 8,6, состав которого приведён выше. В качестве контроля использовали стандартные антисыворотки к сывороточным белкам, а также антисыворотку полученную при иммунизации кроликов высокоочищенным ЦП и спиртовой фракцией IV-1 (используемую при производстве ЦП) ("ИмБио" Н. Новгород). Пластины с агаром инкубировали 24-30 часов при комнатной температуре во влажных камерах, а затем иммунопреципитаты фотографировали в рассеянном свете.
Гель-хроматографию осуществляли на колонке производства фирмы "Pharmacia" (Швеция), 2,6x100 см, заполненной Ultrogel АсА34 ("Pharmacia"), уравновешенной 0,1 М трис-буферным раствором, рН 8,0-8,2. Все эксперименты проводили с помощью системы для хроматографии низкого давления фирмы LKB (Швеция), состоящей из: насоса "Miniperpex", прототочного фотометра "Uvicord S", самописца "LKB 2210" и коллектора фракций "Helirac". Препарат наносили в объёме 0,5 мл на колонку. Проводили ретроградное элюирование со скоростью 30 мл/час. Запись вели в автоматическом режиме при длине волны 280 нм. Колонку калибровали смесью веществ с известной молекулярной массой: голубой декстран (2 000 000 Д), БСА (67 кД), овальбумин (45000Д), химотрипсиноген (25000Д), ДНФ-лейцин (297Д).
Определение ферментативной активности осуществляли по методу Ravin (1956)[98]. В две пробирки вносили по 200 мкл исследуемого раствора ЦП, с концентрацией белка 100-500 мкг/мл, и по 4 мл 0,1 М натрий-ацетатного буферного раствора, рН 5,45, предварительно нагретого до температуры 37С. Затем в пробирки добавляли по 2 мл раствора п-фенилендиамин-гидрохлорида (3 мг/мл), отмечая время добавления с помощью секундомера. Пробы термостатировали при температуре 37С. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1,5 М раствора азида натрия, спустя 10 и 20 минут после начала инкубации, добавляя азид натрия вначале в первую, затем во вторую пробирку. В контрольную пробу вместо ЦП вносили 200 мкл буферного раствора. Измеряли оптическую плотность проб против контрольной при длине волны 530 нм на спектрофотометре СФ-26 («ЛОМО», г. Санкт-Петербург). Единица активности при этом определялась как количество ЦП, изменяющее оптическую плотность раствора на 0,001 в минуту.
Количественное определение проводили методом радиальной иммунодиффузии по Mancini (1965)[99]. Использовали моноспецифическую сыворотку к церулоплазмину, полученную при иммунизации кроликов высокоочищенным церулоплазмином. Анализ проводили в 1 % агаровом геле («Difco", США) в ОДМ веронал-мединаловом буфере, рН 8,6, слоем 1 мм. В качестве контроля использовали образцы высокоочищенного ЦП, (степень очистки 0,044), содержащие 50,100 и 200 мкг/мл ЦП. После внесения проб в углубления пластины термостатировали 48 часов. По истечении срока инкубации пластины геля высушивали и окрашивали раствором амидочерного 10Б. Диаметр колец осаждения измеряли с помощью линейки. Строили калибровочный график по результатам определения контрольных проб ЦП. Исходя из калибровочного графика, определяли концентрацию ЦП в опытных пробах.
Исследование комплексообразования ДКВ с ионами меди (И) каталитического центра ЦП
Взаимодействие ЦП с ДКВ в воде было изучено при различных молярных соотношениях ЦП:ДКВ при комнатной температуре в течение трех часов. В зависимости от молярного соотношения реагентов и времени протекания реакции реакционная смесь приобрела различные цвета и оттенки, но оставалась гомогенной, в течение всего времени наблюдения (таблица 3.2). При большом избытке ДКВ (ЦП:ДКВ =1:25) реакционная смесь обесцвечивалась сразу же после смешения реагентов.
Можно предположить, что изменение цвета реакционной смеси ЦП и ДКВ обусловлено взаимодействием ДКВ с ионами меди из каталитических центров ЦП.
Исследования зависимости поверхностного натяжения от концентрации ЦП Уцп=ґ(Сцп) и ДКВ уДкв=ґ(СДкв) (Рис 3.9.), а также изменения поверхностного натяжения их реакционных смесей (табл. 3.3.), свидетельствуют о потере поверхностной активности ЦП в присутствии ДКВ.
ЦП имеет до 17 центров связывания ионов меди. Полученный результат снижения поверхностной активности ЦП в водных растворах, содержащих ДКВ, возможно, является следствием реконструкции активных центров ЦП за счёт удаления ионов меди из молекулы белка-хозяина и неспецифического взаимодействия ДКВ как с ионами меди каталитических центров, так и с другими фрагментами белка. Неспецифические взаимодействия, главным образом, нековалентные, играют большую роль в формировании пространственной структуры белков в растворе. Нековалентные взаимодействия могут быть обусловлены как электростатическим притяжением разноимённо-заряженных групп, образованием водородных связей, так и ван-дер-ваальсовыми взаимодействиями. Нековалентные взаимодействия в молекуле ЦП возможны как за счет остатка гистидина, имеющего характер слабого основания (рК=6,0) так и остатков цистеина, способных приобретать отрицательный заряд на сере (рК=8,3).
У электронейтральных атомов или радикалов, неспособных к образованию водородных связей, ван-дер-ваальсовое притяжение является основным видом нековалентного взаимодействия. Такие группы, лишённые специфического сродства к молекулам воды, получили название гидрофобных. В водных растворах наличие гидрофобных групп проявляется в виде специфического эффекта, получившего название гидрофобных взаимодействий. Обычно гидрофобные взаимодействия имеют энтропийную природу и характеризуют способ оптимизации пространственной структуры белков, содержащих гидрофильные и гидрофобные фрагменты. Следовательно, анализируя данные таблицы 3.3, можно констатировать изменение пространственной структуры ЦП под действием дигидрокверцетина, в том числе гидрофобизацию фрагментов ЦП.
Более детально взаимодействие ДКВ с ЦП в водном растворе было изучено методами спектрофотометрии в видимой области.
На рисунке 3.10 приведены спектры поглощения водного раствора ЦП, ДКВ и их реакционной смеси при молярном соотношении ЦП:ДКВ=1:9,25, в области 340 - 700нм. Поскольку ДКВ в воде имеет основную полосу поглощения в области Х1Т1ах=290нм, то при выбранной концентрации ДКВ, поглощением ДКВ в анализируемой области можно пренебречь (кривая 2, рисунок 3.10). В исследуемой области для ЦП наиболее значимой является полоса поглощения видимой области с А1Т1ах=610нм, относящаяся к ионам «голубой» оксидазной меди (II) (кривая 1, рисунок 3.10). После смешения реагентов в спектре реакционной смеси (кривая 3, рисунок 3.10) наблюдается уменьшение интенсивности поглощения полосы с Атах=6 Юнм и с течением времени отмечается появление новой полосы в области 385нм - 455нм.
